亲和色谱PPT
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9 亲和色谱
然后把含有目的物质的混合液作为流动相，在 有利于固定相配基与目的物质形成络合物的条 件下进入层析柱。
16
这时，混合液中只
有能与配基发生结合反
应形成络合物的目的物
质（图中· 分子）被吸附。
不能发生结合反应
的杂质分子（图中△分 子）直接流出。
17
经清洗后，选择适当的洗脱液或 改变洗脱条件进行洗脱（图中c），
22
配体的选择：
一对可逆结合的生物分子中与载体相偶 联的一方称配体。如抑制剂，底物，抗体， 辅酶等。
优良配体须具备的条件：
1）与待纯化的物质有较强的亲和力。 2）具有与基质共价结合的基团。
23
目的产物与相应的配基
所要分离的目 的产物
酶 抗体 凝集素 激素
相应的配基
底物、抑制剂、辅酶（辅因子） 抗原、病毒、细胞 多糖、糖蛋白、细胞受体 受体、载体蛋白
亲和配基选择（很困难）：
组合化学肽库：小肽亲和配基。
噬菌体展示技术筛选：目标蛋白与噬菌体结合。
SELEX技术筛选：：与蛋白质相匹配的寡核苷酸 6
9.1 生物亲和作用
9.1.2 影响亲和作用的因素
离子强度 pH值
抑制氢键形成的物质
温度 螯合剂
7
9.1 生物亲和作用
9.1.3 亲和作用体系
8
9.2 亲和色谱原理
使被分离物质与固定相配基解离，
即可将目标产物分离纯化。
18
9.3 亲和色谱介质
一般情况下，需根据目标产物选择合适 的亲和配基来修饰固体粒子，以制备所需的
亲和吸附介质（固定相）。 固体粒子称为配基的载体。
19
作为载体的物质应具有（6点）： ①不溶性的多孔网状结构，渗透性好； ②物理和化学稳定性高，有较高的机械强度， 使用寿命长； ③具有亲水性，无非特异性吸附； ④含有可活化的反应基团，利于亲和配基的固
分析化学第十章_亲和色谱
分析化学第十章_亲和色谱亲和色谱(affinity chromatography)是一种利用生物分子之间的特异性相互作用来分离和纯化目标分子的分析方法。
它是一种分子识别性较强的分离技术，广泛应用于生物医药领域。
亲和色谱的基本原理是利用配体（ligand）与目标分子之间的特异性结合，实现目标分子的选择性吸附和洗脱。
配体可以是抗体、酶、受体、亲和剂等，通过共价或非共价的化学方法与固定在色谱填料上，形成亲和色谱填料。
目标分子与配体之间根据亲和性或特异性结合，而非目标分子则快速洗脱。
亲和色谱的步骤包括样品加载、洗脱条件优化和目标分子收集。
首先将样品加载到亲和色谱柱中，目标分子与亲和填料的配体结合。
随后，通过改变洗脱液的条件，如pH、温度、离子强度等，以破坏目标分子和配体之间的结合，实现目标分子的洗脱。
最后，收集目标分子的洗脱液，得到纯化目标分子的样品。
亲和色谱具有高选择性、高灵敏度、易操作等优点，适用于分离和纯化复杂混合物中的目标分子。
它被广泛应用于蛋白质、核酸、糖类等生物大分子的纯化和分析。
亲和色谱的应用领域包括药物研发、生命科学研究、生物工程等。
例如，在药物研发中，可以利用亲和色谱分离和纯化药物靶标蛋白，以研究药物的作用机制。
在生命科学研究中，亲和色谱可以用于蛋白质相互作用的研究，如蛋白质结构和功能的研究。
在生物工程中，亲和色谱可以实现重组蛋白的纯化和分析。
亲和色谱还可以与其他色谱技术相结合，形成多维色谱系统，提高分离的选择性和分辨率。
例如，结合亲和色谱与离子交换色谱，可以实现对混合物中多种目标分子的同时纯化和分析。
近年来，亲和色谱技术不断发展，涌现出更多新的亲和填料和新的亲和配体。
例如，金属亲和色谱、核酸亲和色谱、抗体亲和色谱等，拓宽了亲和色谱的应用范围。
此外，与质谱、光谱等分析技术相结合，可以进一步提高亲和色谱的灵敏度和分析能力。
综上所述，亲和色谱是一种利用生物分子间特异性相互作用的分离纯化方法，具有高选择性和灵敏度，广泛应用于生物医药领域。
亲和色谱
过渡金属可形成螯合金属盐固定在固定相离子的 表面，用作亲和吸附的配基，这种利用金属离子 为配基的亲和色谱成为金属螯合亲和色谱或固定 化金属离子色谱
• 组氨酸：弱疏水性、咪唑环为弱电性
在盐浓度较低和pH约等于目标蛋白质等电点的溶 液中，固定化组氨酸的亲和吸附作用最强，随着 盐浓度的增大，吸附作用降低。 利用组氨酸为配基可亲和分离等电点相差较大的 蛋白质，洗脱则可采用增大盐浓度的梯度洗脱法
亲和色谱
• 利用生物亲和作用的原理纯化蛋白质的报道最早 见于1910年 • 有意识的利用生物亲和作用纯化蛋白质的研究始 于20世纪50年代初 • 1967年，亲和纯化技术从研究走向实用，出现了 亲和色谱这个名称 • 20世纪80年代以后，利用生物亲和作用的特异性 与其他分离技术相结合
定义
• 生物亲和作用：生物物质，特别是酶和抗 体等活性物质，具有识别特定物质并与该 物质的分子结合的能力。这种能力具有排 他性。生物分子间的这种 特异性相互作用 称为生物亲和作用。 • 亲和分离：利用生物分子间的特异性结合 作用的原理进行生物物质分离纯化的技术
• 肝素 与脂蛋白、脂肪酶、甾体受体等具有亲和作用。 其亲和作用在中性pH值和低浓度盐溶液中较强
亲和吸附剂及其制备 将亲和配基共价偶联在固体粒子的表面
（孔内）即可制备亲和吸附剂。
制备方法：书 323--325
配基固定化密度：吸附容量、空间位阻 作用 最佳密度值范围
亲和色谱
-间隔臂的作用
生物亲和作用
亲和作用的本质
亲和作用是自然界普遍存在的现象，生物分子间 的亲和作用具有更高的选择性。 蛋白质参与亲和作用的机理还不完全清楚，一般 认为蛋白质的立体结构中含有某些参与亲和结合 的部位，这些结合部位呈凹陷或凸起的结构。
亲和色谱
Disc-PAGE CHOM SDS-PAGE
Chitin
Trypsin
A
B
C&D
以凝胶电泳检验亲和色谱 操作过程各步骤样品→
Ate 吸附剂：
羟基磷灰石
(Ca5(PO4)3OH)2
可选择 NaCl 或 磷酸 等不同洗脱条件
Bio-Rad CHT
●疏水性层析法：
●●●●● ●●●
-NH2
●● ● ●
硫醇基 -SH
X
■ 可与各种配体基团反应的载体：
配体基团 親 和 性 载体
CNBr-activated Sepharose 4B
Pharmacia
反应方式
直接反应 加 EDC*
反应基团
-C≡N -COOH N-OH-succinimide Oxirane环氧己烷
■ Hydrophobic interaction 色析法：
Ammonium sulfate (% sat.) 25
0 10
Protein concentration
20
15
20
10
5
30
40
50
100
200
300
400
Elution volume (mL)
Pharmacia HIC
Ethylene glycol (%)
亲和色谱(AC)
（Affinity chromatograph）
原理：利用生物大分子和固定相表面存在的 某种特异性亲和力，进行选择性分离。 先在载体表面键合上一种具有一般反应 性能的所谓间隔臂(环氧、联胺等)，再连接 上配基(酶、抗原等)，这种固载化的配基将 只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作 用而被保留。改变淋洗液后洗脱。 亲和洗提 酶与其它化合物一起吸附到一种离子交换剂 上，然后用适当的底物特异地洗提。
Chitin
Trypsin
A
B
C&D
以凝胶电泳检验亲和色谱 操作过程各步骤样品→
Ate 吸附剂：
羟基磷灰石
(Ca5(PO4)3OH)2
可选择 NaCl 或 磷酸 等不同洗脱条件
Bio-Rad CHT
●疏水性层析法：
●●●●● ●●●
-NH2
●● ● ●
硫醇基 -SH
X
■ 可与各种配体基团反应的载体：
配体基团 親 和 性 载体
CNBr-activated Sepharose 4B
Pharmacia
反应方式
直接反应 加 EDC*
反应基团
-C≡N -COOH N-OH-succinimide Oxirane环氧己烷
■ Hydrophobic interaction 色析法：
Ammonium sulfate (% sat.) 25
0 10
Protein concentration
20
15
20
10
5
30
40
50
100
200
300
400
Elution volume (mL)
Pharmacia HIC
Ethylene glycol (%)
亲和色谱(AC)
（Affinity chromatograph）
原理：利用生物大分子和固定相表面存在的 某种特异性亲和力，进行选择性分离。 先在载体表面键合上一种具有一般反应 性能的所谓间隔臂(环氧、联胺等)，再连接 上配基(酶、抗原等)，这种固载化的配基将 只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作 用而被保留。改变淋洗液后洗脱。 亲和洗提 酶与其它化合物一起吸附到一种离子交换剂 上，然后用适当的底物特异地洗提。
第9章 亲和色谱
硅胶的活化
硅烷化试剂 配基的固定化 直接固定法(慢) 间接固定法(氧化法，碳二亚胺法，戊二醛活化法)
生物分离工程 第8章 亲和色谱
配基密度对蛋白质吸附的影响
通常情况下，目标产物的吸附容量随配基固定化密度 的提高而增大。但是，当配基固定化密度过高时，配 基之间会产生空间位阻作用(steric hindrance)，影响 配基与目标产物之间的亲和吸附，配基的有效利用率 降低； 因此，配基固定化密度也不宜过高，通常存在最佳密 度值范围。
模型分析(前述吸附理论和模型均可用于亲和色谱的分析)
生物分离工程 第8章 亲和色谱
8.6 亲和色谱的应用
组织纤溶酶原激活剂(t-PA)的纯化-酶的抑制剂为 亲和配基
t-PA是一种糖蛋白，是治疗血栓等心脑血管疾病的蛋 白药物； t-PA主要存在于动物心脏组织中，但含量很低； 目前主要利用重组DNA动物细胞生产t-PA 赖氨酸、精氨酸、氨基苄脒常用作配基
生物分离工程 第8章 亲和色谱
间隔臂的作用(消除空间位阻的影响)
配基
目 标 分 子
间隔臂
生物分离工程 第8章 亲和色谱
8.4 亲和吸附平衡
吸附等温线
基本上可用Langmuir或Freundlich方程描述
色素亲和吸附平衡
色素配基研究得最多的是辛巴蓝(Cibacron Blue 3GA, CB) CB与蛋白质的结合机理
具有亲和作用的分子对之间具有“钥匙”和“锁 孔”的关系是亲和作用的必要条件，但并不充分， 还需要分子或原子水平的各种相互作用才能完整 地体现亲和结合作用，包括：
生物分离工程 第8章 亲和色谱
静电作用：亲和作用分子对的结合部位上带有相反电 荷时，产生静电引力。如果满足“钥匙”和“锁孔” 的关系，在近距离发生的静电引力 很强烈的； 氢键：如果亲和作用分子对的一个分子中含有O原子或 N原子，结合部位之间可以产生氢键作用，形成O-H-O 或O-H-N的氢键结合，但氢键的产生与否受结合部位 之间位置关系的严格制约，O-H-O或O-H-N需排列在一 条直线上； 疏水性相互作用：如果亲和作用分子对的一个分子中 含有芳香环或烃基链等疏水基，另一方的结合部位上 也含有疏水区，则两者之间可发生疏水性相互作用， 如含有脯氨酸等氨基酸残基的蛋白质，胶原与单宁的 结合可通过疏水键结合； 配位键：如果亲和作用分子对均与同一金属离子配位， 则两者之间可通过金属配位键结合；
第八章 亲和色谱
第八章亲和色谱( Affinity chromatography)第一节生物亲和作用•生物分子能够区分结构和性质非常相近的其他分子，选择性地与其中某一种分子相结合——生物分子间的这种特异性相互作用称生物亲和作用，通过亲和作用发生的结合称为特异性结合或亲和结合。
一、生物亲和作用的概念•亲和作用是分子之间的结合作用，自然界普遍存在的现象，生物分子间的亲和作用具有更高的选择性二、亲和作用的本质必要条件：钥匙和锁孔的关系此外，还需要具备相互作用：静电作用；氢键；疏水性相互作用；配位键；弱共价键•(1) 离子强度三、影响亲和作用的因素静电引力减弱或完全破坏亲和作用氢键疏水相互作用亲和作用增大静电引力在亲和作用中占重要地位，所以一般可以用高盐洗脱•蛋白质为多价两性电解质，含有许多解离基团，不同解离基团的解离常数不同。
•(2) pH 值如果，静电引力对亲和作用的贡献最大，pH 就会严重影响亲和作用。
溶液pH 值选择非常重要。
•(3) 抑制氢键形成的物质•(4) 温度•(5) 离液离子•(6) 螯合剂四、亲和作用体系第二节亲和色谱原理•将具有亲和作用的两种分子中的一种分子与固定粒子共价偶联，可以特异性吸附或结合另一种分子，使另一种分子容易从混合物中得到选择性分离纯化。
•亲和作用分子对中被固定的分子称为其亲和结合对象的配基，亲和色谱的固定相是键合亲和配基的亲和吸附介质。
•操作一般分为进料、杂质清洗、目标产物洗脱和色谱柱再生等4个步骤。
配基不溶性母体载体或担体当用小分子化合为作为配基时，由于空间位阻作用，难于与配对的大分子亲和吻合，常在母体与间隔臂以增大配基与载体之间的距离，使其与生物大分子发生有效的亲和结合。
第三节亲和色谱介质•①酶的抑制剂与酶的活性部位结合•生物大分子或小分子化合物•②抗体单抗和多克隆抗体免疫亲和色谱•③A蛋白相对分子量约42000,与抗体结合,但不影响抗体与抗原结合可用于分离抗体-抗原复合体•④凝集素与糖特异结合的蛋白质的总称,如刀豆蛋白可用作糖蛋白、多糖、糖脂等的亲和配基。
亲和色谱精讲PPT课件
一、要求
㈠. L与基质结合，对L-S结合无干扰； ㈡. L为小分子有的需“手臂”，使LS结
合更有效； ㈢. 非专一吸附不大，以免吸附杂质； L与基质结合稳定（吸附、洗脱、再生）。
.
24
二、
偶联用Gel的选择 需考虑： ㈠. L上可供偶联的基团 ㈡. “手臂” ㈢. L的稳定pH
三、 由CNBr活化型Sep.4B制备
3. 需了解L-S的作用机制
如……
.
12
例：酶 有单底物反应、双底物反应
单A E
EA
P E
EP
底物A、产物P或它们的类似物都可以
.
13
双底物依次
AB E
EA EAB
PQ E
EPQ EQ
须选择A、若选B则吸附时须加A
.
14
双底物随机
A（B） B（A） P（Q） Q（P）
E
E
EA EA（B） EPQ
.
37
其他方法
羰基二咪唑（CDI）法 高碘酸盐法 磺化氟甲基吡啶鎓法 N-羟基琥珀酰亚胺法
.
38
其他亲和吸附剂
聚丙烯酰胺载体的亲和吸附剂可用戊二醛 法和肼解法活化,然后再将含氨基的配体固 定到其活化基团上;
硅胶和多孔玻璃载体的亲和吸附剂最常用 的修饰方法就是进行硅烷化处理,从而给载 体引入氨基或环氧基团.
连接臂的连接
连接臂先接配体后偶联至载体 连接臂先偶联至载体后接配体
.
30
四、由氨基-Sep或羧基- Sep制备
Sep-(CH2)6-NH2 Sep
L-COOH AH-
Sep-(CH2)6-COOH L-NH2
CH-Sep
碳二亚胺法（配基偶联的一种方法）：
《亲和色谱》课件
生物工程技术
利用生物工程技术改造蛋白质 或酶，提高亲和色谱的特异性
。
光学检测技术
结合光学检测技术，实现高灵 敏度、高分辨率的亲和色谱分
析。
亲和色谱在各领域的应用前景
生物医药领域
用于蛋白质、细胞、病毒等生物分子 的分离和纯化，为药物研发和疾病诊 断提供支持。
环境监测领域
用于水体、土壤、空气等环境样品中 污染物的分离和检测，为环境治理和 保护提供依据。
农药残留检测
亲和色谱可用于农药残留的检测，通过与农药分 子的特异性结合，实现对农药残留的高灵敏度检 测。
食品营养成分分析
亲和色谱可用于食品营养成分的分析，如维生素 、矿物质等，通过与特定配基的结合，实现对营 养成分的高效分离和检测。
亲和色谱在环境监测领域的应用案例
有毒有害物质检测
亲和色谱可用于有毒有害物质的检测，如重金属、有机污染物等， 通过与特定配基的结合，实现对有毒有害物质的高灵敏度检测。
食品安全领域
用于食品中农药残留、添加剂、毒素 等有害物质的检测和分离，保障食品 安全。
农业领域
用于植物生长调节物质、农药残留等 的分离和检测，促进农业可持续发展 。
亲和色谱的发展趋势和未来展望
智能化发展
通过自动化、智能化技术，提高亲和色谱的 分离效率和准确性。
高通量、高分辨率
开发高通量、高分辨率的亲和色谱技术，满 足大规模样品分析的需求。
稳定性差
亲和色谱的配体和载体在某些条件下可能不稳定，影 响实验结果。
适用范围有限
亲和色谱的适用范围相对较窄，仅适用于具有特异性 相互作用的目标分子。
亲和色谱的改进方向
开发通用型配体
通过研究不同类型分子间的相互作用，开发 出适用于多种目标分子的通用型配体，降低 实验成本。
亲和色谱法
2 间隔臂 在亲和色谱固定相中，需通过间隔臂将配位体连 接在基体上，由于间隔臂占据一定的机动空间。当配 位体与被测定的生物分子（尤其是生物大分子）产生 亲和作用时，有利于克服空间阻碍作用。 通式：
NH2 (CH2 )n R
R可为羧基、胺基或配位体自身
3 配位体 （1）染料配位体 大多是三嗪染料，主要用于蛋白质的分离与纯 化。 （2）定位金属离子配位体 它是将具有鳌合作用的有机官能团键合在间隔 壁的机体上，然后与Cu2+ ， Ni2+ ， Fe2+ ， Fe3+ 等金属离子生成稳定鳌合物，利用螯合物中的定 位金属离子与生物分子的特效亲和作用实现生物 分子的分离与纯化。
（6）共价配位体 主要用于含硫蛋白质分离。
三、亲和色谱的流动相 需使用pH值接近中性稀缓冲溶液，以保持其 生物活性。
亲和色谱使用的流动相：由磷酸盐、硼酸盐、乙酸 盐、柠檬酸盐具有不同pH值的缓冲溶液体系，有机碱三 羟甲基甲烷与盐酸顺丁烯二酸构成的缓冲溶液体系也有 较多应用。 此外，在生物大分子亲和色谱中，还广泛使用生物 研究中常用的非离子缓冲物。 如：N-(2-) 乙基-N-（2-磺化乙基）-哌嗪 （HEPES）、N,N,N',N'-四乙基乙二胺（TEEN）。
• 在载体（无机填料）上键合间隔臂（如环 氧，联氨等），再连接上配基（酶，抗原 等）。与和配基之间有亲和力的生物大分 子作用，对其进行分离。
一 、分离原理（生成锁匙结构络合物） 亲和色谱固定相上键合的配体与被分离的生物活 性分子间的相互作用，可用锁匙结构合物的生成来 表示：
二、 亲和色谱法的分类
（3）包合配合物配位体 包合配合物配位体是由主体分子与客体分子 间的特殊亲和作用而形成的。常用的主体分子为 β-环糊精、冠醚等。
免疫亲和色谱PPT幻灯片
2021/3/8
2021/3/8
制备IAC基体首先需要抗血清，单独地看免疫原的 合成和抗体的免疫与纯化方法和IAC本身不太有什么关 联，但这些是所有免疫化学方法的主要部分。制成IAC 基体，必须将抗体结合到载体上，且不能丢失太多活 性。大多数情况下，抗体与载体以共价键结合，如聚 丙烯酰胺(polyacrylamide)、三丙烯酰胺(trisacrylபைடு நூலகம் 、 琼 脂 糖 （ agarose ） 、 葡 聚 糖 (dextran) 和 纤 维 素 (cellulose)。
2021/3/8
多 免 疫 亲 和 净 化 （ multi-immunoaffinity cleanup, MIAC）是将不同的多克隆抗体合装在 一个柱中。
用GC-MS测定牛肉中的去甲睾酮和甲基睾酮 ，是将两个不同的多克隆抗体混合偶联到一个载 体上。为了分析7个同化激素，用7个单独的IAC 基体合在一个柱中。
2021/3/8
IAC具有特异性高、耗时少、操作简便、节省 溶剂等优点，然而要成为真正普及的技术，对IAC 还有更多要求。
IAC基体的可供性是主要因素。除极少数外， 大多数试验室没有生产抗体的设备。另外，订制抗 体不一定能保证最后产品的质量，而且一般要等624个月才能得到血清。迄今，市场上能得到的免疫 亲和柱和吸着剂仅限于激素、ß-激动剂、皮质激素 以及几种真菌毒素。当为了分析目的的抗体生产商 业化成为现实时，IAC将会显示出它的潜力。
偶联之前，载体必须用试剂致活，如澳化氰( cyanogen bromide) 、 高 碘 酸 盐 (periodate) 、 三 嗪 (triazine) 、 羰 基二 咪唑 ( carbonyldiimidazole) 或 N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide)。
2021/3/8
制备IAC基体首先需要抗血清，单独地看免疫原的 合成和抗体的免疫与纯化方法和IAC本身不太有什么关 联，但这些是所有免疫化学方法的主要部分。制成IAC 基体，必须将抗体结合到载体上，且不能丢失太多活 性。大多数情况下，抗体与载体以共价键结合，如聚 丙烯酰胺(polyacrylamide)、三丙烯酰胺(trisacrylபைடு நூலகம் 、 琼 脂 糖 （ agarose ） 、 葡 聚 糖 (dextran) 和 纤 维 素 (cellulose)。
2021/3/8
多 免 疫 亲 和 净 化 （ multi-immunoaffinity cleanup, MIAC）是将不同的多克隆抗体合装在 一个柱中。
用GC-MS测定牛肉中的去甲睾酮和甲基睾酮 ，是将两个不同的多克隆抗体混合偶联到一个载 体上。为了分析7个同化激素，用7个单独的IAC 基体合在一个柱中。
2021/3/8
IAC具有特异性高、耗时少、操作简便、节省 溶剂等优点，然而要成为真正普及的技术，对IAC 还有更多要求。
IAC基体的可供性是主要因素。除极少数外， 大多数试验室没有生产抗体的设备。另外，订制抗 体不一定能保证最后产品的质量，而且一般要等624个月才能得到血清。迄今，市场上能得到的免疫 亲和柱和吸着剂仅限于激素、ß-激动剂、皮质激素 以及几种真菌毒素。当为了分析目的的抗体生产商 业化成为现实时，IAC将会显示出它的潜力。
偶联之前，载体必须用试剂致活，如澳化氰( cyanogen bromide) 、 高 碘 酸 盐 (periodate) 、 三 嗪 (triazine) 、 羰 基二 咪唑 ( carbonyldiimidazole) 或 N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide)。
第九章_亲和色谱
wwwimustcnbioseparationengineeringwwwimustcn原料液细胞分离离心过滤细胞胞内产物路线一路线二细胞破碎碎片分离路线一a路线一b清液胞外产物粗分离盐析萃取超过滤等纯化层析电泳脱盐凝胶过滤超过滤浓缩超过滤精制结晶干燥包含体溶解加盐酸胍脲复性生化分离过程的一般流程
9.3亲和色谱的介质
亲和吸附介质是必备材料，过程的关键。商品化 介质不能满足需要时，要自制其过程是首先选择适当 的配基，然后修饰固定相制成吸附剂。 亲和吸附介质的组成：
载体（骨架） 配基
间隔臂
（1） 载体： 载体为固定配基提供了基质，理想的载体应具备以下性 质： a.具有亲水性 b.具有大量化学基团 c.机械强度好 d.稳定性好 e.颗粒大小及孔径均匀 琼脂糖是应用最 普遍的，见右图。其他 还有纤维素、多孔玻璃 及其他化学合成介质。
C.配基的分类 ： a.特异性配基
只针对单一的物质进行特异的结合，特异性随条件变化，对不同的 分离对象为获得特异性配基常常需要实验筛选，这类配基选择性高，方 便，种类少；
b. 通用性配基或群特异性配基
可与一类或几种生物分子作用，配基为小分子。优点是容量高，花 费低。通过改善吸附和洗脱条件，可以弥补特异性较差的缺点。广泛采 用的有：三嗪染料、金属螯合物组氨酸、核苷酸等。
亲和作用体系: 亲和作用体系由亲和作用的分子对组成，可以是 大分子－大分子、大分子－小分子、大分子－细胞和 细胞－细胞各种体系。 常用体系：分为两类 高度特异性体系：分 子成一对一的关系 群特异性体系： 一个分子与同类基团 的各种分子相结合。
（3）间隔臂： 引出的原因：存在几何位阻； 定义：配基和载体中间加入一定长度的有机基团，称间隔臂。 见下图。 对间隔臂的要求：长度适当，具有亲水性。 常用的间隔臂：乙二胺，己二胺，6-氨基己酸，β-羟基丙氨 酸。 理想的间隔臂：长度合适，不进行非特异的吸附，无外加的 活性吸附点，有双功能反应基团。
9.3亲和色谱的介质
亲和吸附介质是必备材料，过程的关键。商品化 介质不能满足需要时，要自制其过程是首先选择适当 的配基，然后修饰固定相制成吸附剂。 亲和吸附介质的组成：
载体（骨架） 配基
间隔臂
（1） 载体： 载体为固定配基提供了基质，理想的载体应具备以下性 质： a.具有亲水性 b.具有大量化学基团 c.机械强度好 d.稳定性好 e.颗粒大小及孔径均匀 琼脂糖是应用最 普遍的，见右图。其他 还有纤维素、多孔玻璃 及其他化学合成介质。
C.配基的分类 ： a.特异性配基
只针对单一的物质进行特异的结合，特异性随条件变化，对不同的 分离对象为获得特异性配基常常需要实验筛选，这类配基选择性高，方 便，种类少；
b. 通用性配基或群特异性配基
可与一类或几种生物分子作用，配基为小分子。优点是容量高，花 费低。通过改善吸附和洗脱条件，可以弥补特异性较差的缺点。广泛采 用的有：三嗪染料、金属螯合物组氨酸、核苷酸等。
亲和作用体系: 亲和作用体系由亲和作用的分子对组成，可以是 大分子－大分子、大分子－小分子、大分子－细胞和 细胞－细胞各种体系。 常用体系：分为两类 高度特异性体系：分 子成一对一的关系 群特异性体系： 一个分子与同类基团 的各种分子相结合。
（3）间隔臂： 引出的原因：存在几何位阻； 定义：配基和载体中间加入一定长度的有机基团，称间隔臂。 见下图。 对间隔臂的要求：长度适当，具有亲水性。 常用的间隔臂：乙二胺，己二胺，6-氨基己酸，β-羟基丙氨 酸。 理想的间隔臂：长度合适，不进行非特异的吸附，无外加的 活性吸附点，有双功能反应基团。
免疫亲和色谱PPT课件
3
生物工程技术
利用基因工程和蛋白质工程技术，开发具有高亲 和力和选择性的免疫亲和色谱配体，提高分离效 果。
提高免疫亲和色谱的特异性、灵敏度与重现性
优化免疫亲和色谱配体
通过蛋白质工程和基因工程技术，对免疫亲和色谱配体进行改造 和优化，提高其亲和力和选择性。
信号放大技术
结合酶促反应、化学放大等技术，提高检测信号的强度和灵敏度， 降低检测限。
免疫亲和色谱ppt课件
• 免疫亲和色谱简介 • 免疫亲和色谱的制备 • 免疫亲和色谱的操作流程 • 免疫亲和色谱的实际应用案例 • 免疫亲和色谱的未来发展与挑战
01
免疫亲和色谱简介
定义与原理
定义
免疫亲和色谱是一种基于抗原-抗 体特异性结合的分离分析技术。
原理
利用抗体或抗原与固定相上的配 基进行特异性结合，达到分离目 标物质的目的。
免疫亲和色谱的应用领域
01
02
03
04
生物药物分离纯化
用于分离纯化抗体、蛋白质、 酶等生物药物。
临床诊断
用于检测生物样本中的抗原、 抗体，辅助疾病诊断。
环境监测
用于检测环境中的有害物质， 如毒素、重金属等。
食品安全
用于检测食品中的有害物质、 农药残留等。
免疫亲和色谱的优势与局限性
优势
高特异性、高纯度分离、操作简便、 可重复使用等。
准确性。
样品纯化
去除样品中的杂质，提高样品的纯 度，以便更好地进行后续分析。
样品标记
对样品进行标记，以便在免疫亲和 色谱分离过程中进行追踪和检测。
免疫亲和色谱分离
抗体选择
选择针对目标分子的特 异性抗体，确保分离的
准确性和高效性。
亲和色谱
亲ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ层析原理图
影响亲和色谱的因素
• 1、上样体积 若目标产物与配基的结合作用较强，上样体积 对亲和色谱效果影响较小。若二者间结合力较弱，样品浓度 要高一些，上样量不要超过色谱柱载量的5%~10%。 • 2、柱长 亲和柱的长度需要根据亲和介质的性质确定。如果 亲和介质的载量(同上 求解释T ^T)高，与目标产物(目标物)的 作用力强，可以选择较短的珠子(柱子);相反，则应该增加柱 子的长度，保证目标产物与亲和介质有充分的作用时间。 • 3、流速 亲和吸附时目标产物与配基之间达到结合反应平衡 需要一个缓慢的过程。因此，样品上柱的流速应尽量的慢， 保证目标产物与配基之间有充分的时间结合，尤其是二者间 结合力弱和样品浓度过高时。 • 4、温度 温度效应在亲和色谱中比较重要，亲和介质的吸附 能力受温度影响，可以利用不同的温度进行吸附和洗脱。一 般情况下亲和介质的吸附能力随温度的升高而下降，因此在 上样时可选择较低的温度，使待分离物质与配基有较大的亲 和力，充分地结合;而在洗脱时刻采用较高的温度，使待分离 物质与配基的亲和力下降，便于待分离物质从配基上脱落。 例如，一般选择在4℃进行吸附，25℃下进行解
亲和色谱法
生物工程领域 2016-6-13
生物亲和作用
• 定义：生物物质，特别是酶和抗体等蛋白 质，具有识别特定物质并与之相结合的能 力。这种识别并结合的能力具有排他性， 即生物分子能够区分结构和性质非常相近 的其他分子，选择性地与其中一种分子相 结合。这种特异性的相互作用称为生物亲 和作用（bioaffinity）或简称亲和作用 (affinity)。
例：抗原抗体的特异性结合
电镜图片
抗原抗体结合示意图
相关仪器介绍
•
全自动顶空进样器
9 亲和色谱
疏水色谱 在载体表面连接上疏水的直链碳链或其 他疏水基团，如苯基，可以与蛋白质的 某些疏水基团相互作用，从而实现多组 分的分离。 操作要点 蛋白质的局部变性 洗脱采用逐步降低盐浓度的方法进行
离子交换色谱是最常用的蛋白质分离手段 操作要点： 由于蛋白质是两性电解质，在不同的pH值 下，其解离程度是不同的，因此既可以采 用阳离子交换，也可以用阴离子交换，可 视具体情况而定 由于蛋白质的极性基团很多，为了避免洗 脱困难，通常采用弱阳或弱阴离子交换剂 适当调节缓冲溶液的pH值，使蛋白质适当 解离，通常采用的pH值靠近其等电点（不 是等电点）
应用举例 利用高温杀死的酵母细胞为亲和过滤介质进行 亲和过滤纯化con A的研究。 酵母细胞（直径约5 μm）表面含有多糖残基， 因此可亲和吸附con A。
亲和双水相萃取
亲和双水相萃取即在PEG或Dextran上接上 一定的亲和配基，这样使体系具有双水相处 理量大和亲和色谱专一性高的优点。
柱子：BSA-Sepharose 4B
洗脱方式：逐次降低洗脱液pH值
分离组分：BSA血清不同的抗体组分。
应用举例
组织纤溶酶原激活剂（tPA）的纯化
干扰素（IFN）的纯化 重组人白细胞干扰素，经 一步单抗免疫亲和层析， rhIFN-α比活提高了1150 倍，收率达95%。
柱子：精氨酸-Sepharose 4B亲和柱 洗脱液：盐酸胍（GuCl) 猪心组织t-PA :活性提高7 倍，收率为56%
色谱法的基本原理
色谱法是利用混合物中各组分物理化学性质的差 异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、 分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的， 称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相） 中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度 移动而达到分离的目的。
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免疫亲和色谱 固定化金属离子亲和色谱 其他亲和色谱
免疫亲和色谱
免疫亲和色谱(Immunoaffinity Chromatography, IAC)是 利用生物体内存在的抗原、抗体之间高度特异性的亲和 力进行分离的方法。
IAC的特点
1. 2. 3.
专一 高效 灵敏 ……
IAC的应用
1. 2.
抗体的分离纯化——Protein A亲和色谱 快速诊断测试 ……
固定化金属离子亲和色谱
固定化金属离子亲和色谱(Immobilized Metal ion Affinity Chromatography, IMAC) 主要根据蛋白质中组氨酸、色氨酸或半胱氨酸等氨基酸 残基与色谱柱上的金属离子螯合作用形成络合物，从而 实现分离 产物变性 • 渗漏
谢谢
亲和色谱 Affinity Chromatography
黄岳
生研1502
亲和色谱概述
概念：利用生物分子间专一的亲和力而进行分离的一种色谱技术
原理和基本过程
原理：将具有亲和力的两个分子中一个固定在不溶性基质 上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子 进行分离纯化。
亲和色谱的类型
1. 2. 3.
配基稳定性高 ，不易脱落 金属离子配基价格低廉 ，再生成本低 省去了脱盐的预处理步骤 容易洗脱目标蛋白
IMAC的应用——Ni-Agarose His标签蛋白纯化技术
其他亲和色谱技术
生物亲和色谱 拟生物亲和色谱 分子对亲和色谱 共价亲和色谱 凝集素亲和色谱 ……
亲和色谱需要考虑的问题