医学分子生物学 蛋白质的修饰与降解

利用电泳、免疫共沉淀、色谱、生物质 谱、生物信息学等方法，对修饰蛋白质及 修饰位点进行鉴定。
第二节
蛋白质的降解
蛋白质的降解途径
• 泛素-蛋白酶体通路：需能，高效、特异的 蛋白质降解过程，控制着动植物体内绝大 多数蛋白质的降解。
• 自噬-溶酶体：不需能量。主要降解细胞外 和细胞膜蛋白质
泛素-蛋白酶体系统
溶酶体
蛋白质的修饰
概念：是指蛋白质翻译后进行共价修饰加工的过程， 通过一个或几个氨基酸残基加上修饰基团而改变 蛋白质的性质。
目的：调节蛋白质的活性，使蛋白质结构更为复杂， 功能更完善。
蛋白质的修饰
• 磷酸化修饰 • 脂基化修饰 • 甲基化修饰 • 乙酰化修饰 • 类泛素化修饰 • 巴豆酰化修饰
一、磷酸化修饰
泛素化过程的关键酶
• 泛素激活酶E1：细胞只表达一种E1，将泛素转 移到泛素结合酶E2上；
• 泛素偶连酶E2：约50种，E2与许多E3作用； • 泛素连接酶E3：约1000种，直接或间接与底物
蛋白结合，促进泛素从E2的硫酯键转移到底物 蛋白上，作为被UPS识别和降解的靶向信号。
泛素化反应
1. 泛素的活化：以ATP为能量，将泛素C-端的羧基 连接到泛素活化酶E1的巯基上，形成一个泛素和 泛素活化酶E1之间的硫酯键。
• 大多数蛋白质通过26S蛋白酶体以ATP和泛素依赖 方式降解；11S-20S-11S,11S-20S-19S，PA20020S-19S以不依赖ATP和泛素的方式降解一些调节 蛋白、氧化蛋白及衰老蛋白。
泛素的结构与组成
• 泛素含有76个氨基酸残基, 广泛存在于真核生物， • 泛素的氨基酸序列极其保 守。 •泛 素 共 价 结 合 于 底 物 蛋 白 的赖氨酸残基上，将底物蛋 白进行泛素化标记而被UPS 特异识别并迅速降解。
分布广泛，人类有四种： SUMO1、SUMO2 、 SUMO3、 SUMO4
• SUMO1-3：在各个组织均表达 • SUMO4:在肾脏、淋巴结和脾脏表达
催化蛋白质SUMO化修饰的酶
SUMO化修饰需要多个酶参与： E1活化酶、E2结合酶、E3连接酶。
• SUMO化修饰中，E1和E2可使底物蛋白完成修饰。 • 但大多数SUMO化修饰仍需要E3连接酶的参与。 • E3连接酶并不与SUMO分子形成共价结合，但可以
2.一种蛋白质可以有一种以上的翻译后 • 在RNA聚合酶Ⅱ控制的基因表达过程中，
磷酸化和糖基化对RNA聚合酶Ⅱ起到了不 同的作用。 • 组蛋白乙酰化和甲基化共同修饰作用
八、蛋白质修饰的研究策略
尽管蛋白质翻译后修饰对其生物学功能 有着重要的作用，目前对其规模化研究受 到分析方法的限制。主要由于翻译后修饰 蛋白质的化学计量低，复杂性造成的。蛋 白质修饰类型及程度差别大，有的修饰转 瞬即逝。
蛋白质脂基化的生物学作用
• 脂基化蛋白相当于细胞信号转导的开关， 在信号转导方面发挥重要作用。
• 蛋白质脂基化增强蛋白质在细胞膜上的亲 和性，调节蛋白质的亚细胞定位、 蛋白质 的转运、 蛋白质之间的相互作用及蛋白质 的稳定性。
催化蛋白质脂基化的酶
• 棕榈酰基转移酶 该酶抑制剂具有抗肿瘤特性
• 法呢基转移酶 该酶抑制剂对正常细胞无毒性，对肿
1.蛋白质丝氨酸、苏氨酸激酶
• cAMP依赖的蛋白激酶（cAMP dependent protein kinase, PKA)
• Ca2+/磷脂依赖的蛋白激酶（Ca2+ /phospholipid dependent protein kinase, Ca2+ /PL-PK)或蛋白激 酶C (protein kinase C, PKC)
• Ca2+/钙调蛋白依赖的蛋白激酶（Ca2+ /calmodulin dependent protein kinaes, CaM-PK)
• cGMP依赖的蛋白激酶 (cGMP dependent protein kinase, PKG)
• DNA依赖的蛋白激酶（DNA dependent protein kinase, DNA-PK)
不依赖ATP和泛素的UPS组成
• 11S蛋白酶体激活因子（PA28或REG）因不 含ATPase活性，可不依赖ATP和泛素介导蛋 白酶体进行蛋白质降解。
• PA200是分子量为200kDa单体结构激活因子， 可激活蛋白酶体降解肽，而不能降解蛋白 质。
UPS的分类
• 三种激活因子与20S蛋白酶体至少可组成四种蛋白 酶体复合体：19S-20S-19S，11S-20S-11S,11S20S-19S，PA200-20S-19S
神经系统疾病发病机制中的作用
• Parkin是泛素和蛋白的E3连接酶，能与E2共同 作用；
• Parkin变性，影响某些蛋白降解，引起多巴胺 类神经元的毒性损伤而引起帕金森病。
2. 泛素活化酶E1将活化后的泛素通过交酯化反应传 递给泛素结合酶E2。
3. 泛素连接酶E3将E2上的泛素连接到靶蛋白上。 上述过程循环往复，靶蛋白可共价连接多个
泛素分子，然后被26S蛋白酶体降解。
泛素化调节和去泛素化调节
• 蛋白质本身提供特定的UPS识别信号。 • 泛素化信号通常被掩盖在正常蛋白质结构
结Байду номын сангаасE2和底物，促进SUMO由E2向底物转移。
SUMO化修饰的生物学意义
• SUMO化核内底物多数是转录调节因子，进行正调 控或负调控；
• 参与维持基因组的完整性及调节染色体凝集与分 离；
• 参与DNA修复过程； • 拮抗泛素的作用，避免蛋白质降解。 • 调节蛋白质核质转运及信号转导。
六、巴豆酰化修饰
中，蛋白质在天然状态下不被降解。 • 蛋白质正常结构出现变化或者受损，暴露
这些信号，就会被UPS发现。
UPS的生物学意义
• 通过降解错误的折叠、突变或者损伤的蛋 白质来维持细胞的质量。
• 通过降解关键的调节蛋白来控制细胞的基 本生命活动。例如生长、代谢、细胞凋亡、 细胞周期和转录调控。
泛素-蛋白酶体与疾病
• 蛋白质去磷酸化：蛋白质磷酸化逆过程由 蛋白磷酸酶催化，称为蛋白质去磷酸化。
细胞内30%蛋白质可被磷酸化和去磷酸化修饰。
蛋白质磷酸化的生物学作用
细胞信号传导、 神经活动、 肌肉收缩 及细胞增殖、 发育和分化等生理病理过程。 许多调控机制都涉及蛋白质的磷酸化修饰。
蛋白质磷酸化修饰生物学效应
• 增强或减弱被修饰蛋白质的酶活性或其他 活性；
概念： 是指在巴豆酰基转移酶催化下，在蛋白
质赖氨酸添加巴豆酰基的过程。
蛋白质巴豆酰化修饰的生物学意义
组蛋白赖氨酸巴豆酰化修饰与基因活化密 切相关，机制目前尚不清楚。
七、不同翻译后修饰的相互协调与影响
1.在细胞信号转导过程中存在多种蛋白质翻 译后修饰 脂基化修饰是蛋白质磷酸化的开端，磷 酸化修饰过程分别受到特定蛋白激酶调节， 是细胞信号转导过程的主体。
• 蛋白质酪氨酸磷酸酶 目前已发现30多种，1/3是跨膜蛋白质酪氨酸 磷酸酶，类似受体分子。2/3位于胞质，为非 受体型蛋白质酪氨酸磷酸酶。
蛋白激酶抑制剂和蛋白磷酸酶抑制剂
• 蛋白激酶和蛋白磷酸酶的活性均可被一些 小分子化合物抑制。
• 这些小分子化合物在疾病治疗或蛋白激酶 和蛋白磷酸酶的研究中具有重要的意义。
活性。 • 作用于PP2B的抑制剂：
抑制Ca2+依赖蛋白磷酸酶的活性
二、脂基化修饰
• 脂基化蛋白是一类膜蛋白，其特定的脂肪链修饰 可帮助这类蛋白质细胞膜上定位，协助该蛋白发 挥生物学作用。
• 蛋白质脂基化：长链脂肪酸通过O或者S原子与蛋 白质形成蛋白缀合物的过程，通常是蛋白质的半 胱氨酸残基被棕榈酰化，或者被法呢基化修饰。
2.蛋白质酪氨酸激酶
• 特异性催化蛋白质酪氨酸残基磷酸化的激 酶家族。
• 分为受体型PTK和非受体型 PTK。
3.双专一性蛋白激酶
• 同时自身磷酸化Tyr和Ser/Thr • 在信号级联反应中其重要作用
催化蛋白质去磷酸化的蛋白磷酸酶
• 蛋白质丝氨酸/苏氨酸磷酸酶 PP1、PP2A、PP2C、PPX等，亚细胞定位不同。
瘤细胞有抑制作用。
三、甲基化（protein methylation)修饰
概念：在甲基化转移酶催化下，甲基基团 由甲基S-腺苷甲硫氨酸转移至相应蛋白质 的过程。
甲基代替了氨基上的H原子，减少了氢 键的形成数量，甲基增加了空间阻力，影 响底物与蛋白质的相互作用。
蛋白质甲基化修饰的生物学作用
• 影响蛋白质之间的相互作用 • 蛋白质与RNA之间的相互作用 • 蛋白质的定位 • RNA加工 • 细胞信号转导
• 1980年前后Ciechanover A，Hershko A和 Rose Ⅰ发现了泛素-蛋白酶体系统 （ubiqutin-proreasomesystem，UPS）
• 2004年获诺贝尔化学奖 • UPS参与细胞内80%以上蛋白质的降解
UPS组成
有酶促活性的蛋白酶体 20S核心颗粒和蛋白酶体激活因子
白质特定位置上添加乙酰基的过程。
蛋白质乙酰化的生物学作用
• 组蛋白乙酰化调节基因转录 • 可实现对自噬过程的动态调控 • 调节代谢酶的活性及代谢通路
催化蛋白质乙酰化的酶
催化蛋白质赖氨酸乙酰化是乙酰基转移酶 。
五、类泛素化修饰
• 小泛素相关修饰物（small ubiquitin related modifier, SUMO)是类泛素家族重要成员；
• 蛋白激酶催化的磷酸基转移反应， • 是最常见，最重要的蛋白质翻译后修饰方
式之一。 • 在细胞信号转导过程中起重要作用。 • 1992年 Fischer EH和krebs EG 共同获诺
贝尔生理或医学奖。
蛋白质磷酸化和去磷酸化
• 蛋白质磷酸化：是通过蛋白激酶催化将ATP 或GTP的γ位磷酸基转移到蛋白质特定位点 上的过程。
• SUMO分子结构与SUMO化反应途径与泛 素类似，但功能不同；
• SUMO化修饰参与转录调控、核转运、维 持基因组完整性及信号转导等。
SUMO的结构
• 与泛素相同：一个β-折叠缠绕一个α-螺 旋球形折叠，C-端两个Gly残基。
• 与泛素区别：N-端有10-25个氨基酸的延伸， 表面电荷不同。
SUMO的分类
如：组蛋白甲基化影响异染色质形成、 基因印记和转录调控。
催化蛋白质甲基化的酶
• 催化蛋白质甲基化的酶是甲基转移酶； • 蛋白质主要在赖氨酸或精氨酸侧链氨基上
进行甲基化。 • 也有在天冬氨酸或谷氨酸侧链羧基上进行
甲基化。
四、乙酰化(protein acetylation）修饰
概念： 是指在乙酰基转移酶的催化下，在蛋
1.常见的蛋白酶抑制剂
• 作用于蛋白激酶ATP结合部位抑制剂： 该类抑制剂对PKA、PKC、PKG、MLCK、 CKⅠ 、CKⅡ、CAMKⅡ均有抑制作用。 是 应用最广泛的蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶抑 制剂。
• PTK的抑制剂
2.常见的蛋白磷酸酶抑制剂
• PP1和PP2A的抑制剂： 主要抑制丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶
第二部分 蛋白质的修饰与降解
研究意义
• 在完成肽链合成和折叠形成正确的空间构 象后，许多蛋白质还需要经过适当的化学 修饰，才能发挥正常的功能。
• 蛋白质修饰和降解在真核细胞生长和平衡 过程中发挥重要的作用。
原核细胞的结构特点
真核细胞的结构特点
滑面内质网 线粒体
粗面内质网 高尔基体
细胞核 核糖体
选择性降解短寿命的调节蛋白和损伤蛋白。 人体有三种蛋白酶体激活因子 19S（PA100）、11S（PA28或REG）和PA200。
ATP和泛素依赖的UPS组成
• 19S蛋白酶体激活因子结合20S蛋白酶体， 形成26S蛋白酶体。
• 细胞内大多数蛋白质泛素化后，都经26S蛋 白酶体进行降解。
26S蛋白酶体的结构
• 改变蛋白质的亚细胞定位； • 改变蛋白质与其他蛋白质或其他生物分子
的相互作用。
催化蛋白质磷酸化的蛋白激酶
最大的蛋白家族，有保守的催化核心 （250-300个氨基酸残基）和多种调控模式。 根据底物的磷酸化位点分为三类： • 蛋白质丝氨酸、苏氨酸激酶； • 蛋白质酪氨酸激酶； • 双专一性蛋白激酶
• 泛素体系酶突变导致功能丧失或目标底物 蛋白识别基序改变，而导致某种蛋白的稳 定变化。
• 目标蛋白功能不正常或加速降解的结果。
肿瘤发病机制中的作用
• 肿瘤可以起因于癌基因蛋白生长促进因子的稳 定或由于肿瘤抑癌基因的不稳定。
• 通过蛋白酶体降解的癌基因蛋白,如果不能及 时地从细胞中清除,就会诱导细胞恶变。