DNA测序技术的发展历程及其研究进展

二、测序技术的建立
蛋白质和RNA的测序技术
1949年, Frederick Sanger开发了测定胰岛素两条肽链 氨基末端序列的技术,1953年测定了胰岛素的氨基酸序列。 1950年，Edman提出了蛋白质的N端测序技术,后来在此 基础上发展出了蛋白质自动测序技术。 1965年，Sanger等发明了RNA的小片段序列测定法,并 完成了大肠杆菌5S rRNA的120个核苷酸的测定。 同一时期,Holley完成了酵母丙氨酸转运tRNA的序列测定。
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2.2 Solexa测序技术
Illumina公司的新一代测序仪Genome Analyzer最早由 Solexa公司研发，利用合成测序(Sequencingby Synthesis) 的原理，实现自动化样本制备及大规模平行测序。
核心技术：“DNA簇”和“可逆性末端终止” 。 原理：将基因组DNA的随机片段附着到光学透明的玻璃表 面（即Flow cell），这些DNA片段经过延伸和桥式扩增后， 在Flow cell上形成了数以亿计Cluster，每个Cluster是具有 数千份相同模板的单分子簇。然后利用带荧光基团的四种特殊 脱氧核糖核苷酸，通过可逆性终止的SBS（边合成边测序）技 术对待测的模板DNA进行测序。
3.1 HeliScope单分子测序仪
2008年4月，Helico BioScience公司的Timothy 等人在Science上报道了他们开发的真正的单分子测序 技术,并利用该技术对一个M13病毒基因组进行重测序。 这项技术之所以被称为真正的单分子测序,是因为它完 全跨过了前述3种高通量测序依赖的基于PCR扩增的信 号放大过程,真正达到了读取单个荧光分子的能力。 斯坦福大学的科学家最近利用Heliscope单分子测 序仪,用了48 000美元的试剂和4个星期的时间,对一名 白人男子的基因组进行了测序。测序的覆盖度达28倍, 覆盖了90%的人类参考基因组。序列读长24-70 bp,平 均读长为32 bp,并鉴定出280万个SNP位点和752个拷 贝数变异。
目前所用自动测序技术的改进
3730 全自动 测序仪
1.4杂交测序技术
该方法不同于化学降解法和Sanger法，是利用 DNA杂交原理，将一系列已知序列的单链寡核苷酸片 段固定在基片上，把待测的DNA样品片段变性后与其 杂交，根据杂交情况排列出样品的序列信息。 杂交测序检测速度快，采用标准化的高密度寡核苷 酸芯片能够大幅度降低检测的成本，具有部分第二代测 序技术的特点。但该方法误差较大，且不能重复测定。
1.1 化学降解法
基本原理:
利用特异的选择性试剂，专一性的随机断裂DNA 成不同长短的片段。根据试剂的选择性及片段在高分 辨力的聚丙烯酰胺凝胶电泳上的区带位臵，判断DNA 片段末端核苷酸的种类，从而测出DNA的序列。
技术路线
将双链DNA样品变为单链
↓ 每个单链的同一方向末端都用放射 性同位素标记,以便显示DNA条带 ↓ 分别用不同方法处理,获得只差 一个核苷酸的降解DNA群体 ↓ 电泳,读取DNA的核苷酸顺序
1.2 双脱氧链终止法
又称为Sanger法。该法的原理是：利用DNA聚合 酶，以待测单链DNA为模板，以dNTP为底物，设立四 种相互独立的测序反应体系，在每个反应体系中加入不 同的双脱氧核苷三磷酸（dideoxyribo nucleoside triphos phate，ddNTP）作为链延伸终止剂。在测序 引物引导下，按照碱基配对原则，每个反应体系中合成 一系列长短不一的引物延伸链，通过高分辨率的变性聚 丙烯酰胺凝胶电泳分离，放射自显影检测后，从凝胶底 部到顶部按5′→3′方向读出新合成链序列，由此推知 待测模板链的序列 。
Maxam-Gilbert 法所用的化学技术
碱基 G A+G 特异修饰方法 Ph8.0,用硫酸二甲酯对 N7进行甲基化,使 C8C9键对碱基裂解有特殊敏感性 pH2.0 哌啶甲酸可使嘌呤环的N原子化,从而导 致脱嘌呤,并因此消弱腺嘌呤和鸟嘌呤的糖苷 键 肼可打开嘧啶环,后者重新环化成五元环后易 除去 1.5mol/L NaCl存在时,可用肼除去胞嘧啶
C+T C
化学降解法刚问世时，准确性较好，也容易为普通 研究人员所掌握，因此用得较多。而且化学降解较之链 终止法具有一个明显的优点，即所测序列来自原DNA分 子而不是酶促合成产生的拷贝，排除了合成时造成的错 误。但化学降解法操作过程较麻烦，且用到放射性物质， 逐渐被简便快速的Sanger法所代替。
第二代的高通量测序技术已经得到了很好的发展和 应用, 但是由于其测序速度、成本、准确度等关键问题的 解决仍存在困难,研究者们很快将目光转向了更高更新的 测序解决方案。 单分子测序也就应运而生。 目前,我国也启动了第三代测序技术的研究。2009 年12月,中科院北京基因组研究所与浪潮成立“中科院北 京基因组研究所—浪潮基因组科学联合实验室”,利用各 自的优势联合研发国产第三代测序仪,第一台样机预计 2013年问世,届时有望缓解测序仪核心技术受制于国外 公司的现状。
随着人类基因组计划的完成,人们进入了后基因组时代, 即功能基因组时代,传统的测序方法已经不能满足深度测序 和重复测序等大规模基因组测序的需求,这促使了新一代 DNA测序技术的诞生。新一代测序技术即第二代测序技术。
2、第二代DNA测序技术
第二代测序技术，主要包括罗氏454公司的GS FLX 测序平台、Illumina公司的Solexa Genome Analyzer测 序平台和ABI公司的SOLiD测序平台。
造福人类的HGP
人类基因组计划（Human Genome Project－ HGP）于1990年正式启动，其主要目标有：识别人类 DNA中所有基因（超过10万个）；测定组成人类DNA的 30亿碱基对的序列；将这些信息储存到数据库中；开发 出有关数据分析工具；致力于解决该计划可能引发的伦 理、法律和社会问题。已于2003年完成。 人类基因组计划是当代生命科学一项伟大的科学工 程，它奠定了21世纪生命科学发展和现代医药生物技术 产业化的基础，具有科学上的巨大意义和商业上的巨大 价值。
第三代测序技术非常惊人！ 1、它实现了DNA聚合酶内在自身的反应速度，一秒可以测 10个碱基，测序速度是化学法测序的2万倍。 2、它实现了DNA聚合酶内在自身的processivity（延续性， 也就是DNA聚合酶一次可以合成很长的片段），一个反应就 可以测非常长的序列。 二代测序现在可以测到上百个碱基， 但是三代测序现在就可以测几千个碱基。这为基因组的重复 序列的拼接提供了非常好的条件。 3、它的精度非常高，达到99.9999%。 4、可直接测RNA序列。 5、可直接测甲基化的DNA序列。
第二代测序技术最显著的特征是高通量,一次能对几十 万到几百万条DNA分子进行序列测序,使得对一个物种的转 录组测序或基因组深度测序变得方便易行。
第二代测序技术将片段化的基因组DNA两侧连上接 头,随后用不同的方法产生几百万个空间固定的PCR克隆 阵列。每个克隆由单个文库片段的多个拷贝组成。然后 进行引物杂交和酶延伸反应。由于所有的克隆都在同一 平面上,这些反应就能够大规模平行进行,每个延伸反应所 掺入的荧光标记的成像检测也能同时进行,从而获得测序 数据。DNA序列延伸和成像检测不断重复,最后经过计算 机分析就可以获得完整的DNA序列信息。 第二代测序技术包括：454测序技术、Solexa测序 技术和SOLiD测序技术。
2.1 454测序技术
原理：在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶 和双磷酸酶的作用下，将每一个dNTP的聚合与一次化 学发光信号的释放偶联起来，通过检测化学发光信号
的有无和强度，达到实时检测DNA序列的目的。
454生命科学公司在2005年最早推出了第二代测序平台 Genome Sequencer 20，并测序了支原体Mycoplasma genitalium的基因组。 并在2007年推出性能更优的第二代 基因组测序系统一Genome Sequencer FLX System(GS FLX)。罗氏在2005年便与454公司洽谈并购事宜，2007年 完成并购，紧接着公布了DNA双螺旋的发现者之一——沃森 (Jim Watson)的个人基因组，测序总花费不到一百万美元。
Genome Analyzer系统需要的样品量低至100ng，文 库构建过程简单，减少了样品分离和制备的时间，配对
末端读长可达到2×50 bp，每次运行后可获得超过20
GB的高质量过滤数据，且运行成本较低，是性价比较 高的新一代测序技术。
2.3 SOLiD测序技术
SOLID通过连接反应进行测序。其基本原理是以四色荧 光标记的寡核苷酸进行多次连接合成，取代传统的聚合酶连接 反应。具体步骤包括：
通过几十年的逐步改进, 第1 代测序仪的读长可以 超过1000 bp, 原始数据的准确率可以高达99.999%, 测定每千碱基序列的成本是0.5 美元, 每天的数据通量 可以达到600000 碱基。
第一代测序技术在分子生物学研究中发挥过重要的作 用,如人类基因组计划(human genome project,HGP)主要 基于第一代DNA测序技术。目前基于荧光标记和Sanger的 双脱氧链终止法原理的荧光自动测序仪仍被广泛地应用。
DNA测序技术的建立
1975年，Sanger和Coulson发明了“加减法”测定DNA 序列。 1977年， Sanger在引入双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)后, 形成了双脱氧链终止法,使得DNA序列测定的效率和准确 性大大提高。 1977年，Maxam和Gilbert报道了化学降解法测定DNA 的序列。
文库准备 扩增 微珠与玻片连接
连接测序
超高通量是SOLID系统最突出的特点，目前SOLID 3单 次运行可产生50 GB的序列数据，相当于17倍人类基凶组覆 盖度。
3、第三代DNA测序技术
第三代测序技术是以单分子测序为特点的测序技术。 如生物科学公司(BioScience Corporation)的HeliScope 单分子测序仪(HeliScope SingleMolecular Sequencer) 以及正在研制的太平洋生物科学公司(Pacific Biosciences) 的单分子实时DNA测序技术[SingleMolecule Real Time (SMRT)DNA sequencing technology]和牛津纳米孔技术 公司(Oxford Nanopore TechnologiesLtd)的纳米孔单分 子测序技术等。
一、DNA序列测定的意义 二、测序技术的建立 三、DNA测序技术的发展 四、DNA测序技术的展望 五、DNA测序技术的应用
一、DNA序列测定的意义
DNA的序列测定是分子生物学研究中的一项非 常重要的和关键的内容。如在基因的分离、定位、 基因结构与功能的研究、基因工程中载体的组建、 基因表达与调控、基因片段的合成和探针的制备、 基因与疾病的关系等等，都要求对DNA一级结构的 详细了解。
dNTP
P P P
OH
P
P
OH ddNTP
OH
P
O H
双 脱 氧 链 末 端 终 止 法 测 序 原 理 示 意 图
Sanger法因操作简便，得到广泛的应用。后 来在此基础上发展出多种DNA测序技术，其中 最重要的是荧光自动测序技术。
1.3 荧光自动测序技术
荧光自动测序技术基于Sanger原理，用荧光标记代替同 位素标记，并用成像系统自动检测，从而大大提高了DNA测 序的速度和准确性。 目前，应用最广泛的应用生物系统公司(applied biosystems ，ABI)3730系列自动测序仪即是基于毛细管 电泳和荧光标记技术的DNA测序仪。如ABI3730XL测序仪 拥有96道毛细管，4种双脱氧核苷酸的碱基分别用不同的荧 光标记，在通过毛细管时不同长度的DNA片段上的4种荧光 基团被激光激发，发出不同颜色的荧光，被CCD检测系统 识别，并直接翻译成DNA序列。
DNA序列测定技术出现后,迅速超越了蛋白
质和RNA测序技术,成为现代分子生物学中最重
要的技术。
三、DNA测序技术的发展
第一代DNA测序技术 第二代DNA测序技术 第三代DNA测序技术
1、第一代DNA测序技术
第一代DNA测序技术： 传统的化学降解法、双脱氧链终止法以及在它们的基 础上发展来的各种DNA测序技术。 第一代DNA测序技术包括：化学降解法、双脱氧链终 止法、荧光自动测序技术和杂交测序技术。