水中大肠菌群的含量测定

总大肠菌群（coliform group，total coliforms） 总大肠菌群指数高，表示水源被粪便污染，则有可
1、初发酵试验：
发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置一德汉氏小套管。 乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵 乳糖产酸产气。为便于观察细菌的产酸情况，培养基内加有溴甲酚紫 作为pH指示剂，细菌产酸后，培养基即由原来的紫色变为黄色。溴甲 酚紫还可移抑制其他细菌，如对芽胞菌生长的抑制。水样接种于发酵 管内，37℃培养24h，小套管中有气体形成，并且培养基浑浊，颜色 改变，说明水中存在大肠菌群，为阳性结果。但是，有个别其他类型 的细菌在此条件下可能产气，而不属于大肠菌群；此外，产酸不产气 的发酵管，也不一定是非大肠菌群，因其在量少的情况下，也可能延 迟48h后才产气，这两种情况应视为可疑结果，因此，需要继续进行 下面的实验，才能确定是否是大肠菌群。48h后仍不产气的为阴性结 果。
水中大肠菌群的测定
一、目的要求

1、掌握测定水中大肠菌群数量的多管发酵法的原理、
操作步骤及方法；

2、掌握划线分离法； 3、了解水质评价的微生物学卫生标准，明白其应用的 重要性。

二、基本原理
是以E.coli为代表的杆状、无芽胞、需氧或兼性厌氧、革兰氏阴 能也被肠道病原菌污染。测定总大肠菌群的方法有多管发 性，经37℃、24～48h培养，发酵乳糖产酸产CO2可区别于其他肠 道菌，易于测定的一类细菌。大肠菌群主要包括埃希氏菌属、肠杆 酵法、滤膜法和各种各样的快速、简便的微生物检测仪或 菌属、克雷伯氏菌属和柠檬酸杆菌属。这类菌是温血动物肠道中的 正常菌群，常随动物的粪便污染水源，一个成年人每天排出的粪便 试剂纸（盒或卡）等。多管发酵法为我国大多数环保、卫 中含有（5-100）×1010个这类细菌，并且它们与水中存在的肠道病 生和水厂等单位所采用，多管发酵法包括：初发酵试验、 原菌呈正相关性，而病原菌在水中的浓度很低，测定手续繁琐，工 作人员还有被感染传播的危险。因此，总大肠菌群是一个合适的指 平板分离和复发酵试验。 示菌，能指示出病原菌在水中的存在，其数量大于或等于病原菌的 数量，并且比病原菌容易检出，所以检测水的细菌学卫生标准，通 常检测总大肠菌群。
3、复发酵试验：
经涂片、染色、镜检，如果是革兰氏阴性无芽胞杆 菌，则挑取该菌落的另一部分，重新接种于普通浓度的乳 糖蛋白胨发酵管中，每管可接种来自同一初发酵管的同类 型菌落1～3个，37℃培养24h，试验结果若产酸产气，即 证实有大肠菌群存在。证实有大肠菌群存在后，再根据初 发酵试验的阳性管数查表XIII-4，即得总大肠菌群。
3、复发酵试验：
将以上两次试验已证实为大肠菌群阳性的菌落，接种
复发酵，其原理与初发酵试验相同，经24h培养产酸又产
气的，最后确定为大肠菌群阳性结果。根据确定有大肠菌
群存在的初发酵管（瓶）数目，查阅专用统计表，得出总 大肠菌群指数。
三、实验器材

1、水样（自带）；

2、培养基：乳糖蛋白胨发酵管（内有倒置小套管）培养 基，3倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管（内有倒置小套管）Leabharlann Baidu养 基，伊红美蓝琼脂平板。
五、实验报告
1、填表
2、查表得出大肠菌群数。（注明水样来源） 3、根据你的实验结果，水样是否合乎饮用标准？
1、初发酵试验：（自来水检查为例）
在2个含有50mL 3倍浓缩的乳糖蛋白胨发酵烧瓶中， 各加入100mL水样。在10支含有5mL3倍浓缩的乳糖蛋白胨 发酵管中，各加入10mL水样。混匀后，37℃培养24h， 24h未产气的继续培养至48h；
2、平板分离：
将24h培养后产酸产气和48h培养后产酸产气的发酵管， 分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板上，再于37℃下培养18～ 24h，将符合下列特征菌落：深紫黑色，有金属光泽；紫黑 色，不带或略带金属光泽；淡紫红色，中心颜色较深，挑取 其中的一小部分，进行涂片，革兰氏染色，镜检；
3、溶液和试剂：革兰氏染液、无菌水等。 4、仪器和其他用品：显微镜、载玻片、无菌培养皿、灭

菌吸管、灭菌试管、镊子、烧杯、温箱等。
四、操作步骤
水样的采取 1）自来水 先将自来水龙头用火焰烧灼3min灭菌，再开 放水龙头使水流5min后，以灭菌三角烧瓶接取水样，以 待分析。 2）池水、河水或湖水 应取距水面10~15cm的深层水样， 先将灭菌的带玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过 来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好， 再从水中取出。最好立即检查，否则需放入冰箱充分冷却。
2、平板分离：
伊红美蓝琼脂平板含有伊红和美蓝染料，在此作为
指示剂，大肠菌群发酵乳糖造成酸性环境时，该两种染料
即结合成复合物，使大肠菌群产生带核心的、有金属光泽 的深紫色菌落。 初发酵管24h内产酸产气和48h产酸产气的均需在以 上平板划线分离，培养后，将符合大肠菌群菌落特征的菌 落进行革兰氏染色，只有染色为革兰氏阴性、无芽胞杆菌 的菌落，才是大肠菌群菌落。