水质总大肠菌群和粪大肠菌群(纸片快速法)检测方法确认表
水中粪大肠菌群测定方法-纸片快速法与多管发酵法的比较
水中粪大肠菌群测定方法-纸片快速法与多管发酵法的比较黄晓容【摘要】2015年10月国家环境保护部发布了行业标准《水质总大肠菌群和粪大肠菌群的测定纸片快速法》（HJ755-2015）（以下简称纸片快速法）。
之前环境监测部门一直在使用国家环境保护部于2007年3月发布的行业标准《水质粪大肠菌群的测定多管发酵法和滤膜法（试行）》（HJ/T347-2007）（以下简称多管发酵法）。
纸片快速法操作简单快速,在标准中对采样瓶的处理、样品的保存、水样的稀释接种等做出了详细的规定,而多管发酵法中没有相应规定。
本文对两个标准的异同点进行比较,提出了将这两种方法的优点应用于实际环境监测工作中。
【期刊名称】《生物技术世界》【年(卷),期】2016(000)004【总页数】2页(P33-33,35)【关键词】粪大肠菌群;多管发酵法;纸片快速法【作者】黄晓容【作者单位】重庆市黔江区环境监测中心站，重庆409000【正文语种】中文【中图分类】X8我国地表水体粪大肠菌群含量普遍较高，部分水域含量甚至超过Ⅴ类水质标准数万倍［2］。
我国粪便微生物指标的评价还处于起步阶段，水质评价多以常规理化指标为主，对微生物指标的评价有待进一步加强。
目前水中粪大肠杆菌群检测方法主要有传统的滤膜法及多管发酵法，并且已经列入环保行业标准方法（HJ/T347-2007），此两种传统方法被国内环境监测部门广泛采用，但上述方法操作时间需2-5天，步骤较为繁琐，需验证试验。
多管发酵法每100毫升水样中最低检出限为2个粪大肠菌群［1］。
冯青英等人对传统的多管发酵法进行了优化，将水样接种至乳糖蛋白胨培养液后，在44.5℃±0.5℃培养箱中培养24h后直接读取结果［3］。
多管发酵法不受浊度的影响，可以对浊度较大的污水水样进行监测。
纸片法培养时间对阳性管率有明显影响，适用于测定受粪便污染程度较轻的水体［4］。
多管发酵法和纸片快速法均为行业标准，对粪大肠菌群的检测做出了详细的规定，现就两个标准中的异同做以下探讨。
纸片快速法测定水中粪大肠菌群质量控制研究
纸片快速法测定水中粪大肠菌群质量控制研究杨虹;王志强【摘要】本文对纸片快速法测定粪大肠菌群的质量控制进行了研究.结果表明,样品间的准确度和精密度结果都在质控范围内.通过加强质量控制可使获得的数据更加具有代表性和准确性,能满足相关环境标准和环保工作的要求.【期刊名称】《现代农业科技》【年(卷),期】2019(000)003【总页数】2页(P151-152)【关键词】纸片快速法;粪大肠菌群;测定;质量控制【作者】杨虹;王志强【作者单位】天津市生态环境监测中心,天津 300191;天津市生态环境监测中心,天津 300191【正文语种】中文【中图分类】X830.5粪大肠菌群是具有一些特性并与粪便污染相关的细菌，是需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。
粪大肠菌群数量不仅代表粪便污染程度，而且关系人体健康。
它是引起呼吸道、泌尿道以及伤口等感染的源头，还会引起肠道感染、伤寒、腹泻等诸多病状。
在测定水样中的粪大肠菌群时，若要保证水质监测获得的数据具有可靠性和代表性，就必须采取科学有效的质量控制手段。
在环境监测过程中要针对不同环节的特点采用不同控制方法，以实现对监测过程全面的质量控制，既可提高检测效率，又能更好地适应环境监测的需要。
大肠菌群利用纸片上的营养迅速生长繁殖，进一步分解乳糖产生酸，酸又能使溴甲酚紫指示剂由天蓝色转变成黄色，在黄色区域生长的大肠菌群所产生的脱氢酶使纸片上的基质分解脱氢，脱下氢转给受体氯化三苯基四氯唑（TTC），此时TTC接受氢之后，由无色变成还原后不溶于水的红色物质，即三苯甲胺。
通过以上显示剂的颜色反应就能判断出产酸产气的情况，从而判断纸片上是否有大肠菌群的存在，然后通过查MPN表即可明确相应大肠菌群的浓度值[1]。
1 材料与方法1.1 主要仪器及试剂主要试剂有水质大肠菌群测试纸片、无菌水、硫代硫酸钠溶液、乙二胺四乙酸二钠溶液[1]。
主要仪器和设备有恒温培养箱、高压蒸汽灭菌器、冰箱、试管、移液管、采样瓶。
多管发酵法与纸片法测定水中总大肠菌群和粪大肠菌群
多管发酵法与纸片法测定水中总大肠菌群和粪大肠菌群李恒，等多管发酵法与纸片法测定水中总大肠菌群和粪大肠菌群Determination of Total Coliform Group and Fecal Coliform Group in Water by Multi-tube Fermentation and Paper Disk Method李恒张志君王光惠陈泓+（湖南省衡阳生态环境监测中心，湖南衡阳421000）［摘要］通过多管发酵法和纸片快速法对实际水样的总大肠菌群和粪大肠菌群进行实验比对，结果表明，两种方法的结果相差不大，但纸片快速法比多管发酵法操作简便、检测时间短，更适用于环境监测日常分析％［关键词］多管发酵法；纸片快速法；总大肠菌群;粪大肠菌群［中图分类号］X833［文献标识码］%引言粪大肠菌群是能在44.5!温度下生长并发酵乳糖产酸产气的耐热的大肠菌群，属于总大肠菌群的一部分，主要来自粪便。
水中粪大肠菌群和总大肠菌群的检验是研究水体污染和环境卫生的重要指标，具有广泛的卫生学意义。
目前，国内已颁布的标准主要是多管发酵法和纸片快速法［1+4］。
多管发酵法操作繁琐且时间过长（48~72h$,难以满足当前环境监测工作的需求［5］%纸片快速法不仅培养时间短（18~ 24h）,且无需提前准备培养基，可以避免培养基杂菌入侵和时间过长等不足。
为更精确、快速、可靠地进行监测，本文用多管发酵法和纸片快速法同步进行对比实验，并对两种分析方法的实验结果进行了比较分析。
1材料与仪器1.1材料水质粪大肠菌群、总大肠菌群快速检验纸片（广东达元绿洲食品安全科技股份有限公司）；粪大肠菌群、总大肠菌群、培养基、革兰氏染色液％1.2试剂EC培养基：胰豚20g,乳糖5g,胆盐三号1.5g，磷酸氢二钾4g,磷酸二氢钾1.5g,氯化钠5g%将上述成分加热溶于1000ml水中，灭菌后的pH应在6.9左右。
该培养基在低温无菌条件下可以保存一个月％无菌水：将纯水在115!高压蒸汽灭菌20min,备用。
粪大肠菌群测定的多管发酵法与纸片快速法比对分析
1引言
粪大肠菌群是总大肠菌群中的一部分，主要来自粪 便，在44.5 °C温度下能生长并发酵乳糖产酸产气切。 六盘水生态环境监测中心一直采用多管发酵法进行水 质中粪大肠菌群的测定,此方法精度高 ，但操做时间长, 步骤较为繁琐，需验证实验⑷，如果发酵管中存在其他 种类的产气菌，会致使检测结果偏离⑷。本次实验是对 多管发酵法与纸片快速法进行实验比对,对相同的实验 样品分别用此两种方法进行检测和结果评价 ，比较两种 方法的有效性和可比性。
<20 3.3X102
<20 1. 1X102
40 2. 4X103
2.4X103 2. 4X103
1.4X103 2. 1X101 1.6X104 1.4X104
表2粪大肠菌群实验结果判定
多管发酵法
95%置信限值
下限
上限
浓度 /(MPN/L)
/ 1. 1X102
/ 9.3X102
<20 2. 3X102
表3 粪大肠菌群平行双样实验结果判定
多管发酵法
95%置信限值
下限
上限
浓度 /(MPN/L)
纸片快速法
95%置信限值
下限
上限
1. 1X102
9.3X102
2. 3X102
70
7. 0X102
70 3. 7X102
7.0X102 3.4X103
1. 3X102 7. 9X102
30 2.5X102
3. 1X102 1. 9X103
2实验概况
2.1材料与方法 多管发酵法:乳糖蛋白培养基、EC肉汤培养基。 纸片快速法:BD105 I水质(粪)大肠菌群快速检验
纸片、BD105 H水质(粪)大肠菌群快速检验纸片。 2.2仪器和设备
质量管理(现场监测)选择题
质量管理持证上岗试题 (现场监测)选择题：1.《环境监测质量管理技术导则》HJ 630-2011要求，样品采集应根据监测方案所确定的采样点位、污染物项目、频次、时间和方法进行采样。
必要时制订采样计划，内容包括： _________ 交通工具以及安全保障等。
( )A. 采样时间和路线B. 采样时间和路线C. 采样人员和分工D. 采样器材正确答案：A、B、C、D2.《地表水和污水监测技术规范》HJ/T 91-2002要求，对流域或水系要设立_______等断面。
( )A. 背景断面B. 控制断面C. 削减断面D. 入海口断面正确答案：A、B、D3.《地表水和污水监测技术规范》HJ/T 91-2002要求，根据水体功能区设置控制监测断面，同一水体功能区至少要设置__ 个监测断面。
( )A.1B.2C.3D.4正确答案：A4. 《地表水和污水监测技术规范》HJ/T 91-2002要求，采样时， ______、DO、BOD5、有机物、余氯等有特殊要求的项目，不能用采样水荡洗采样器与水样容器。
( )A.细菌总数B.大肠菌群C. 油类D.挥发酚正确答案：A、B、C5. 《地表水和污水监测技术规范》HJ/T 91-2002要求，采样时，除一些有特殊要求的项目外，要先用采样水荡洗采样器与水样容器_____次，然后再将水样采入容器中，并按要求立即加入相应的固定剂，贴好标签。
( )A. 1～2B. 2～3C.3～4D. 4～5正确答案：B6.《水污染物排放总量监测技术规范》HJ/T 92-2002要求，废水采样时需采集不少于_______的现场平行样。
( )A. 5％B.10％C. 15％D.20％正确答案：B7.《水污染物排放总量监测技术规范》HJ/T 92-2002要求，测流时段内测得流量应与水量衡算结果误差不得大于_____。
( )A. 10％B.20％C. 30％D. 40％正确答案：A8.《水污染物排放总量监测技术规范》HJ/T 92-2002要求，因工业废水成分复杂，其中的强酸或强碱性物质对流量计或堰板有一定腐蚀作用，______对流量测量也会产生影响，为此必须加强流量计量装置的维护和保养。
水质 总大肠菌群和粪大肠菌群的测定 纸片快速法 征求意见稿
水质总大肠菌群和粪大肠菌群的测定纸片快速法征求意见稿
为了保证水质安全，控制疫情传播，本文介绍一种快速测定水质中总大肠菌群和粪大肠菌群的纸片快速法。
一、原理
本方法采用四氯化钴染色，将水样中的大肠杆菌转化为深蓝色紫色的水溶液中的杆菌，然后用过滤纸吸取样品中大肠杆菌杆菌的胞外成分，与专门的涂层结合，形成深紫色的杆菌珠，并进行定量比色分析。
二、材料和方法
1. 带有蓝色涂层的滤纸一支
2. 四氯化钴溶液
3. 水样
方法：
1. 取一片纸片，将其放入含有四氯化钴溶液的水样中，搅拌均匀。
等待5分钟。
2. 用净水彻底清洗纸片，并在滤纸周围波动，使大肠菌群在水中更容易分散。
3. 在处理好的样品中取一滴，用滤纸吸取。
4. 将纸片放入合适的容器中(如管子或托盘)，等待5分钟，直到纸片上形成紫色的结晶。
5. 用比色板或显微镜进行分析测量。
三、结果
根据纸片上杆菌珠的形成特征，可以快速测定水样中的大肠杆菌群和粪大肠菌群含量。
四、注意事项
1. 纸片处理过程中要严格保持无菌，避免外源菌污染。
2. 样品选择要具有代表性，尽量选取水流清澈，色泽透明，入口甜润的水源，避免河流污染或废水回流。
3. 纸片使用后应当严格清洗，避免杆菌珠继续生长。
4. 此方法仅适用于快速初步筛查水质安全，不适用于作为严格的水质监测标准。
饮用水大肠菌群检验纸片(五管法)
饮用水大肠菌群检验纸片(五管法)
产品编号： BD114
产品规格： 1份/包
产品用途：饮用水中总大肠菌群的快速检验
产品说明
1、适用范围
本产品适用于出厂成品水或直接饮用的矿泉水和纯净水中总大肠菌群的快速检验。
2、方法原理
将乳糖、显色剂和选择性培养基加载在纸片上，经培养后能够在纸片上生长并发酵乳糖产酸的即为大肠菌群阳性，记录每个稀释度大肠菌群阳性纸片数，根据大肠菌群MPN表查出相应的大肠菌群数。
执行标准：生活饮用水卫生标准（GB 5749—2006）。
3、操作方法
3.1、用灭菌吸管吸取10mL水样加入装有大纸片的塑料薄膜袋中，均匀涂布，共做5个重复；
3.2、将接种好的纸片放于培养箱中，培养温度为36℃±1℃，培养15～24h 观察结果。
4、结果判读
4.1、若纸片变黄或在黄色背景上呈现红色斑点为大肠菌群阳性，纸片保持紫蓝色不变或在紫蓝色背景上呈现红色斑点但周围没有黄晕均为大肠菌群阴性。
4.2、根据每个稀释度的阳性反应纸片数，查MPN表可得出水样中总大肠菌群的MPN值（见表1）。
如所有纸片均为阴性时，可报告总大肠菌群未检出。
4.3、对于阳性纸片，应进一步检验大肠埃希氏菌或耐热大肠菌群。
用接种环在阳性菌斑处沾取少许带菌滤纸，用3mL灭菌生理盐水混匀，接种到大肠埃希氏菌耐热大肠菌群测试片上，进行培养和检验。
表1 用5份10mL水样时各种阳性和阴性结果
组合时的最可能数（MPN）及95%可信限。
方法验证水质的粪大肠菌群
方法验证报告测试方法：HJ 347.2-2018测试项目：水质粪大肠菌群编写：日期：审核：日期：批准：日期：水质粪大肠菌群的方法验证1.目的确认所采用的方法适合于在本实验室进行对水质的粪大肠菌群的测定，照此方法检测和检验条件进行水样的粪大肠菌群检测，能保证检验结果的准确、可靠。
2.原理和范围2.1原理将样品加入含乳糖蛋白胨培养基的试管中，37℃初发酵富集培养，大肠菌群在培养基中生长繁殖分解乳糖产酸产气，产生的酸使溴甲酚紫指示剂由紫色变为黄色，产生的气体进入倒管中，指示产气。
44℃复发酵培养，培养基中的胆盐三号可抑制革兰氏阳性菌的生长，最后产气的细菌确定为是粪大肠菌群。
通过查MPN表，得出粪大肠菌群浓度值。
2.2范围本法适用于地表水、地下水、生活污水和工业废水中粪大肠菌群的测定。
3.主要仪器3.1 净化工作台。
3.2 立式高压蒸汽灭菌器。
3.3恒温恒湿培养箱。
3.4电热恒温鼓风干燥箱。
3.5电子天平。
3.6酒精灯、试管架、试管（带塞子）、平皿、小倒管、三角烧瓶（带塞子）、刻度吸管、采样瓶、接种环。
4.主要试剂乳糖蛋白胨培养液、EC培养液。
5.检验步骤5.1样品稀释与接种5.1.1 15管法将样品充分混匀后，在5支装有已灭菌5ml三倍乳糖蛋白胨培养液的大试管中（内有小倒管），按无菌操作要求各加入样品10ml，在5支装有已灭菌的10ml单倍乳糖蛋白胨培养液中（内有小倒管），按无菌操作要求各加入样品1ml，在5支装有已灭菌的10ml单倍乳糖蛋白胨培养液中（内有小倒管），按无菌操作要求各加入样品0.1ml。
对于受到污染的样品，先将样品稀释后再按照上述操作接种，以生活污水为例，先将样品稀释104倍，然后按照上述操作步骤分别接种10ml 、1ml 、0.1ml 。
当样品接种量小于1ml 时，应将样品制成稀释样品后使用。
按无菌操作要求方式吸取10ml 充分混匀的样品，注入盛有90ml 无菌水的三角烧瓶中，混匀成1：10稀释样品。
三种监测地表水中粪大肠菌群标准方法的比较
I节能环保LOW CARBON WORLD2021/6三种监测地表水中粪大肠菌群标准方法的比较唐微微，罗娅敏，陈瀚,赵志友(四川省成都生态环境监测中心站，四川成都610066)【摘要】多管发酵法、纸片法和酶底物法是目前测定地表水中粪大肠菌群的常用标准方法，通过三种方法对粪大肠菌群标准物质和实际地表水样进行分析检测，结果表明：多管发酵法、纸片法和酶底物法用于粪大肠菌群的检测结果具有一致性；通过三种方法优缺点的对比，多管法成本低适用于常规检测，纸片法高效方便更适用于大批量快速检测，酶底物法操作简单，不受场地限制可直接现场检测,更适用于应急现场监测遥【关键词】多管发酵法；纸片法；酶底物法；粪大肠菌群;地表水【中图分类号】X132【文献标识码】A【文章编号】2095-2066(2021)06-0034-020前言粪大肠菌群又称耐热大肠菌群，是在44.5益能生长并发酵乳酸产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽抱杆菌⑴。
环境地表水中的粪大肠菌群主要来自粪便的污染，因此通过测定水中粪大肠菌群的含量，可间接得出水体受粪便污染的情况囚,是当前国内外环境监测部门主要监测项目之一，是评价水体污染程度和环境卫生的重要指标，在《地表水环境质量(GB3838—2002)》中，规定I、域、芋、郁及吁类水粪大肠菌群的含量依次臆200、200〜2000、2000〜10000、10000~20000及20000~40000个/L,我国地表水体粪大肠菌群含量普遍较高，部分水域含量甚至超过吁类水质标准。
多管发酵法叫纸片法⑷和酶底物法间是目前国内测定地表水中粪大肠菌群常用的标准方法。
多管发酵法早在1985年就列入《生活饮用水标准检验方法(GB5750-85)》，并于2018年发布修订版，是粪大肠菌群测定的经典方法,它作为《水和废水监测分析方法(第四版)》中的推荐方法向，美国公共卫生协会(APHA)出版的《水和废水标准检验方法(20版)》中方法9221E也采用的是多管发酵法；纸片法在西方发达国家运用较少，主要在一些发展中国家使用，环保部在2015年发布了纸片法的标准方法，它作为《水和废水监测分析方法(第四版)》中的推荐方法(C类方法)叫酶底物法是一种新型酶技术检测方法，已在美、日、韩和欧洲许多国家使用孔2003年从美国引入我国，环保部在2018年发布了酶底物法的标准方法。
水-中-细-菌-总-数及大肠菌群的检测方案
水中细菌总数的检测及大肠菌群的测定一、实验的目的要求1、学习并掌握水的细菌学检测方法2、了解水质状况与细菌数量在饮用水检测中的重要性。
二、实验原理细菌总数是指1ml水样在营养琼脂培养基中，于37℃经24h培养后，所生长的细菌菌落的总数。
细菌总数是评价水质污染程度的主要卫生指标。
我国现行的生活饮用水标准检验方法GB5750—85规定水样中细菌总数测定是1ml水样在普通营养琼脂培养基中37℃经24小时培养所生长的细菌菌落的总数。
所测定的细菌总数增多说明水被生活废弃物污染，但不能说明污染的来源。
因此必须结合总大肠菌群数来判断水污染的来源和安全程度。
本实验应用平板计数技术测定水中细菌总数。
由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，因此，以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中细菌总数仅是一种近似值。
目前一般是采用普通牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。
平板菌落计数法的优点：能测出样品中的活菌数。
此法常用于某些成品和生物制品检定以及食品、水源的污染程度的检定等。
缺点：手续较繁，而且测定值常受各种因素的影响。
生活饮用水细菌卫生标准我国饮用水卫生标准：≤3个大肠菌群/1L饮水，≤100个细菌总数/1ml饮水三、实验仪器和材料(三)实验器材(1) 菌落总数的测定：1)培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，无菌生理盐水。
2)器材：灭菌三角瓶，灭菌的具塞三角瓶，灭菌平皿，灭菌吸管，灭菌试管等。
(2)大肠菌群的测定；1)培养基：伊红美蓝琼脂培养基：蛋白胨10g，乳糖10g， K2HP042g， 2％伊红水溶液20Ml，0.65％美蓝水溶液lOmL，琼脂17g，水1000mL，pH7.1。
制法：将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶于水中，校正pH后分装．121℃灭菌15min备用。
临用时加入乳糖并熔化琼脂，冷至50-55℃，加入伊红和美蓝溶液，摇匀，倾注平板。
水质粪大肠菌群检验纸片的详细资料
水质粪大肠菌群检验纸片的详细资料BD105Ⅰ水质（粪）大肠菌群快速检验纸片1份/包适用于湖水、水源水中大肠菌群的快速检测。
BD105Ⅱ水质（粪）大肠菌群快速检验纸片1份/包适用于河水、生活用水、医疗机构处理后排污水、禽畜养殖业等排放废水中大肠菌群的快速检测。
分BD105Ⅰ和BD105Ⅱ两个型号，请注意选择型号。
1、适用范围水质（粪）大肠菌群的测定纸片快速法本标准适用于地表水、生活污水、医疗机构及禽畜养殖业等其他行业排放的废水中（粪）大肠菌群的快速筛查。
本方法的检出限为20MPN/L。
2、规范性引用文件本标准内容引用了下列文件或其中的条款。
凡是不注明日期的引用文件，其有效版本适用于本标准。
HJ/T91地表水和污水监测技术规范3、术语和定义下列术语和定义适用于本标准。
3.1总大肠菌群（total coliforms）在37℃培养，24h内能发酵乳糖酸产气的需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
3.2 粪大肠菌群（fecal coliforms）44.5℃培养，24h内能发酵乳糖产酸气的总大肠菌群，属粪行来源，称为粪大肠菌群。
4、方法原理将一定量的乳糖、指示剂（溴甲酚紫和2，3, 5-氯化三苯基四氮唑即TTC）以及营养成分等吸附于一定面积的无菌滤纸上，当细菌生长繁殖时，产酸使PH值降低，溴甲酚紫指示剂由紫色变黄色。
同时，产气过程相应的脱氢酶在适宜的PH范围内，催化底物脱氢还原TTC 形成红色的不溶性三苯甲臜（TTF），即可在产酸后的黄色背景下显示出红色斑点（或红晕）。
通过上述指示剂的颜色变化就可对是否产酸产气作出判断，从而确定是否有（粪）大肠菌群存在，再通过查MPN表就可得出相应（粪）大肠菌群的浓度值。
5、试剂和材料除非另有说明，分析时均使用符合国家标准的分析纯化学试剂。
5.1市售水质总大肠菌群、粪大肠菌群测试片：10ml水样量纸片按附录A的方法进行质量鉴定，达到要求后方可使用。
5.2无菌水用新制备的去离子水或蒸馏水，按无菌操作要求，121℃高压蒸汽灭菌20min，备用。
总大肠菌群说明
3 仪器
3.1 显微镜
3.2 革兰氏染色用有关器材。
3.3 高压蒸汽灭菌器。
3.4 干热灭菌箱。
3.5 恒温箱。
3.6 冰箱。
3.7 放大镜。
3.8 试管、平皿（直径 9cm）、刻度吸管等，置于干热灭菌箱中 160℃灭菌 2h。
4 培养基
4.1 乳糖蛋白胨培养液
4.1.1 成分
蛋白胨
10g
牛肉膏
3g
于另一个灭菌空试管内，加灭菌水少许使其溶解后，置于沸水浴中煮沸 10min 以灭菌。
用灭菌吸管吸取已灭菌的严硫酸钠溶液，滴加于碱性品红乙醇溶液内至深红色褪成淡粉
红色为止。将此亚硫酸钠与碱性品红的混合液全部加入已融化的储备培养基内，并充分混匀
（防止产生气泡），立即将此种培养基适量倾入于已灭菌的空平皿内，待其冷却凝固后置冰
每 100ml 水样中总大肠 菌群近似数
13 17 21 25 30 36 17 21 26 31 36 42 22 26 32 38 44 50 49 70 94 120 150 180 79 110 140 180 210 250
接种量，ml 10 1 0.1 4 50 4 51 4 52 4 53 4 54 4 55 5 00 5 01 5 02 5 03 5 04 5 05 5 10 5 11 5 12 5 13 5 14 5 15 5 50 5 51 5 52 5 53 5 54 5 55 5 40 5 41 5 42 5 43 5 44 5 45
1ml 水样，于各装有 10ml 乳糖蛋白胨培养液（4.1）的 5 个试管中（内有倒管），各加入 1ml1：
10 稀释水样。共计 15 管，三个稀释度。以后的检验步骤同上述生活饮用水的检验方法。
纸片法快速检测水中总大肠菌群方法探讨
纸片法快速检测水中总大肠菌群方法探讨目的：研究纸片法快速检测水中总大肠菌群方法。
方法：将采集到的水样，按GB/T5750.12-2006《生活饮用水标准检验方法微生物指标》中多管发酵法和水中总大肠菌群纸片法同时测定水中总大肠菌群。
结果：总大肠菌群纸片法快速检测结果与国标多管发酵法测定结果比较无显著性差异，两种方法具有较好的相关性，相关系数为0.9670。
结论：总大肠菌群纸片法与国标法相比无显著性差异，具有一定的可行性，值得推广。
标签：总大肠菌群；纸片法；快速检测；多管发酵法Abstract：objective: to study the paper method of rapid detection method of total coliform bacteria in water. Methods: water samples were collected, according to GB/T5750.12-2006 “standard of drinking water test method of microbial indicators of multi-tube fermentation and total coliform bacteria in water paper method of determination of total coliform bacteria in water at the same time. Results: the total coliforms paper method Rapid test results compared with the national standard determination of multi-tube fermentation, there was no significant difference of two methods has good correlation, the correlation coefficient of 0.9670. Conclusion: the total coliforms paper method to there was no significant difference compared with national standard method, it has certain feasibility, is worth promoting.Key words：total coliform bacteria; Pieces of paper; Rapid detection; Multiple tube fermentation总大肠菌群是评价水中粪便污染程度的一个重要指标，目前国家标准方法GB/T5750.12-2006中（1）多管发酵法（2）滤膜法（3）酶底物法，大多数主要采用多管发酵方法，其具有准确性好、可靠性高、灵敏性好等特点，但是需要做大量的实验准备工作且需要较长的时间才能获得检测结果，试验操作繁琐，需要进行初发酵，平板分离培养，染色镜检和复发酵等试验步骤，不适用于对样品进行快速检测。
几种粪大肠菌群检测方法的比较
水样滤完后，再抽气约 5s，关闭滤器阀门。取 下滤器，用灭菌镊子夹取带菌滤膜边缘部分移放 到 M – FC 培养基上，滤膜截留细菌面朝上，滤膜 应与培养 基 完 全 贴 紧。 盖 好 平 皿，将 平 皿 倒 放 到 44. 5℃ ± 0. 5℃ 隔水式培养箱中，培养 24 ± 2 h。 1. 2. 2. 3 计数和报告结果
和产气的发酵管表明试验阳性。如在倒管内产气
不明显，可轻拍试管，有小气泡升起的为阳性。
1. 1. 3 复发酵实验
轻微振荡初 发 酵 试 验 阳 性 结 果 的 发 酵 管，用
3 mm 接种环或灭菌棒将培养物转接到 EC 培养
液中。在 44. 5℃ ± 0. 5℃ 水浴下培养 24 ± 2 h。培
养后立即观察。发酵管产气表明确信试验阳性。
随着分子生 物 学 的 发 展 及 原 理 的 利 用，微 生 物的检测方法发生了质的变化，如仍然处于研究 阶段，技术的复杂性和检测费用较高的聚合酶链 式技术 （ polymerase chain reaction，PCR）〔5〕、荧 光 原位 杂 交 技 术 （ fluorescent in situ hybridization， FISH）〔6〕、自动化检测方法（ Automatization） 、利用 抗体与抗原特异性结合免疫荧光法〔5〕等目前还不 能广泛用于粪大肠菌群的日常检测。因此要实现 实际操作应用与普及还需要经历一个长期的反复
1. 1. 4 计算和报告结果
根据不同的接种量的发酵管所表现阳性结果
HJ755-2015水质总大肠菌群和粪大肠菌群的测定快速纸片法方法验证报告
方法验证报告项目名称：总大肠菌群和粪大肠菌群的测定方法名称：水质总大肠菌群和粪大肠菌群的测定快速纸片法报告编写人：参加人员：审核人员：报告日期：1 实验室基本情况1.1 人员情况表1参加验证的人员情况登记表1.2 检测仪器/设备情况表2使用仪器情况登记表1.3 检测用试剂情况表3使用试剂登记表1.4 环境设施和条件情况实验室具有检定合格的温湿度计，环境可以控制在温度18⁓26℃，湿度45%⁓65%的要求范围内，满足检测环境条件，实验室人员每天对环境条件进行监控。
另外实验室配备了洗眼器、喷淋设施、护目镜、灭火器等的安全防护措施，符合实验室安全内务的要求。
2 实验室检测技术能力2.1方法适用范围本方法适用于地表水、废水中总大肠菌群和粪大肠菌群的快速测定。
2.2 检测步骤2.2.1. 接种水样的准备当每张纸片接种水样量为10ml或1ml 时，充分混匀水样备用即可。
当每张纸片接种水样量小于1ml时，水样应制成稀释样品后使用。
接种量为0.1ml、0.01ml 时，分别制成1：10稀释样品、1：100稀释样品。
其他接种量的稀释样品依次类推。
1：10稀释样品的稀释方法为：吸取1ml水样，注入盛有9ml无菌水的试管中，混匀，其他稀释度的样品同法制作。
2.2.2水样接种2.2.2.1接种量每个样品按三个10倍递减的不同接种量接种，每个接种量分别接种5张纸片，共接种15张纸片.根据水样的污染程度确定接种量，应尽可能使5个接种量最大的纸片为阳性，5个接种量最小的纸片为阴性，避免出现所有3个不同接种量共15张纸片全部阳性或全部阴性。
清洁水样的参考接种量分别为10ml、1ml、0.1ml。
2.2.2.2接种清洁水样，接种水样总量为55.5ml,10ml水样量纸片5张，每张接种水样10ml，1ml水样量纸片10张，其中5张各接种水样1ml,另5张各接种1：10的稀释水样1ml。
受污染水样，接种3个不同稀释度的1ml稀释水样各5张。
水质粪大肠菌群的测定
将10g蛋白胨、3g牛肉寖膏、5g乳糖和5g氯化钠加热溶解于1000mL蒸馏水 中，调节溶液pH为7.2—7.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL，充分混 匀，分装于含有倒置的小玻璃管的试管中，于115℃高压灭菌器中灭菌 20min，贮存于冷暗处备用。 (此溶液用于检验大肠菌群)
1.6%溴甲酚紫乙醇溶液：1.6g溴甲酚紫用无水乙醇定容到100mL。
3.从龙头装置采集样品时,不要选用漏水龙头，采水前将龙头打开至最大, 放水3~5min,然后将龙头关闭，用火焰灼烧约3min灭菌或用70%~ 75%的酒精 对龙头进行消毒，开足龙头，再放水1min，以充分除去水管中的滯留杂质 。 采样时控制水流速度，小心接入瓶内。
4. 采集地表水、废水样品及一定深度的样品时，也可使用灭菌过的专用 采样装置采样。在同一采样点进行分层采样时，应自上而下进行，以 免不同层次的搅扰。
无论是哪一种方法，都是利用其可在高温生长并发酵乳糖 产酸、产气的特点，所以实验过程最终要的环节是严格地 控制好温度。
(1) 初发酵
将样品加入
培养基的试管中，37℃初发酵富集培养，大肠
菌群在培养基中生长繁殖分解乳糖产酸、产气，产生的酸使溴甲酚紫指
示剂由紫色变为黄色，产生的气体进入倒管中，指示产气。 (
③耐热，在44-44.5℃的高温条件下仍可生长繁殖。 (耐热大肠菌群)
粪大肠菌群是大肠菌群的一种，是生长于人和温血动物肠道中的一组 肠道细菌，随粪便排出体外，约占粪便干重的1/3以上，故称为粪大 肠菌群。
受粪便污染的水、食品、化妆品和土壤等物质均含有大量的这类菌群。 若检出粪大肠菌群即表明已被粪便污染。
1.
将水样充分混匀后，根据水样污染的程度确定水样接种量。
每个样品至少用
水质总大肠菌群和粪大肠菌群（纸片快速法）检测方法确认表
检测结果的判断
1.结果判读： （1） 制片上出现红斑或红晕且周围变黄，为阳性。 （2） 纸片全片变黄，无红斑或红晕，为阳性。 （3） 纸片部分变黄，无红斑或红晕，为阴性。 （4） 纸片的紫色背景上出现红斑或红晕，而周围不变黄，为阴性。 （5） 纸片无变化，为阴性。 2.结果计算： 根据不同接种量的阳性纸片数量，查MPN表得到MPN值，按公式换算并报告 1L水样中总大肠菌群或粪大肠菌群数：
附件说明
表1
运行说明
经验证该方法符合我实验室使用。
审批意见
表1
技术经理： 日 期：
总经理： 日 期：
C=100*M/Q 式中： C—水样总大肠菌群或粪大肠菌群浓度（MPN/L） M—查MPN表得到的MPN值(MPN/100ml) Q—实际水样最大接种量（ml） 100—为10*10ml，其中，10将MPN值的单位MPN/100ml转换为MPN/L，10ml 为MPN表中最大接种量。 3.结果表示： 测定结果保留二位有效数字，大于等于100时以科学计数法表示，结果的单 位为MPN/L。平均值以几何平均计算。
方法名称 项目负责人员水质总大肠菌来自和粪大肠菌群的测定 （纸片快速法）
申请人
制定原因
验证检测方法符合实验 室要求、确保数据准确性 与有效性
方法适用范围 适用于地表水、地下水及废水中的总大肠菌群和粪大肠菌群的快速测定。
方法来源
HJ 755-2015《水质 总大肠菌群和粪大肠菌群的测定纸片快速法》
仪器、试剂和环 境的要求
1.仪器和设备 1.1 高压蒸汽灭菌器 1.2 培养箱 1.3 冰箱 1.4 采样瓶 1.5 试管 1.6 水质总大肠菌群和粪大肠菌群测试纸片 2.试剂：2.1 硫代硫酸钠 2.2 乙二胺四乙酸二钠 采样和测试过程中，所用到的玻璃器皿需灭菌后方可使用。
水质总大肠菌群和粪大肠菌群（纸片快速法）检测方法确认表
水质总大肠菌群和粪大肠菌群（纸片快速法）检测方法确认表水质总大肠菌群和粪大肠菌群(纸片快速法)检测方法确认表案场各岗位服务流程销售大厅服务岗：1、销售大厅服务岗岗位职责：1)为来访客户提供全程的休息区域及饮品;2)保持销售区域台面整洁;3)及时补足销售大厅物资,如糖果或杂志等;4)收集客户意见、建议及现场问题点；2、销售大厅服务岗工作及服务流程阶段工作及服务流程班前阶段1）自检仪容仪表以饱满的精神面貌进入工作区域2）检查使用工具及销售大厅物资情况，异常情况及时登记并报告上级。
班中工作程序服务流程行为规范迎接指引递阅资料上饮品（糕点）添加茶水工作要求1）眼神关注客人，当客人距3米距离时，应主动跨出自己的位置迎宾，然后侯客迎询问客户送客户注意事项15度鞠躬微笑问候：“您好！欢迎光临！”2）在客人前方1-2米距离领位，指引请客人向休息区，在客人入座后问客人对座位是否满意：“您好！请问坐这儿可以吗？”得到同意后为客人拉椅入座“好的，请入座！”3）若客人无置业顾问陪同，可询问：请问您有专属的置业顾问吗？，为客人取阅项目资料，并礼貌的告知请客人稍等，置业顾问会很快过来介绍，同时请置业顾问关注该客人；4）问候的起始语应为“先生-小姐-女士早上好，这里是XX销售中心，这边请”5）问候时间段为8:30-11:30 早上好11:30-14:30 中午好 14:30-18:00下午好6）关注客人物品，如物品较多，则主动询问是否需要帮助（如拾到物品须两名人员在场方能打开，提示客人注意贵重物品）；7）在满座位的情况下，须先向客人致歉，在请其到沙盘区进行观摩稍作等待；阶段工作及服务流程班中工作程序工作要求注意事项饮料（糕点服务）1）在所有饮料（糕点）服务中必须使用托盘；2）所有饮料服务均已“对不起，打扰一下，请问您需要什么饮品”为起始；3）服务方向：从客人的右面服务；4）当客人的饮料杯中只剩三分之一时，必须询问客人是否需要再添一杯，在二次服务中特别注意瓶口绝对不可以与客人使用的杯子接触；5）在客人再次需要饮料时必须更换杯子；下班程序1）检查使用的工具及销售案场物资情况，异常情况及时记录并报告上级领导；2）填写物资领用申请表并整理客户意见；3）参加班后总结会；4）积极配合销售人员的接待工作，如果下班时间已经到，必须待客人离开后下班；1.3.3.3吧台服务岗1.3.3.3.1吧台服务岗岗位职责1）为来访的客人提供全程的休息及饮品服务；2）保持吧台区域的整洁；3)饮品使用的器皿必须消毒；4）及时补充吧台物资；5）收集客户意见、建议及问题点；1.3.3.3.2吧台服务岗工作及流程阶段工作及服务流程班前阶段1）自检仪容仪表以饱满的精神面貌进入工作区域2）检查使用工具及销售大厅物资情况，异常情况及时登记并报告上级。
医疗机构污水和污泥中粪大肠菌群的检验方法
医疗机构污水和污泥中粪大肠菌群的检验方法A1 仪器和设备高压蒸汽灭菌器。
干燥灭菌箱。
培养箱：37℃。
恒温水浴箱。
电炉。
天平。
灭菌平皿。
灭菌刻度吸管。
酒精灯A2 培养基和试剂乳糖胆盐培养液A2.1.1成分蛋白胨20g猪胆盐（或牛、羊胆盐）5g乳糖5g％溴甲酚紫水溶液蒸馏水1000mLA2.1.2 制法将蛋白胨、猪胆盐及乳糖溶解于1000mL蒸馏水中，调整pH到，加入指示剂，充分混匀，分装于内有倒管的试管中。
115℃下灭菌20min。
贮存于冷暗处备用。
三倍浓度乳糖胆盐培养液A2.2.1成分蛋白胨60g猪胆盐（或牛、羊胆盐）15g乳糖15g％溴甲酚紫水溶液蒸馏水1000mLA2.2.2 制法制法同附录A2.1.2。
伊红美兰培养基（EMB培养基）A2.3.1 成分蛋白胨10g乳糖10g磷酸氢二钾2g琼脂20g2％伊红水溶液20mL％美蓝水溶液13mL蒸馏水1000mLA2.3.2 制法将琼脂加到900mL蒸馏水中，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾和蛋白胨，混匀使溶解，再加入蒸馏水补足至1000mL，调整pH至～。
趁热用脱脂棉和砂布过滤，再加入乳糖，混匀，定量分装于烧瓶内，115℃灭菌20min。
作为储备培养基贮存于冷暗处备用。
临用时，加热融化储备培养基，待冷至60℃左右，根据烧瓶内培养基的容量，加入一定量的已灭菌的2％伊红水溶液和％美蓝水溶液，充分摇匀（防止产生气泡）。
倾注平皿备用。
乳糖蛋白胨培养液A2.4.1成分蛋白胨10g牛肉膏3g乳糖5g氯化钠5g％溴甲酚紫乙醇溶液1mL蒸馏水1000mLA2.4.2 制法将蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化钠加热溶解于1000mL蒸馏水中，调整pH到～，加入％溴甲酚紫乙醇溶液1mL，充分混匀，分装于内有倒管的试管中。
115℃下灭菌20min。
贮存于冷暗处备用。
革兰氏染色液A2.5.1 结晶紫染色液结晶紫1g95％乙醇溶液20mL1％草酸铵水溶液1000mL将结晶紫溶于乙醇中，然后与草酸铵水溶液混合。
环境水样品中大肠杆菌及粪(耐热)大肠杆菌的检测
环境水样品中大肠杆菌及粪（耐热）大肠杆菌的检测【摘要】本次实验采用多管发酵法检测环境水样中大肠杆菌及粪大肠杆菌（环境水样取用水果湖样点水样）。
本次试验（多管发酵法）的主要步骤为：将待测水样稀释三个（实际上做了四个）适宜稀释倍数梯度，接种在乳糖蛋白胨培养液中，37℃下培养24h，观测结果。
产酸产气为阳性结果，不产酸产气为阴性。
将阳性管中菌液取定量接种于EC肉汤培养液中，45℃下培养24h，观测结果。
产酸并产气为阳性结果，不产酸不产气为阴性。
将阳性管中菌及之前37℃管中菌接种于伊红美蓝培养基上，于对应温度下培养24h，镜检。
根据菌落形态和颜色，可确认大肠杆菌阳性结果。
根据大肠杆菌阳性管数的MPN检索可查水样中总大肠杆菌和耐热大肠杆菌的最大或然数。
再与《中华人民共和国地表水环境质量标准》(GB3838-2002)对比，判定水质。
【关键词】环境水样大肠杆菌耐热大肠杆菌多管发酵法最大或然数（MPN）产酸产气【前言】水体的污染程度可大致由总大肠杆菌数及耐热大肠杆菌数反映出来。
大肠杆菌为革兰氏阴性菌，无芽胞，糖代谢时可产酸产气，可使溴甲酚紫由紫色变为黄色，并可通过伊红美蓝培养基鉴定，大肠杆菌发酵乳糖造成的酸性环境，使两种染料结合成复合物，使菌群产生带核心的，有金属光泽的深紫色菌落。
耐热大肠杆菌是一种特殊的大肠杆菌，由于它多见于人类或动物的粪便中，可耐高温，当由37℃环境变为45℃时，依旧可以正常生长。
当水体被粪便污染时，其含量较高，由此判断水质高低。
【材料与方法】：（一）材料乳糖蛋白胨培养液：蛋白胨10g、牛肉膏3g、乳糖5g、氯化钠5g、1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1ml、蒸馏水1000ml （10ml/试管+小倒管20支）EC肉汤培养基：胰蛋白胨20g、3号胆盐1.5g、乳糖5g、磷酸氢二钾4g 、磷酸二氢钾1.5g、氯化钠5g、蒸馏水1000ml （10ml/试管+小倒管10支）伊红美蓝培养基：蛋白胨10g、乳糖10g、磷酸氢二钾2g、琼脂20~30g、2%伊红水溶液20ml、0.5%美蓝水溶液13ml、蒸馏水1000ml （150ml/瓶）4.5 mL无菌水：4支（二）器材无菌1 mL移液管：4支；40~200 微升移液器、吸气器：各1支；200微升无菌Tip：20只；载玻片和盖玻片若干；革兰氏染色各试剂；培养皿若干套；酒精灯；显微镜等（二）原理及方法1、样品的稀释和培养：取原环境水样0.5ml加入到4.5ml无菌水中，混合均匀，制成 10-1样品；再从10-1样品中溶液取0.5ml加入到4.5ml无菌水中，混合均匀，制成10-2样品；再从10-2样品中溶液取0.5ml加入到4.5ml无菌水中，混合均匀，制成10-3样品，再从10-3样品中溶液取0.5ml加入到4.5ml无菌水中，混合均匀，制成10-4样品，每个稀释度两管。
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水质总大肠菌群和粪大肠菌群的测定
（纸片快速法）
申请人
项目负责人员
制定原因
验证检测方法符合实验室要求、确保数据准确性与有效性
方法适用范围
适用于地表水、地下水及废水中的总大肠菌群和粪大肠菌群的快速测定。
方法来源
HJ 755-2015《水质总大肠菌群和粪大肠菌群的测定纸片快速法》
仪器、试剂和环境的要求
检测结果的判断
1.结果判读：
（1）制片上出现红斑或红晕且周围变黄，为阳性。
（2）纸片全片变黄，无红斑或红晕，为阳性。
（3）纸片部分变黄，无红斑或红晕，为阴性。
（4）纸片的紫色背景上出现红斑或红晕，而周围不变黄，为阴性。
（5）纸片无变化，为阴性。
2.结果计算：
根据不同接种量的阳性纸片数量，查MPN表得到MPN值，按公式换算并报告1L水样中总大肠菌群或粪大肠菌群数：
C=100*M/Q
式中：
C—水样总大肠菌群或粪大肠菌群浓度（MPN/L）
M—查MPN表得到的MPN值(MPN/100ml)
Q—实际水样最大接种量（ml）
100—为10*10ml，其中，10将MPN值的单位MPN/100ml转换为MPN/L，10ml为MPN表中最大接种量。
3.结果表示：
测定结果保留二位有效数字，大于等于100时以科学计数法表示，结果的单位为MPN/L。平均值以几何平均计算。
1.仪器和设备
1.1高压蒸汽灭菌器1.2培养箱来自1.3冰箱1.4采样瓶
1.5试管
1.6水质总大肠菌群和粪大肠菌群测试纸片
2.试剂：2.1硫代硫酸钠2.2乙二胺四乙酸二钠
采样和测试过程中，所用到的玻璃器皿需灭菌后方可使用。
方法描述
按MPN法，将一定量的水样以无菌操作的方式接种到吸附有适量指示剂（溴甲酚紫和2,3,5-氯化三苯四氮唑即TTC）以及乳糖等营养成分的无菌滤纸上，在特定的温度（37℃或44.5℃）培养24h，当细菌生长繁殖时，产酸使pH值降低，溴甲酚紫指示剂由紫色变黄色，同时，产气过程相当的脱氢酶在适宜的pH范围内，催化底物脱氢还原TTC形成红色的不溶性三苯甲（TTF）。即可在产酸后的黄色背景下显示出红色斑点（或红晕）。通过上述指示剂的颜色变化就可对是否产酸产气作出判断，从而确定是否有总大肠菌群或粪大肠菌群存在，再通过查MPN表就可得出相应总大肠菌群或粪大肠菌群的浓度值。
附件说明
表1
运行说明
经验证该方法符合我实验室使用。
审批意见
技术经理：
日期：
总经理：
日期：
表1