肌动蛋白的克隆与鉴定

β—肌动蛋白的克隆与验证

李亚楠邹曾阳孟冠奇李军张建忠沈彤

摘要：Actin即“肌动蛋白”，是细胞的一种重要骨架蛋白。Actin在不同物种之间高度保守，以至于很难获得较好的针对actin的抗血清。Actin大致可分为六种，其中四种是不同肌肉组织特异性的，包括α-skeletal muscle actin，α-cardiac muscle actin，α-smooth muscle actin，和γ-smooth muscle actin；其余两种广泛分布于各种组织中，包括β-acti n(β-non-muscle)和γ-non-muscle actin。[1]β-Actin是横纹肌肌纤维中的一种主要蛋白质成分，也是肌肉细丝及细胞骨架微丝的主要成分。具有收缩功能，分布广泛。β-Actin是PCR常用的内参，β-Actin抗体是Western Blot 很好的内参指数。内参即是内部参照（Internal Control），对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白。它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。[2]

本次实验主要通过PCR的手法来扩增目标蛋白。通过组织细胞提取DNA，用琼脂凝胶电泳来验证是否得到目标DNA；回收后的目标DNA 用PCR仪扩增，并用电泳进行回收；与T载体（PUD-18T）连接；用培养的大肠杆菌DH-5a来制备感受态细胞；将制备完成的感受态细胞均匀的涂布于含有x-gal和IPTG的混合液的LB培养基平板中进行蓝白斑的筛选；最后提取质粒DNA，经验证后保藏菌种。

关键词：β-肌动蛋白横纹肌蛋白质PCR

1材料与方法

1.1 组织细胞DNA提取。[3]

1.1.1 试剂：细胞裂解缓冲液、蛋白酶K、TE缓冲液、酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）、7.5mol/l乙酸铵。

器材：胶头滴管、离心机、烧杯、动物组织、研钵、水浴。

1.1.2 方法

取新鲜或冰冻动物组织块0.1g，尽量剪碎，置于石英研钵中，加入1ml的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块，转入1.5ml离心管中，加入蛋白酶K20微升，混匀。在65℃恒温水浴锅中水浴20min，间歇震荡离心管数次。于台式离心机以

12000rpm离心5min，取上清液入另一离心管中。

加2倍体积的异丙醇，倒转混匀后，可以看见丝状物，用100微升吸头挑出晾干，用200微升TE重新溶解。

加等量的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）振荡混匀，离心12000rpm 5min。

取上层溶液至另一管，加入1/2体积的7.5mol/l

乙酸铵，加入2倍体积的无水乙醇，混合后室温沉淀

2min,离心12000rpm 10min。

小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将

附于管壁的残余液滴除掉。

用1ml 70％乙醇洗涤沉淀物1次，离心12000rpm

5min。

小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉，室温干燥。

加200微升TE重新溶解沉淀物，然后置于4℃或-20℃保存备用。

1.2 PCR扩增

1.2.1 器材：PCR仪、移液枪、上下引物、去离子水、反应缓冲液，模板DNA、组织DNA

1.2.2 方法

在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性（高温使双链DNA解离形成单链。）、退火（低温下，引物与模板DNA互补区结合）、延伸（中温延伸，DNA聚合酶催化引物为起始点的DNA链延伸反应与），体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA

在PCR管中依次加入下列溶液：PCR预混液12.5微升、去离子水9.5微升、上游引物1微升、下游引物1微升、组织DNA1微升。共计

25微升体系

设置PCR反应程序： 94℃ 5min

94℃ 30s

58℃ 30s 32个循环

72℃ 1min

72℃ 8min

1.3电泳

1.3.1仪器：水平电泳槽.电泳仪.凝胶成像分析系统.微波炉.微量移液器.透明胶带.点样板.100ml或250ml锥形瓶.量筒.吸头等。

试剂：50x TAE.Tris溶液.冰乙酸.EDTA溶液.去离子水.1xTAE缓冲液.琼脂

糖.溴化乙啶贮存液.溴化乙啶.溴酚蓝.二甲苯青.甘油.

其他：DNA样品.DNA Ladder。

1.3.2方法

称取 1.5g琼脂糖置于锥形瓶中，加入150ml1xTAE

瓶口倒扣小烧杯100℃加热煮沸3次至琼脂糖全部融化，

摇匀即成10％琼脂糖凝胶液。

胶板制备：取电泳槽内有机玻璃内槽（制胶槽）洗干净，晾干.放入制胶玻璃板，取透明胶带将玻璃板与槽两端边缘封好形成模子。将内槽置于水平位置并在固定位置放好梳子，将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶完全凝固垂直轻拔梳子、取下胶带、将凝胶及内槽放入电泳槽中，添加1xTAE电泳缓冲液至没过胶板为止。

加样：在点样板上混合DNA样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1x。用10微升微量移液枪分别将样品加入胶板的样品小槽内，每加完一个样品应该更换一个加样头以防污染，加样时勿碰坏样品周围的凝胶面。

电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压60-100v。

样品由负极（黑色）向正极（红色）方向移动，电压升高琼脂

糖凝胶的有效分离范围降低，当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1

㎝处时停止电泳。

观察照相：在紫外灯下观察,DNA存在则显示出红色荧光条

带，采用凝胶成像系统拍照保存。

琼脂糖凝胶电泳回收按电泳回收试剂盒操作，回收电泳。

1.4 感受态细胞与T载体的连接

1.4.1 设备：移液器、离心机、感受态细胞、T载体

1.4.2 方法

PUD-187 取0.5-1.0

微升回收纯化的DNA 2微升或3-4微升，看具体浓度。

加水补至5微升，再加入5毫升SOLUTION1，冰上助融。

共10微升在16摄氏度放置30分钟，之后4摄氏度过夜。

1.5 细菌转化

1.5.1 设备 LB液体培养基LB固体培养基，抗生素，，氨苄青霉素，配成100mg/ml，备用，0.1mol/L.CaCl2aq.接种针移液管，培养皿，净化工作台，摇床，恒温水浴锅，离心机。

X-gal(5-溴-4-氯-3吲哚-β-D半乳糖)X-gal溶于N，N＇-二甲基甲酰胺中配20mg/ml原液。-20℃避光保存，IPTG（异丙基-β-D半乳糖苷）0.2g/ml分装贮存于-20℃，氨苄青霉素（Ampiaillin）1g Ampiaillin溶于5ml灭菌水中。配成母液保存于-20℃

1.5.2 方法

LB液体培养基：

胰蛋白酶1g，酵母粉2克，氯化钠1克，pH7.2-7.4（分

装，20毫升/250毫升，三角瓶，3毫升试管0.07兆帕高压

灭菌30分钟）。

LB固体培养基：

LB液体培养基加入1.6%琼脂粉即可。（分装50毫升/250毫升，三角瓶，加入8克琼脂粉0.07兆帕高压灭菌30分钟）。

1mol/l氯化钙（称取1.1克无水氯化钙，溶于90毫升蒸馏水，定容100毫升，装在250毫升三角瓶，0.07兆帕高压灭菌30分钟，4摄氏度保存）。

从-70摄氏度冰箱中取出感受态细胞，放入冰水中融化，放置大约10分钟。