上海市重症急性呼吸道感染儿童中可检出多种型别的人腺病毒(新)

中华实验和临床病毒学杂志 ２０１６ 年 ２ 月第 ３０ 卷第 １ 期 Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊ Ｅｘｐ Ｃｌｉｎ Ｖｉｒｏｌ， Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１６，Ｖｏｌ畅３０，Ｎｏ畅１
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人腺病毒（ ＨＡｄＶ） 是美国学者 Ｒｏｗｅ 及其同事 于 １９５３ 年从人体的腺样组织中分离出来［１］ ，该病毒 属于腺病毒科（ Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ）， 哺乳动物腺病毒属 （Ｍａｓｔａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）， 是无包膜的单股双链线性 ＤＮＡ 病毒，包含 ＨＡｄＶ－Ａ 到 ＨＡｄＶ－Ｇ 共 ７ 个亚属 ６９ 个基 因型［２］ 。 其中 ＨＡｄＶ－１ ～ＨＡｄＶ－５２ 是根据血清中和 试验确定的血清型［３，４］ ， ＨＡｄＶ－５３ ～ＨＡｄＶ－６９ 是根 据全基因序列生物信息学分析确定的基因型［２，５］ 。
１ 材料与方法
１畅１ 检测样品 ２０１３ 年 ６ 月至 ２０１４ 年 ３ 月从上海 复旦大学附属儿科医院收集 ４４１ 份重症急性呼吸道 感染患儿（使用 ＷＨＯ 儿童疾病管理规划的肺炎和 重症肺炎的定义［８］ ，主要临床表现为发热、咳嗽、呼 吸短促或困难、咽喉痛及其他呼吸道感染症状） 的 鼻咽抽吸物。 每例患儿收集约 １ ｍｌ 呼吸道样品， ４℃存放不超过 ４８ ｈ，尽快运送至实验室，每份样品 每 ２００ μｌ 分装一管，存于 －７０℃。 １畅２ 核酸提取与病毒检测 使用 ＱＩＡａｍｐ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｖｉｒｕｓ Ｓｐｉｎ Ｋｉｔ（ ＱＩＡＧＥＮ，Ｇｅｒｍａｎｙ） 进行病毒全基因 提取，按照说明书进行操作，最终溶于 ８０ μｌ 洗脱缓 冲液。 选取部分六邻体（ ｈｅｘｏｎ） 基因作为基因分型 区，使用巣式 ＰＣＲ 的方法对 ＨＡｄＶ 进行分型检测与 基 因 多 态 性 分 析［９－１１］ 。 反 应 体 系 ２５ μｌ， １畅２５Ｕ
２ 结果
２畅１ 患儿基本特征 ４４１ 例 ＳＡＲＩ 患儿中男性 ２８１ 例（６３畅７％），女性 １６０ 例（３６畅３％），男女比为 １畅８ ∶ １。 中位年龄为 １Ｙ（０畅３Ｍ ～１４Ｙ），按年龄大小将患 儿分为（≤６Ｍ、７Ｍ ～≤１Ｙ、２ ～≤５Ｙ、 ＞５Ｙ） 四组，各 组分别有 １３９ 人、１２５ 人、１２０ 人及 ５７ 人。 ２畅２ 流行病学特征 共检出 ５１ 例 ＨＡｄＶ 感染者， 阳 性 检 出 率 为 １１畅６％ （ ５１ ／４４１， ９５％ ＣＩ ８畅６％ ～ １４畅６％），男性患儿检出率为 １２畅５％（３５ ／２８１），女性 患儿 检 出 率 为 １０畅０％ （ １６ ／１６０ ）， 不 同 性 别 患 儿 ＨＡｄＶ 的 检 出 情 况 差 异 均 无 统 计 学 意 义 （ Ｐ ＞ ０畅０５）。 年龄≤６Ｍ 组感染者 ８ 例，阳性率为 ５畅８％ （８ ／１３９）；７Ｍ ～≤１Ｙ 组阳性率为 １５畅２％（１９ ／１２５）； ２ ～≤５Ｙ 组阳性率为 １６畅７％ （２０ ／１２０）； ＞５Ｙ 组阳 性率为 ７畅０％（４ ／５７），以 ６Ｍ ～５Ｙ 患儿阳性率较高 （Ｐ ＜０畅０５）。 除夏季外其余三个季节 ＨａｄＶ 均有较 高检出率，尤以冬春季检出率较高，除 １２ 月份外各 个月份均有检出，且各个月份阳性检出率差异无统 计学意义（Ｐ ＞０畅０５）（结果未示）。 ２畅３ 分型分布特征 根据感染 ＨＡｄＶ 阳性样本靶 序列与各型别参考株核苷酸序列在进化树中的距离 （图 １），确定所感染 ＨＡｄＶ 所属型别（表 １）。 ２畅４ 临床表现 ５１ 例 ＨＡｄＶ 感染者中有 ４８ 例诊 断为肺炎，２ 例诊断为上呼吸道感染，１ 例为支气管 炎。 患儿主要表现为发热、咳嗽、喘息偶有腹泻症 状，且这些症状在感染者与非感染者中差异无统计 学意义（Ｐ ＞０畅０５）。
ＱＩＡｑｕｉｃｋ瞮 Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｇｅｒｍａｎｙ）进 行切胶回收，按照操作说明书进行回收纯化，回收产 物由上海生物工程有限公司进行序列测定。 应用 Ｓｅｑｕｉｎ 向基因库提交序列（ 序列号为：ＫＲ０２５７５１ ～ ＫＲ０２５７６８， ＫＲ０２５７７０ ～ ＫＲ０２５７８２， ＫＲ０２５７８４ ～ ＫＲ０２５７８８，ＫＲ０２５７９０ ～ ＫＲ０２５８０４），使用 Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ 软件将结果与 ＧｅｎＢａｎｋ 上公布的与呼吸道感染相 关的 ＨＡｄＶ 序列进行比对，经 Ｂｉｏｅｄｉｔ 软件裁齐序列 后，使用 ＭＥＧＡ ５畅０ 软件进行进化分型分析。 １畅４ 统计学方法 使用统计学分析系统 ＳＡＳ９畅２ 进行统计学分析，基本的流行病学特征使用 χ２ 检验 进行分析，Ｐ ＜０畅０５ 为差别有统计学意义。
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｔｙｐｉｎｇ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｍｏｎｇ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ｗｉｔｈ ｓｅｖｅｒｅ ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ （ ＳＡＲＩ ） ｉｎ Ｓｈａｎｇｈａｉ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａ ｔｏｔａｌ ｏｆ ４４１ ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ａｓｐｉｒａｔｅｓ （ＮＰＡｓ） ｗｅｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｈｏｓｐｉｔａｌｉｚｅｄ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ｗｉｔｈ ＳＡＲＩ ｉｎ Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ Ｆｕｄａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｆｒｏｍ Ｊｕｎｅ ２０１３ ｔｏ Ｍａｒｃｈ ２０１４．Ｈｕｍａｎ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｙｐｉｎｇ ｂｙ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎｄ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｗａｓ ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｆｒｏｍ ４４１ ｈｏｓｐｉｔａｌｉｚｅｄ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ｗｉｔｈ ＳＡＲＩ， ５１ ｏｆ ｓａｍｐｌｅｓ （１１畅６％， ９５％ ＣＩ： ８畅６％ ～１４畅６％） ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ａｓ ＨＡｄＶ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｍｏｓｔ ｏｆ ｔｈｅ ＳＡＲＩ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ｗｉｔｈ ＨＡｄＶ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ ｂｅｔｗｅｅｎ ０畅５ ｔｏ ５ ｙｅａｒｓ ｏｌｄ．Ｔｙｐｉｎｇ ｄａｔａ ｓｈｏｗｎ ｔｈａｔ ＨＡｄＶ－Ｂ （１７ ｏｆ ＨＡｄＶ－３， １６ ｏｆ ＨＡｄＶ－７） ｗａｓ ｍｏｓｔ ｄｏｍｉｎａｎｔ ａｓ ６４畅７％ （３３ ／５１），ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ＨＡｄＶ－Ｃ ａｓ ２７畅５％ （１４ ／５１）； ｅｉｔｈｅｒ ＨＡｄＶ－Ｄ （ＨＡｄＶ－ ８） ｏｒ ＨＡｄＶ－Ｅ （ ＨＡｄＶ－４ ） ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ｏｎｌｙ ｏｎｅ ｃａｓｅ， ａｎｄ ＨＡｄＶ－Ｆ （ ＨＡｄＶ－４１ ） ｆｏｕｎｄ ｉｎ ｔｗｏ ｃａｓｅｓ． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｐｅｃｉｅｓ（Ｂ－Ｆ）ｏｆ ＨＡｄＶｓ ｗｅｒｅ ｃｉｒｃｕｌａｔｅｄ ａｍｏｎｇ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ｗｉｔｈ ＳＡＲＩ ｉｎ Ｓｈａｎｇｈａｉ， ａｎｄ ＨＡｄＶ－Ｂ （ＨＡｄＶ－３， ＨＡｄＶ－７） ｗａｓ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．
ＦａｓｔＳｔａｒｔ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ， １０ ×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ，
２ｍｍｏｌ ／Ｌ ＭｇＣｌ２ （ Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．， Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ ）， ２００ μｍｏｌ ／Ｌ ｄＮＴＰｓ （ 日 本， ＴａＫａＲａ 公司），０畅５ μｍｏｌ ／Ｌ 引物（ 大连宝生物工程 有限公司合成），５ μｌ 基因组提取液（ 第一轮） 或 ２ μｌ 的第一轮 ＰＣＲ 产物（ 第二轮）。 反应条件同参考 文献［９，１０］。 第一轮 ＰＣＲ 产物大小为 １ ００４ ｂｐ，第 二轮为 ９５６ ｂｐ。 １畅３ 分型分析 对检测阳性的内侧 ＰＣＲ 产物使用
【 主题词】 重症急性呼吸道感染；儿童；人腺病毒；分型检测 基金项目：传染病防治重大专项（２０１３ＺＸ１０００４６０１，２０１３ＺＸ１０００４－１０１）
Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｔｙｐｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｍｏｎｇ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ｗｉｔｈ ｓｅｖｅｒｅ ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｌｉ Ｙａｍｉｎ，Ｌｉｕ Ｇａｏｓｈａｎ，Ｚｈｏｕ Ｗｅｉｍｉｎ，Ｚｈａｏ Ｙａｎｊｉｅ， Ｌｉ Ｙｕｃｈｕａｎ， Ｓｈｅｎ Ｊｕｎ，Ｔａｎ Ｗｅｎｊｉｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ； Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｖｉｒａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，Ｃｈｉｎａ ＣＤＣ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １０２２０６，Ｃｈｉｎａ（Ｌｉ ＹＭ， Ｌｉｕ ＧＳ， Ｚｈｏｕ ＷＭ， Ｚｈａｏ ＹＪ， Ｔａｎ ＷＪ）； Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ Ｆｕｄａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０１１０２， Ｃｈｉｎａ（Ｌｉ ＹＣ， Ｓｈｅｎ Ｊ） Ｌｉ Ｙａｍｉｎ ａｎｄ Ｌｉｕ Ｇａｏｓｈａｎ ａｒｅ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ａｕｔｈｏｒｓ ｗｈｏ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｄ ｅａｑｕａｌｌｙ ｔｏ ｔｈｅ ａｒｔｉｃｌｅ Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ： Ｔａｎ Ｗｅｎｊｉｅ，Ｅｍａｉｌ：Ｔａｎｗｊ２８＠１６３．ｃｏｍ；Ｓｈｅｎ Ｊｕｎ，Ｅｍａｉｌ：ｅｃｈｏｓｈｅｎ１１＠１６３．ｃｏｍ
【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】 Ｓｅｖｅｒｅ ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ； Ｃｈｉｌｄｒｅｎ；Ｈｕｍａｎ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ；Ｔｙｐｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｆｕｎｄ ｐｒｏｇｒａｍｓ： Ｓｔａｔｉｓｅａｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ Ｃｈｉｎａ （ ２０１３ＺＸ１０００４６０１， ２０１３ＺＸ１０００４ －１０１）
ＤＯＩ：１０畅３７６０ ／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．１００３－９２７９畅２０１６畅０１畅００３