微生物发酵讲义
微生物发酵PPT(培养技术)
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分批培养的优势： 操作简便, 周期短,染菌的机会减少和生产过程、产 品质量较易掌握,并且分批发酵在优势条件下对数 生长期会以最大生长率生长。 分批培养的局限： （1）培养过程中存在基质抑制问题, 生长受到限制, 包含有底物限制和毒素限制两种,如果对基质浓度 敏感或是对毒素累积敏感的产物,采用分批培养不 合适,产率较低。 （2）进行分批操作时,每次工作前都要进行设备、 材料、培养基等对仪器、设备及控制元件的技术要求较高, 从 而增加投资成本。 （2）连续培养是开放系统,并且发酵周期长, 有极大 的可能性造成菌体染菌,这也是生产成败的关键问题。 （3）在长期的发酵过程中,微生物容易发生变异, 菌 株退化问题也限制了大型连续培养生产,生产慢的高 产菌株很可能逐渐被生长快的低产变异菌株取代,从 而降低生产效率。 （4）丝状真菌菌体容易附着在器壁上生长以及在发 酵液内结团, 给连续发酵操作带来困难。
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谢谢大家！
The end
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其它重要技术
1 膜分离与发酵的耦合 膜生物反应器可以分为两类：第一类用膜保留培养物, 使 之悬浮于生物反应器中,不会因微滤或透析作用使细胞流 失。因而水流和培养物在反应系统中的持留时间各异。 第二类把生物催化剂固定在膜表面上或网格中或夹持在 两张膜的中间, 因此, 生物催化剂是不能运动的。 膜技术的优点：避免菌体丢失；排除有害代谢物,避免或 减轻产物的反馈抑制,从而使高密度细胞培养成为可能； 可以提高发酵中有机酸的产率, 乙醇、丙酮、丁醇发酵的 反馈抑制, 在基因工程菌的培养、超氧歧化酶生产、单克 隆抗体生产等方面都能达到较高的产率。
另外,不断的补料稀释, 对降低发酵液的粘度, 改善
流变学性质, 强化好氧发酵的供氧,也是十分有利的。
微生物发酵及工艺控制课件
• 基质的消耗速率 指单位时间、单位体 积发酵液中消耗的基质量，可表示为：
•
• 基质的消耗速率常以单位体积发酵液内 干菌体质量表示，称基质的比消耗速率， 以Qs表示
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• ms——以基质消耗表示的维持代谢系数（维持因数），维
持（M）是指活细胞群体在没有实质性的生长（即生长 和死亡处于动态平衡状态）和没有胞外代谢产物合成情 况下的生命活动。所需能量由细胞物质的氧化或降解产 生。这种用于“维持”的物质代谢称维持代谢，叫做内 源代谢（对好氧发酵称“呼吸”），代谢释放能叫维持 能。
被菌体利用后，会促使氢离子浓度增加，pH值下降。另一方面 水解酪蛋白和酵母粉等培养基成份，在其利用后会产生NH3，造成 培养液碱性。一些生理碱性物质（硝酸钠、氨基酸、尿素、 氨水等）被菌体利用后，将释放出游离NH3或生成碱使pH值上 升。
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➢ 溶氧量
氧是细胞呼吸的底物，氧浓度的变化对细胞影响很大，也反
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• 灌流式发酵（Perfusion fermentation）是指菌体与培
养液一起装入发酵罐进行培养，在培养过程中一方 面不断补充新培养基，同时取出部分条件培养液， 但菌体仍然滞留在发酵罐内。灌流式操作，能及时 除去有害的代谢产物，并补充营养物质，满足了菌 体进一步生长的需求。通过调节灌流速度，可把菌
控制流加式操作的形式有两种，即反馈控制 和无反馈控制。
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• 半连续式发酵(Semi-continuous fermentation)又称反
复分批式或换液式补料发酵。是指菌体和培养液一起 装入发酵罐，在菌体生长过程中，每隔一定时间取出 部分发酵培养物（行业中称为“带放”），同时补充 同等数量的新的培养基，然后继续培养，直到发酵结 束，取出全部发酵液。与流加式操作相比，半连续式 操作过程发酵罐内得到培养液总体积保持不变，同样 可起到解除高浓度基质和产物对发酵的抑制作用。
第十二章微生物发酵ppt
第十二章微生物发酵ppt
•四、微生物发酵的基本特征
发酵过程中环境条件的变化，不仅会影响菌种的
生长繁殖，而且会影响菌种代谢产物的形成。为了使发酵
过程能顺利进行，要随时取样，检测培养液中的细菌数目、
产物浓度，同时还要及时为发酵菌提供必需的营养，并严
格控制温度、pH、溶氧、通气量与转速等发酵条件。
第十二章微生物发酵ppt
• 五、分离提纯
发酵结束后，要对发酵液或生物细胞进行分离和提取精 制，将发酵产物制成合乎要求的产品。对发酵产品的 要求不同，分离提纯的方法也相应有些区别。利用发 酵工程生产的产品有菌种代谢产物和菌种本身（如酵 母菌和细菌）两大类，如果产品是菌种，分离方法一 般是通过过滤、沉淀从培养液中分离出；如果产品是 代谢产物，则采用蒸馏、萃取、离子交换等方法提取。 分离提纯后的产品，还要经过质量检查合格后，才能 成为正式产品。
年代，微生物学家开始用紫外线、激光、化学诱变剂等处理
菌种，使菌种产生突变，以筛选出符合要求的优良菌种。随
着细胞工程、基因工程等技术的日益成熟，科学家开始构建
工程细胞或工程菌，用它们进行发酵，甚至能生产出一般微
生物所不能生产的产品。
第十二章微生物发酵ppt
•二、菌种培养基的配制
培养基是选择出的菌种生活的环境，对菌种有多方面的影响， 所以至关重要。一般来说，培养基的配方要经过反复的实验才 能确定。另外，发酵工程中所用的菌种多要求是纯培养的，即 整个发酵过程不能混有杂菌，否则将导致产量大大下降，甚至 得不到产品。例如，如果青霉素生产过程中污染了杂菌，这些 杂菌会分泌青霉素酶，将形成的青霉素分解掉。因此，培养基 和发酵设备都必须经过严格的灭菌。
《微生物发酵》PPT课件
❖ 20世纪50年代，氨基酸发酵工业又成为微生物技术产业的又一个成员，实现了对微 生物的代谢进行人工调节，这又使微生物技术进了一步。
❖ 20世纪60年代，微生物技术产业又增加了酶制剂工业这一成员。
❖ 20世纪70年代，为了解决由于人迅速增长而带来的粮食短缺问题，进行了非碳水化 合物代替碳水化合物的发酵，如利用石油化工原料进行发酵生产，培养单细胞蛋白， 进行污水处理，能源开发等。
是以获得具有某种用途的菌体为目的的发酵。用于面包制作的酵母发酵及 用于人类或动物食品的微生物菌体蛋白发酵是比较传统的菌体发酵工业。 新的菌体发酵可用来生产药用真菌，如香菇菌、依赖虫蛹而生存的冬虫 夏草菌、与天麻共存的密环菌等药用菌。
2.微生物酶发酵
酶普遍存在于动物、植物和微生物中。因为微生物种类多、产酶的品种多、 生产容易和成本低等特点，所以目前工业应用的酶大多来自微生物发酵。
（2）无菌发酵，整个反应过程要求无菌。培养基无菌、空 气无菌、补料和取样要求无菌操作、某些工程菌，其尾 气也要求进行无菌处理。
（3）非连续性生产。微生物的生理特性决定了发酵过程的 非连续性，大部分的工业发酵是以间歇操作为基础进行 的，目前可以实现连续化生产的是啤酒的连续化生产。
编辑ppt
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第二节 工业发酵的工艺流程
生物发酵工艺多种多样，但基本上包括菌种的选育、菌种培 养基的配制、扩大培养和接种、发酵过程下游处理即分离提
纯等几个过程。
一、菌种的选育
找到合适的菌种是发酵工程的前提。人们最初是从自然界寻
找所需要的菌种，如谷氨酸发酵时常用菌有谷氨酸棒状杆菌
等。但这种方法得到的菌种，产量一般都比较低。20世纪40
年代，微生物学家开始用紫外线、激光、化学诱变剂等处理
《微生物发酵机理》课件
新型发酵工艺的开发
总结词
新型发酵工艺的开发是提高微生物发酵效率 和产物质量的关键手段，有助于降低生产成 本，实现可持续发展。
详细描述
随着生物技术的不断进步，新型发酵工艺如 固定化细胞技术、连续发酵技术、高密度发 酵技术等得到了广泛应用。这些新型发酵工 艺能够提高发酵效率、优化产物质量、降低 生产成本，为微生物发酵工业的可持续发展 提供了有力支持。
氨基酸代谢
氨基酸在微生物细胞内经过一系 列的生化反应，最终生成CO2、 NH3等产物的过程。
核苷酸代谢
核苷酸在微生物细胞内经过一系 列的生化反应，最终生成水、氨 、磷酸等产物的过程。
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微生物发酵过程控制
温度对微生物发酵的影响
温度对微生物发酵的影响是多方面的。在低温条件下，微生物的生长速率降低， 发酵过程变得缓慢；而在高温条件下，微生物细胞可能会受到损伤，导致发酵过 程受阻。因此，选择适宜的温度范围是微生物发酵过程控制的关键之一。
在适宜的温度范围内，温度的升高可以促进微生物的生长和代谢活动，提高发酵 效率。但温度过高可能会导致微生物细胞内的酶失活或细胞死亡，从而影响发酵 过程。因此，需要对温度进行精确控制，以获得最佳的发酵效果。
pH对微生物发酵的影响
pH是影响微生物发酵的重要因素之一。不同的微生物对pH 的要求不同，因此需要了解和控制发酵液的pH值，以满足微 生物的生长和代谢需求。
产物。
微生物发酵的应用
食品工业
用于生产面包、酒类、醋酸、 酸奶等食品。
医药工业
用于生产抗生素、维生素、酶 制剂等生物制品。
农业
用于提高土壤肥力、生物除虫 等。
环境治理
用于废水处理、土壤改良等环 境保护领域。
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微生物工程原理--发酵过程及控制 ppt课件
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九、染菌分析及控制
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（一）染菌原因分析
染菌的原因
归结起来是： • 设备、管道、阀门漏损、灭菌不彻底； • 空气净化不好； • 无菌操作不严或菌种不纯等。
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某发酵厂染菌现象的统计分析
1、种子带菌或怀疑种子带菌 9.64%
2、罐压跌零造成染菌
橄榄型青霉菌 橄榄型青霉菌 橄榄型青霉菌
温度（℃） C临界（m mol/升）
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（一）影响需氧和供氧的因素
影响微生物需氧量的因素 1、菌种 2、菌体浓度 3、菌龄 4、培养基
微生物对养料的吸收和对代谢产物的分泌 3、pH影响培养基中某些营养物质的可给性 4、pH可能改变培养基的氧化还原电位 5、pH会影响某些微生物的形态
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（二）、影响pH变化的因素： 1、菌种特性 2、培养基组成 3、发酵条件
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（三）、pH在发酵过程中的变化规律
在发酵前期，菌体生长缓慢，糖分解的少， 铵离子利用的也少，所以pH变化缓慢。
• 具有一定的亲水性，使消泡剂对气－液界面的分 散系数足够大，从而迅速发挥消泡活性；
• 在水中的溶解度必须小，以保持持久地消泡或抑 泡性能；
• 对人、畜及微生物无毒； • 不影响氧在发酵液中的溶解和传递； • 来源方便、广泛、价格便宜；
《微生物发酵技术》课件
现代微生物学技术的快速发展将为微生物
Hale Waihona Puke 生产高附加值的产品，推动其发展和应用。
发酵技术带来更多创新和突破。
选择适合的发酵模式和优化 培养条件，以提高产物产量 和品质。
成分控制
控制培养基的成分，包括碳 源、氮源和微量元素等，以 满足微生物生长需求。
反应过程控制
通过控制发酵过程中的温度、 氧气供应和搅拌等参数，优 化产物的生产。
微生物发酵技术的未来发展
1 现代微生物学技术在微生物发酵
技术中的应用
2 微生物发酵技术的未来趋势
《微生物发酵技术》PPT课件
微生物发酵技术
什么是微生物发酵技术？
• 概念：微生物发酵技术利用微生物的生物转化能力进行产物的生产与改良的技术。 • 历史：微生物发酵技术源远流长，可以追溯到数千年前的古代文明。
微生物发酵技术的应用
食品工业
微生物发酵技术在食品生产中起到重要作用，如酸奶、酒精、面包等食品的生产。
3 环保可持续
微生物发酵技术对环境友好，减少了化学合成过程中的排放和废弃物处理。
微生物发酵技术的基本原理
1 微生物代谢路径
微生物发酵过程中产生多种物质，通过微生物的代谢途径合成所需产物。
2 微生物生长环境要求
微生物的生长需要适宜的温度、pH值和营养物质等环境条件。
微生物发酵技术中的关键技术
模式选择、培养条 件控制
化学工业
微生物发酵技术被广泛应用于化工产品的生产，如酶、有机酸和溶剂等。
药品工业
制药工业依赖微生物发酵技术来合成抗生素、激素和疫苗等药物。
微生物发酵技术的特点
1 产物纯度高
微生物发酵技术可以获得高纯度的产物，满足不同行业对产品纯度的要求。
微生物发酵技术 PPT课件
• (4) 改变菌体的生化代谢而影响生长。 • 部分前体物有毒性，部分是由于溶解度 小。 • (二) 可以解除或减弱分解产物阻遏 • 部分合成酶受到易利用的碳或氮源的 阻遏，例如葡萄糖的分解代谢产物引起的 阻遏。 • (三) 可以使发酵过程最佳化
• • • • • •
二 补料的方式和控制 (一) 补料方式 连续流加、不连续流加(多周期流加)。 (二) 补料控制 1 有反馈控制 反馈控制系统：传感器、控制器和驱 动器。 • 直接方法：以限制性营养物浓度作为反 馈参数； • 间接方法：以溶氧、pH、呼吸商、排气 中的CO2及代谢产物浓度等为参数。
•
间接方法的例子：以CO2和pH为控制参 数。 • 2 无反馈控制 • 经验补料法。
第十一节 泡沫的影响及控制
• 泡沫(机械泡沫和流态泡沫)的危害： • 1 装料系数减小； • 2 增加染菌机率。 • 消泡方法：
• 1 机械消泡； • 2 消泡剂消泡。
• 1 泡沫保持恒定的水平； • 2 早期稳定下降，以后 恒定； • 蛋白质的消耗。 • 3 前期稍微降低，后又 回升；
• 一 温度对发酵的影响 • 1 影响各种酶反应的速率和蛋白质的性 质； • 菌体生长所需温度与产物合成温度不 一致(如青霉素)；温度不同还可能影响产 物合成的方向(如金霉素和四环素)。 • 2 影响发酵液的物理性质。(粘度、氧和 基质的溶解与传递、分解和吸收)
• • • • • • • •
二 影响发酵温度变化的因素 产热的因素： 1 生物热(Q生物) 与培养基成分和培养阶段有关。 2 搅拌热(Q搅拌) 散热的因素： 1 蒸发热(Q蒸发) 2 辐射热(Q辐射)
• (2) 摄氧率的变化 • 随菌浓增加，摄氧率不断增加，溶氧浓 度下降，菌浓至临界，溶氧至最低。 • (3) pH • 先下降后下升：利用葡萄糖产生酸，而 后再被利用。 • 先上升后下降：利用氨基酸的碳骨架， 剩下氨，而后氨又被利用。 • 限制性因素的出现，使菌体由生长向生 产转化。
第六章微生物发酵机理PPT课件
葡萄糖的分解途径主要有：EMP途径、HMP 途径、ED途径和PK途径等四种。
EMP途径将一分子葡萄糖转变成两分子丙酮酸 ；产生2分子ATP和2分子NADH。
HMP途径将一分子6-磷酸葡萄糖转变为1分子3磷酸甘油醛，3分子CO2和6分子NADPH。
ED途径将1分子葡萄糖转变为2分子丙酮酸，1分 子ATP，1分子NADPH和1分子NADH。
PK途径将1分子葡萄糖转变为1分子乳酸、1分子 CO2和一分子乙醇或乙酸。
பைடு நூலகம்10
EMP途径
乳酸
(12) +2H+
丙酮酸
ATP
葡萄糖
(1)
己糖激
A酶DP
葡萄糖-6-磷酸 (2)
乙醇
(14) 2NAD+
果糖-6-磷酸 ATP
Mg2+
磷酸果
(3) ADP
糖激酶 果糖-1，6-二磷酸
2CO2 (11)
烯醇式丙酮酸
4-磷酸赤藓糖 C4
6-磷酸果糖 C6
5-磷酸木酮糖 C5
3-磷酸甘油醛 C3
6-磷酸果糖 C6
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电子载体：
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH (nicotinamide adenine dinucleotide)，又称辅酶Ⅰ (Co Ⅰ)
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NADPH (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)， 又称辅酶Ⅱ (Co Ⅱ)
磷 酸 戊
3NADP+ 3NADP+3H+
6-磷酸葡萄糖脱氢酶
6-磷酸葡萄糖酸内酯(C6)×3
糖
6-磷酸葡萄糖酸(C6)×3
途
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微生物发酵实验指导生命科学学院2014年8月目录：第一部分碱性磷酸酶工程菌株的筛选及发酵条件优化实验一工程菌株的初筛实验二工程菌株的复筛实验三碱性磷酸酶活力的测定实验四生产菌株发酵条件的优化第二部分生物反应器的使用实验五发酵罐的构造实验六发酵罐参数的设置及控制实验七发酵罐的操作方法第三部分机械搅拌发酵罐发酵生产碱性磷酸酶实验八种子的制备实验九发酵罐培养实验十菌株生长曲线的绘制实验十一发酵过程中还原糖的测定注意事项：本实验内容涉及到分析化学、有机化学、生物化学、微生物学、发酵工艺学及化学过程等学科的基本实验操作，对学生综合实验能力要求较高。
学生在上课之前，应对相应内容进行复习。
本实验上课期间，希望同学们注意以下几点要求。
1．实验时，每个授课班级学生将分为4个小组。
各小组设组长一名，负责协调工作及实验工作分工。
在充分征求组员意见的基础上，分工一旦确定，组员必须服从工作安排，自觉、认真完成自己应负责工作。
2．该实验属开放性实验，所有实验内容必须由学生自己完成。
在同一时间内，每个小组内将进行不同的实验内容。
学生必须对实验内容非常熟悉，思路清晰，才能尽量减少失误。
因此学生要对实验内容进行预习。
3．本实验学生分组实验，学生要团结友爱，既要合理分工，也要互相合作，保证实验顺利完成。
每个小组实验数据共享，但数据处理过程不共享，否则将影响最后成绩。
4．实验需要使用仪器较多，共用小型仪器放于固定位置，不得随意搬动。
5．实验中要随时保持实验室及实验台面的清洁，以免发酵过程中污染。
6．实验过程中，蒸馏水用量较大，各组要轮流负责打水。
7．使用仪器必须按照教师指导进行，以免发生危险。
第一部分碱性磷酸酶工程菌株的筛选及发酵条件优化实验一工程菌株的初筛一、实验目的了解生产菌种筛选过程中初筛的意义。
二、实验原理碱性磷酸酶是一种底物专一性较低的磷酸单脂酶，在酶联免疫测定、非同位素探针、生物传感器、标记和测序方面有着重要的用途。
菌种筛选一般分初筛和复筛，前者以量为主，后者以质为主。
初筛可在培养皿或摇瓶中进行，优点是快速、直观、简便、工作量小，但测试条件与工业发酵时有很大差别，因此结果不一定可靠。
本实验将采用微孔板法对碱性磷酸酶工程菌株进行初筛。
三、实验材料1．菌株（1）阴性对照菌株：不含表达载体的E.coli BL21（教师提供）。
（2）阳性对照菌株：表达碱性磷酸酶的工程菌株（教师提供）。
（3）待测菌株：基因工程大实验构建获得的阳性工程菌株（学生自备）。
2．培养基（1）LB固体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂18g，水1000ml，pH 7.0。
121℃灭菌20min。
3．溶液（1）0.1mol/L碳酸盐缓冲液（pH10.0）：称取无水碳酸钠0.64g，碳酸氢钠3.4g，4-氨基安替比林0.15g，100ml蒸馏水定容。
（2）0.02mol/L磷酸苯二钠溶液：称取二水磷酸苯二钠0.51g，用80ml沸水溶解，冷却后定容至100ml，并加入0.5ml氯仿。
置4℃冰箱保存。
（3）铁氰化钾溶液：称取铁氰化钾0.25g，硼酸1.7g，各溶于40ml水中，将两种溶液混合后定容至100ml。
置4℃冰箱保存。
以上试剂置冰箱保存一般不超过一周，每次都尽量现配现用。
4．器材高压蒸汽灭菌锅，超净工作台，天平，电炉；烧杯，量筒，三角瓶，培养皿，微孔板，试管。
四、实验方法1．培养基制备：配制LB固体培养基200ml，分装于500ml三角瓶中，封口膜封口，灭菌。
2．灭菌：将配制好的LB固体培养基121℃灭菌20min。
将培养皿、牙签用报纸包好，121℃灭菌20min。
3．倒平板：将灭过菌融化的LB固体培养基冷却至50～60℃，以无菌操作法倒至已灭菌的培养皿中，每皿约20ml。
冷却凝固待用。
4．菌株活化：取保藏菌种划线接种于固体培养基平板，37℃培养24~48h。
5．初筛：将0.1mol/L碳酸盐缓冲液（pH10.0）50μL点样于微孔板中（对照孔加量为55μL），用灭菌牙签取阴性对照菌株、阳性对照菌株及待测菌株等量菌苔与缓冲液充分混匀，于37℃水浴5min。
再加入己预热的0.02mol/L磷酸苯二钠溶液50μL，37℃反应15min。
加入铁氰化钾溶液150μL，显色并终止反应。
重复二次（板）。
以红色深浅初筛磷酸酶产生菌。
6. 保存菌种：将初筛后表达活性较高的3株菌株划线转接至LB固体培养基平板上，37℃培养24～48h，待菌苔长好后，Parafilm膜封口，4℃保存。
实验二工程菌株的复筛一、实验目的1．学习发酵菌种的复筛方法。
2．2．从已分离到的微生物中找出具有工业应用前景的菌株。
二、实验原理复筛是对生产性能作较精确的定量测定工作。
复筛时应尽可能模拟工业生产条件，一般通过摇瓶培养对培养液进行精确的定量分析测定，所得的数据比较有说服力，但工作量较大。
为了尽可能使复筛条件与大生产相近，复筛培养基中应加入一些生产性原料。
三、实验材料1．菌株：实验一初筛得到的性能优良的碱性磷酸酶工程菌株。
2．培养基：复筛培养基（LB液体培养基）：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，水1000ml，pH 7.0。
121℃灭菌20min。
3．器材高压灭菌锅，超净工作台，天平，电炉；烧杯，量筒，三角瓶，移液管。
四、实验方法1．培养基制备：配制复筛培养基300ml，分装于250ml三角瓶中，每瓶30ml，共9瓶，6层纱布封口，灭菌。
2．摇瓶培养：挑取1环菌苔（或1个单菌落），转接于复筛培养基中（每株菌接3瓶），37℃，150r/min摇床培养24h。
3．菌株生产性能的测定：取下摇瓶，参照实验三方法对碱性磷酸酶活力进行测定，每瓶测三次，取平均值。
实验三碱性磷酸酶活力的测定一、实验目的1．掌握对硝基苯磷酸二钠法测定碱性磷酸酶活力的基本原理和方法2．从初筛所获得的菌株中筛选出碱性磷酸酶活力高的菌株二、实验原理碱性磷酸酶在碱性的环境下可以将对硝基苯磷酸二钠水解为游离磷酸及对硝基苯酚。
对硝基苯酚在强碱性条件下呈亮黄色，在405nm处有强烈的吸收峰。
因此可以根据405nm处的吸光值来计算产物对硝基苯酚的生成量，进而计算出碱性磷酸酶的活性。
三、实验材料1．粗酶液：实验二的摇瓶发酵液离心破壁后的上清液作为粗酶液。
2．试剂（1）对硝基苯磷酸二钠溶液（NPP）：p-NPP 5mmol/L，Tris-HCl（pH10.0）100mmol/L，MgCl2 1mmol/L。
（2）0.25mol/L NaOH溶液：称取10g NaOH溶于水，定容至1000ml。
121℃灭20min。
室温保存。
（3）磷酸盐缓冲液（PBS缓冲液）：称取NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4 1.42g，KH2PO4 0.27g，加水充分搅拌溶解，滴加盐酸调节pH至7.4，加水定容至1000ml。
121℃灭20min。
室温保存。
（4）碱性磷酸酶标准溶液：取碱性磷酸酶标准品1μL，加入99μL PBS缓冲液。
3．器材：分光光度计，恒温水浴锅，试管架，秒表；试管，移液管，烧杯，离心管。
四、实验方法1. 粗酶液的制备取实验二所得发酵液5ml离心（4℃，5000r/min，10min），弃上清；细胞沉淀加入500μL PBS缓冲液洗涤一次，离心（4℃，5000r/min，10min），弃上清；再加入500μL PBS缓冲液制备成细胞悬液；冰水浴超声波粉碎细胞（处理3s，间隔3s，共处理15min）；离心（4℃，5000r/min，10min），收集上清液即为粗酶液，备用。
2. 碱性磷酸酶活力测定按下列程序操作：试管A（空白）试管B（酶试样，需作三个平行试样）↓↓加NPP溶液1.00ml 加NPP溶液1.00ml↓37±0.2℃，5min ↓37±0.2℃，5min加酶标准溶液100μL（摇匀）加粗酶液100μL（摇匀）↓37±0.2℃，5min ↓37±0.2℃，5min加NaOH溶液150μL（摇匀）加NaOH溶液150μL（摇匀）↓↓测定A405 测定A4053. 碱性磷酸酶活力的计算酶活力单位的定义：在37℃下，每分钟水解对硝基苯磷酸二钠产生1μg对硝基苯酚所需的酶量定义为一个活力单位（U）。
式中：X—样品的酶活力，U/ml A405待测—待测样品平行试验的平均吸光度A405标准—标准品酶液的吸光度五、注意事项1. 温度与酶的反应速度密切相关。
温度相差1℃，就可使结果产生明显偏差。
此外反应时间5min也应精确控制至秒。
2. 酶液应该根据情况进行适当稀释。
3. 酶的稀释倍数对酶活力也有一定影响。
一般将稀释度控制在酶反应后的A405为0.2～0.8，吸光度过高或过低都可能带来测定上的误差。
实验四生产菌株发酵条件的优化一、实验目的1．了解发酵条件对产物形成的影响，用单因子试验找出筛选菌株的最佳发酵条件。
2．掌握发酵培养基的配制原则，熟悉用正交试验优化发酵培养基的方法。
二、实验原理发酵条件对产物的形成有着非常重要的影响，其中培养基pH、培养温度和通气状况是三类最主要的发酵条件。
培养基pH一般指灭菌前的pH，可以酸碱溶液调节控制，因发酵过程中pH会不断改变，所以最好用缓冲溶液来调节；通气状况可用培养基装量和摇床转速来衡量，封口纱布的厚度也会影响氧气的传递，一般以6～8层为好。
发酵培养基是指大生产时所用的培养基，一般碳源含量较高。
若产物含氮量高，还应增加培养基中氮源比例。
但必须注意培养基的渗透压，如果渗透压过高，会反过来抑制微生物的生长，可考虑以流加的方法逐步加入碳氮源。
工业发酵培养基与菌种筛选时所用培养基不同，以经济节约为主，一般选用廉价的农副产品为原料。
由于天然原料的组分复杂，不同批次的原料成分各不相同，因此发酵前必须进行培养基的优化试验。
本实验将对菌株的培养基配方进行优化。
三、实验用品1．菌种实验二筛选得到的碱性磷酸酶生产菌。
2．初始培养基：葡萄糖6g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 3g，Na2HPO4 0.05g，水1000ml。
pH7.0。
121℃灭20min。
3．器材摇床，高压灭菌锅；三角瓶，烧杯，移液管，试管。
四、实验方法1．培养基制备：分别在初始培养基中添加0.8%（W/V）的黄豆粉、玉米粉、可溶性淀粉和酵母膏作为主要氮源，配制发酵培养基，分装于250ml三角瓶，每瓶30ml，6层纱布封口，灭菌。
取13ml蒸馏水加入50ml三角瓶中，灭菌。
2．接种：挑取斜面菌苔13环接入13ml无菌水中，摇匀后用无菌移液管吸取1ml菌悬液，接到每一瓶培养基中。
37℃，150r/min摇床培养24h左右。
3．结果测定：参照实验三方法测定菌株在各培养基中培养后产生的碱性磷酸酶活力。