微生物发酵讲义

微生物发酵实验指导生命科学学院2014年8月

目录：第一部分碱性磷酸酶工程菌株的筛选及发酵条件优化

实验一工程菌株的初筛

实验二工程菌株的复筛

实验三碱性磷酸酶活力的测定

实验四生产菌株发酵条件的优化第二部分生物反应器的使用

实验五发酵罐的构造

实验六发酵罐参数的设置及控制

实验七发酵罐的操作方法

第三部分机械搅拌发酵罐发酵生产碱性磷酸酶

实验八种子的制备

实验九发酵罐培养

实验十菌株生长曲线的绘制

实验十一发酵过程中还原糖的测定

注意事项：本实验内容涉及到分析化学、有机化学、生物化学、微生物学、发酵工艺学及化学过程等学科的基本实验操作，对学生综合实验能力要求较高。学生在上课之前，应对相应内容进行复习。

本实验上课期间，希望同学们注意以下几点要求。1．实验时，每个授课班级学生将分为4个小组。各小组设组长一名，负责协调工作及实验工作分工。在充分征求组员意见的基础上，分工一旦确定，组员必须服从工作安排，自觉、认真完成自己应负责工作。2．该实验属开放性实验，所有实验内容必须由学生自己完成。在同一时间内，每个小组内将进行不同的实验内容。学生必须对实验内容非常熟悉，思路清晰，才能尽量减少失误。因此学生要对实验内容进行预习。3．本实验学生分组实验，学生要团结友爱，既要合理分工，也要互相合作，保证实验顺利完成。每个小组实验数据共享，但数据处理过程不共享，否则将影响最后成绩。4．实验需要使用仪器较多，共用小型仪器放于固定位置，不得随意搬动。5．实验中要随时保持实验室及实验台面的清洁，以免发酵过程中污染。6．实验过程中，蒸馏水用量较大，各组要轮流负责打水。7．使用仪器必须按照教师指导进行，以免发生危险。

第一部分碱性磷酸酶工程菌株的筛选及发酵条件优化

实验一工程菌株的初筛

一、实验目的了解生产菌种筛选过程中初筛的意义。

二、实验原理碱性磷酸酶是一种底物专一性较低的磷酸单脂酶，在酶联免疫测定、非同位素探针、生物传感器、标记和测序方面有着重要的用途。菌种筛选一般分初筛和复筛，前者以量为主，后者以质为主。初筛可在培养皿或摇瓶中进行，优点是快速、直观、简便、工作量小，但测试条件与工业发酵时有很大差别，因此结果不一定可靠。本实验将采用微孔板法对碱性磷酸酶工程菌株进行初筛。

三、实验材料

1．菌株（1）阴性对照菌株：不含表达载体的E.coli BL21（教师提供）。

（2）阳性对照菌株：表达碱性磷酸酶的工程菌株（教师提供）。

（3）待测菌株：基因工程大实验构建获得的阳性工程菌株（学生自备）。

2．培养基

（1）LB固体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂18g，水1000ml，pH 7.0。121℃灭菌20min。

3．溶液

（1）0.1mol/L碳酸盐缓冲液（pH10.0）：称取无水碳酸钠0.64g，碳酸氢钠3.4g，4-氨基安替比林0.15g，100ml蒸馏水定容。

（2）0.02mol/L磷酸苯二钠溶液：称取二水磷酸苯二钠0.51g，用80ml沸水溶解，冷却后定容至100ml，并加入0.5ml氯仿。置4℃冰箱保存。

（3）铁氰化钾溶液：称取铁氰化钾0.25g，硼酸1.7g，各溶于40ml水中，将两种溶液混合后定容至100ml。置4℃冰箱保存。

以上试剂置冰箱保存一般不超过一周，每次都尽量现配现用。

4．器材高压蒸汽灭菌锅，超净工作台，天平，电炉；烧杯，量筒，三角瓶，培养皿，微孔板，试管。

四、实验方法

1．培养基制备：配制LB固体培养基200ml，分装于500ml三角瓶中，封口膜封口，灭菌。2．灭菌：将配制好的LB固体培养基121℃灭菌20min。将培养皿、牙签用报纸包好，121℃灭菌20min。

3．倒平板：将灭过菌融化的LB固体培养基冷却至50～60℃，以无菌操作法倒至已灭菌的培养皿中，每皿约20ml。冷却凝固待用。

4．菌株活化：取保藏菌种划线接种于固体培养基平板，37℃培养24~48h。

5．初筛：将0.1mol/L碳酸盐缓冲液（pH10.0）50μL点样于微孔板中（对照孔加量为55μL），用灭菌牙签取阴性对照菌株、阳性对照菌株及待测菌株等量菌苔与缓冲液充分混匀，于37℃水浴5min。再加入己预热的0.02mol/L磷酸苯二钠溶液50μL，37℃反应15min。加入铁氰化钾溶液150μL，显色并终止反应。重复二次（板）。以红色深浅初筛磷酸酶产生菌。

6. 保存菌种：将初筛后表达活性较高的3株菌株划线转接至LB固体培养基平板上，37℃培养24～48h，待菌苔长好后，Parafilm膜封口，4℃保存。

实验二工程菌株的复筛

一、实验目的

1．学习发酵菌种的复筛方法。

2．2．从已分离到的微生物中找出具有工业应用前景的菌株。

二、实验原理

复筛是对生产性能作较精确的定量测定工作。复筛时应尽可能模拟工业生产条件，一般通过摇瓶培养对培养液进行精确的定量分析测定，所得的数据比较有说服力，但工作量较大。为了尽可能使复筛条件与大生产相近，复筛培养基中应加入一些生产性原料。

三、实验材料

1．菌株：实验一初筛得到的性能优良的碱性磷酸酶工程菌株。

2．培养基：复筛培养基（LB液体培养基）：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，水1000ml，pH 7.0。121℃灭菌20min。

3．器材高压灭菌锅，超净工作台，天平，电炉；烧杯，量筒，三角瓶，移液管。

四、实验方法

1．培养基制备：配制复筛培养基300ml，分装于250ml三角瓶中，每瓶30ml，共9瓶，6层纱布封口，灭菌。

2．摇瓶培养：挑取1环菌苔（或1个单菌落），转接于复筛培养基中（每株菌接3瓶），37℃，150r/min摇床培养24h。

3．菌株生产性能的测定：取下摇瓶，参照实验三方法对碱性磷酸酶活力进行测定，每瓶测三次，取平均值。