分子荧光
分子荧光分析
2 共扼效应 因为: 共扼程度越大, * 与之间的能级差越小,就越利于基态电子 被激发. 所以大多数能产生荧光的物质都具有共扼结构，如芳环等.
0.18
0.61
荧 光 效 率 增 大
0.93
3 刚性平面结构: 可以减小面外振动,减小与溶剂或其他溶质的 相互作用.减小能量以非光能方式损失.
HO OH
分子荧光分析
1. 发射光谱分析
样品池 + 光源
1
2. 吸收光谱分析
2
样品池
1
1
第一节 基本原理
一、分子荧光的产生 先知道分子能级的单重态和多重态 能级的多重度 M = 2S + 1 (S为自旋量子数代数和) 同轨道上的一对电子：
自旋方向相反S = 0, M=1表示能级为单重态 (S);
自旋方向相同S = 1, M=3表示能级为三重态 (T)。
HO
O
OH
O O
O O
酚酞
荧 光 素
4 取代基效应: 接在苯环上的给电子基团使处于基态的电子数 增多,电子跃迁的几率增大, 使荧光增强.
五荧光物质的浓度与荧光强度的关系 ——定量分析理论依据
荧光效率
=发射荧光量子数/吸收光量子数
不是所有被激发的分子都可以发射荧光，能发射荧 光的实际分子数相对于被激发分子的总数之比叫荧光效 率。
荧光效率决定荧光强度If
=Ia =Io -It =Io （1-e-ε lc）
Io: 激发光强度
If =2.3Iolc =Kc
荧光强度If与激发光强度和溶液浓度成正比，此关 系只有在极稀溶液条件下才成立.
六、荧光猝灭
荧光分子与溶剂分子或其他分子相互 作用引起荧光强度降低的现象称为荧光猝 灭。 包括： 碰撞猝灭，能量转移等。
分子荧光基本原理
分子荧光基本原理分子荧光是一种分子从高能级激发态返回到低能级基态时发出的光。
分子荧光主要是由于分子在受到激发后，电子跃迁至激发态，再回到基态时放出荧光。
这个过程是通过分子的内部结构和电子态之间的相互作用完成的。
分子荧光的基本原理可以通过分子的能级结构来解释。
在分子内部，存在着不同的能级，分别是基态、激发态、离子态等。
当分子受到能量输入（如光或热激发）时，电子可以跃迁到激发态。
在这个过程中，分子吸收能量，电子跃迁至高能级的激发态。
然后在一个相对较短的时间内，电子会从激发态返回到基态。
在这个过程中，分子释放出多余的能量，产生出发光。
这就是分子荧光的基本原理。
分子荧光的发生与能级结构有着密切的关系。
分子内部的能级结构是由分子的内部结构和分子轨道的排列规则来决定的。
在分子中，电子分布在不同的分子轨道上，这些轨道间的跃迁会导致分子的吸收和发射光谱。
当分子受到激发后，电子会占据一个比较高的能级的激发态。
随后，电子会通过辐射的方式返回到基态，释放出比较低能量的光子。
这个过程中，光子的波长和分子的能级结构有直接的关系。
分子的内部结构和键合方式也会影响分子的荧光性质。
比如，共轭结构的分子通常会表现出较强的荧光性质，因为共轭结构可以增加分子的π电子系统，加强分子的电子跃迁和荧光的产生。
此外，分子的溶剂环境也会影响分子的荧光性质。
在极性溶剂中，分子的电子态和能级结构会发生改变，从而改变了分子的光谱性质。
分子荧光的原理也可以应用于分析化学和生物化学领域。
分子荧光是一种非常敏感的检测技术，可以用于分析样品中的分子结构、浓度、和环境条件。
比如，荧光标记法可以用于追踪生物分子在细胞中的位置和运动。
利用分子的荧光性质，可以研究生物分子的相互作用、变化、和代谢过程。
此外，分子荧光也可以应用于环境监测和药物研发等领域。
总之，分子荧光是一种由分子内部结构和能级结构决定的发光现象。
分子在受到激发后，通过电子跃迁回到基态时释放荧光，这一过程受分子的结构、能级结构、溶剂环境等因素的影响。
分子荧光的原理及其应用
分子荧光的原理及其应用摘要分子荧光是指分子吸收能量后在辐射过程中发出荧光的现象。
本文将介绍分子荧光的原理和机制，并从应用的角度探讨其在化学、生物学和材料科学中的重要性和应用潜力。
1. 荧光原理荧光是一种电磁辐射现象，当分子在吸收能量（通常是光）后，激发态的分子会经过非辐射跃迁返回基态，释放出一个荧光光子。
荧光光子的能量通常低于吸收的能量，这是因为在非辐射跃迁过程中，分子会损失一部分能量。
荧光是一种快速发生的现象，辐射寿命通常在纳秒量级。
2. 荧光机制荧光的发生需要满足以下几个条件： - 分子必须能够吸收能量并进入激发态； - 分子的激发态必须具有较长的寿命，使得非辐射跃迁发生； - 分子的激发态能够发生与基态不同的电子构型。
3. 分子荧光的应用领域3.1 化学分析荧光分析技术已经在化学分析领域得到广泛应用。
通过使用荧光探针，可以实现对化学样品中目标分子的高灵敏度和高选择性检测。
例如，荧光染料可以用于生物分子的定量分析，如DNA、蛋白质、细胞等。
3.2 生物学研究在生物学研究中，分子荧光技术广泛应用于结构和功能的研究。
荧光标记的生物分子可以通过荧光显微镜观察、跟踪和定量化，用于研究细胞、生物分子相互作用、细胞信号传导等过程。
此外，基于荧光的流式细胞仪也可以用于细胞分析和分选。
3.3 材料科学分子荧光在材料科学中的应用也引起了广泛的兴趣。
研究人员利用荧光材料制备出具有特殊功能的材料，如荧光传感器、荧光显示器、荧光标记纳米颗粒等。
这些荧光材料可以用于检测色素、金属离子、环境中的有害物质等，具有重要的环境和生化分析应用价值。
4. 总结分子荧光是一种重要的物理现象，具有广泛的应用潜力。
在化学分析、生物学研究和材料科学等领域，荧光技术正在发挥着重要作用。
进一步的研究和应用将使我们能够更好地理解分子荧光机制，并开发出更多的创新应用。
注：本文为示例，内容仅供参考。
实际撰写时，请结合相关文献和资料进行阐述，并详细描述分子荧光的各个方面。
分子荧光和原子荧光
分子荧光和原子荧光一、引言荧光是一种在物质受到激发后发出的可见光的现象。
在分子和原子中，荧光是由电子从高能级跃迁到低能级而发出的光。
本文将介绍分子荧光和原子荧光的基本原理、应用和区别。
二、分子荧光1.基本原理分子荧光是由分子中的电子跃迁引起的。
当分子受到能量激发后，电子从基态跃迁到激发态，这个过程称为激发。
随后，电子从激发态返回到基态，释放出光子，即发出荧光。
分子荧光的波长通常在可见光范围内。
2.应用分子荧光广泛应用于生物、材料、环境等领域。
例如，生物荧光染料可以用于细胞成像、蛋白质检测等。
此外，分子荧光还可以用于材料的荧光标记和传感器的制备。
3.区别分子荧光具有以下特点：(1)分子荧光的波长通常在可见光范围内，可以直接观察到；(2)分子荧光受到分子结构和环境的影响较大，不同分子的荧光性质有所差异；(3)分子荧光发生在分子中，可以同时存在多个发光中心。
三、原子荧光1.基本原理原子荧光是由原子中的电子跃迁引起的。
当原子受到能量激发后，电子从基态跃迁到激发态，这个过程称为激发。
随后，电子从激发态返回到基态，释放出光子，即发出荧光。
原子荧光的波长通常在紫外光或可见光范围内。
2.应用原子荧光在分析化学中有广泛应用。
例如，原子荧光光谱法可以用于金属元素的分析和检测。
此外，原子荧光还可以用于材料表征和环境监测等领域。
3.区别原子荧光具有以下特点：(1)原子荧光的波长通常在紫外光或可见光范围内，需要使用特定的仪器进行检测；(2)原子荧光受到原子结构和激发方式的影响，不同元素的荧光性质有所差异；(3)原子荧光发生在原子中，每个原子只有一个发光中心。
四、分子荧光与原子荧光的比较1.波长范围分子荧光的波长范围通常在可见光范围内，而原子荧光的波长范围通常在紫外光或可见光范围内。
2.影响因素分子荧光受到分子结构和环境的影响较大，而原子荧光受到原子结构和激发方式的影响。
3.发光中心分子荧光发生在分子中，可以同时存在多个发光中心，而原子荧光发生在原子中，每个原子只有一个发光中心。
分子荧光分析法
能发射荧光物质条件： ①物质分子在紫外-可见光区有较强吸收的特定结构。 ②分子必须有较高的荧光效率。 ③Фf=发射荧光的量子数/吸收激发光的量子数
第五章 分子荧光分析法
2.分子结构与荧光的关系 （1）共轭双键结构：芳环杂环化合物，含共轭双键
脂肪烃π-π激 （2）分子的刚性平面：效应增加，可使荧光效率增
标作图E荧-λ激 （2）荧光光谱：固定入激以λ荧为横坐标，E荧纵坐
标作图E荧-λ荧
第五章 分子荧光分析法
4．激发光谱和荧光光谱的关系： （1）荧光发射光谱不随激发波长而改变。只强度改
变。因此荧光光谱只有一个谱带。 （2）激发光谱和荧光光谱呈现镜像对称关系。
第五章 分子荧光分析法
二、分子结构与荧光关系
第五章 分子荧光分析法
2．荧光的产生：分子跃迁到较高能级后，以无辐射 跃迁的形式下降到第一电子激发态的最低振动 能级，以光的形式放出所吸收的能量，由第一 电子激发态的最低振动能级回到基态各振动能 级，这种光称为荧光。
3．激发光谱和荧光光谱：是定性和定量分析的基础 （1）激发光谱：固定入荧以λ激为横坐标，E荧纵坐
第五章 分子荧光分析法
第一节 基本原理
一、分子荧光的发生过程
1ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ分子的激发态 （1）去活化过程：当分子吸收一定能量后，处于激
发态的分子不稳定，其电子以辐射跃迁或无辐射 跃迁释放出多余的能量回到基态，这个过程为分 子去活化过程。 （2）单线态：分子受辐射激发时，电子从最高占有 轨道跃迁到较高空轨道，受激电子自旋仍保持方 向相反，称激发单线态。 （3）三线态：受激电子自旋方向反转，电子自旋为 平行时是激发三线态。
构造：激发光源——单色器——样品池——单色 器——检测器等四部分
分子荧光
激发光谱与发射光谱之间的波长差值。用波数表示。
●Stokes荧光（溶液中） λ荧＞λ激 可能 ●Antistokes荧光（高温稀薄气体中） λ荧＜λ激 ●共振荧光（气体、晶体中） λ荧=λ激
b.发射光谱的形状与激发波长无关
c. 镜像规则
通常荧光发射光谱与激发光谱形状一样,成镜像对称关 系。 （能层结构相似性） 2014-4-25
缓慢。
2014-4-25
溶解氧
水体污染、有机物增多 好氧菌繁殖 把溶解氧作为水质污染程度的
一项指标。溶解氧越少，表
明污染程度越严重。
耗氧速度＞氧补给速度
缺氧条件下发生腐败发酵现象
水中溶解氧量下降
2014-4-25
基于荧光熄灭原理的溶解氧测定仪
2014-4-25
2014-4-25
2014-4-25
2014-4-25
2014-4-25
激发光谱 、荧光光谱
注意：１、实际测得的荧光光谱和激发光谱随仪器而异,其真实光 谱必须要对其光源、单色器、检测器的光谱特性加以校正 2014-4-25 ２、真实的激发光谱与吸收光谱非常近似，而不是相同
三维荧光光谱
2014-4-25
蒽的激发光谱
2014-4-25
蒽的发射光谱
激发光谱与发射光谱的关系
分子被激发时的散射问题
激发光的能量太低、不足以外层电子跃迁到 S1 但仍可将电子激发至基态的高振动能级上 受激后能量无损失, 受激发后有能量改 瞬间(10-12) 返回原 变,返回原来稍高 能级 在不同方向上发射与原激 发光相同波长λ1的辐射 或稍低能级上 不同方向伴随的波长 发射为 λ1±Δλ
特征：
芴 联苯
2014-4-25
卫生化学笔记：分子荧光分析法
分子荧光分析法物质吸收外界能量后，其电子能级由基态跃迁到激发态，物质的激发态分子以无辐射跃迁的形式释放能量，之后降至第一电子激发单线态的最低振动能级，并以光的形式释放能量回到基态的各个振动能级，此时，分子发射的光即称之为荧光分子荧光分析法：通过测定物质分子所发射荧光的特征和强度，对物质进行定性和定量分析的方法。
（一）基本原理一、分子荧光的产生1. 单线态：当物质处于基态时,电子成对地填充在能量最低的各轨道中，一个给定轨道中的两个电子具有相反的自旋（自旋量子数S分别为1/2和 -1/2），即总自旋量子数S为0，分子中电子能级的多重度M=2S+1=1。
此种状态称为单线态。
• 激发单线态：当物质受到光照射，吸收紫外光或可见光时，物质分子内可发生电子能级的跃迁。
若吸收能量后电子在跃迁过程中不发生自旋方向的变化，即总自旋量子数S为0，分子中电子能级的多重度为1。
则该分子所处的能级状态称为激发单线态。
• 激发三线态：当物质受到光照射，吸收紫外光或可见光时，物质分子内可发生电子能级的跃迁。
若吸收能量后电子在跃迁过程中还伴随自旋方向的变化，即分子具有两个自旋平行的电子，其总自旋量子数S为1，分子中电子能级的多重度M=2S+1=3，则该分子所处的能级状态称为激发三线态。
2. 振动弛豫：同一电子能级内的荧光物质分子与溶剂分子相碰撞，以热能量交换的形式由高振动能级至低振动能级间的跃迁。
3. 内部转移：两个电子能级非常接近时，电子从较高电子能级以非辐射跃迁形式转移至较低电子能级，此过程称为能量的内部转移。
4. 荧光发射：处于激发单线态的电子经过振动弛豫和能量内部转移，回到第一电子激发单线态的最低振动能级，以辐射的形式回到基态的各个振动能级，此过程称为荧光发射。
5. 系间跨越：受激发分子的电子在激发态发生自旋反转，使分子的多重态发生变化的过程。
由第一激发单线态（S1）跃迁至第一激发三线态（T1），使原来两个自旋配对的电子不再配对。
第三章 分子荧光光度法
测器，检测方向与激发光成直角。
由光源发射的光经激发单色器得到所需的激发波 透光强度为I；荧光物质被激发后，发射荧光F。 为消除入射光的影响，荧光测量通常在与激发光 成直角的方向上进行。
长I0，经样品池后，一部分光能被荧光物质吸收，
第二发射单色器的设置是为了消除可能共存的
其它光线的干扰，如散射光以及溶液中其它杂 质所发生的荧光，以获得所需要的荧光，让其 作用于检测器上，得到相应的电信号，经放大 后作记录。 §3-5 分子荧光光度法的特点及应用
一.荧光光度法的特点 1.灵敏度
与紫外—可见光度法比较，荧光法检测是在
黑背景下进行，所以其灵敏度要高出2∼4个
数量级，测定下限为0.1∼0.001g/mL。
2.选择性强
荧光法既能依据特征发射又能依据特征吸收
来检定物质。如某几个物质的发射光谱相
似，则可从激发光谱的差异来区分；而如果
它们的激发光谱相同，则可通过发射光谱将
激发光谱和荧光发射
光谱的特点：
(1)荧光发射光谱与激
发波长无关，如前所述，
无论引起物质激发的波
长是1还是2，但荧光
发射波长都为3。
这是由于分子吸收了不同能量的光子可由基 态激发到不同的电子激发能级而产生几个吸收
带；由于较高激发态可通过内转换及振动弛豫
回到第一激发态的几率很高，远远大于由高能
决定于第一电子激发态中各振动能级的分布状况；
三．荧光和分子结构的关系 产生荧光的分子必须具备下列条件： (一)物质分子必须具有与所照射的光辐射相同频
率的吸收结构，才能吸收激发光。
(二)吸收了与其本身特征频率相同的能量之后， 必须具有一定的荧光效率。 荧光效率也称为荧光量子产率，表示物质发 射荧光的本领，为发出荧光量子数和吸收激发 光量子数的比值。
分子荧光光谱的产生
分子荧光光谱的产生
分子荧光光谱是通过激发分子使其达到激发状态，然后通过一定的方法使其回到基态时产生的。
这个过程涉及到分子内部的电子跃迁，因此可以提供关于分子结构和性质的重要信息。
以下是分子荧光光谱产生的基本过程：
1. 激发：首先，分子通过紫外线、可见光或者其他形式的能量激发，使其内部的电子从基态跃迁到激发态。
这个过程通常由紫外-可见光谱仪完成。
2. 能量传递：激发态的分子不稳定，会迅速回到基态。
在回到基态的过程中，分子的能量会传递给其他的分子或原子，这个过程被称为能量传递。
3. 荧光发射：能量传递后，剩下的能量会以光的形式发射出来，这就是荧光。
荧光的颜色取决于分子的性质，通常与激发光的波长不同。
4. 检测：最后，荧光通过荧光光谱仪进行检测，得到的就是分子荧光光谱。
通过分子荧光光谱，可以了解到分子的许多信息，如分子的结构、性质、浓度等。
因此，分子荧光光谱在化学、生物学、医学等领域有着广泛的应用。
分子荧光的定性分析原理
分子荧光的定性分析原理
分子荧光定性分析是一种用于确定化合物是否具有荧光性质的方法。
荧光是指分子吸收光能后发出的短波长光。
以下是分子荧光定性分析的原理：
1. 激发：荧光分析通常需要先将化合物激发到一个能级，使其能够吸收能量。
通常使用紫外光或可见光来激发化合物。
这个能级通常对应着化合物的电子跃迁。
2. 吸收：化合物吸收光能后，电子从基态跃迁到激发态能级。
这个激发态能级通常是一个高能量、不稳定的能级。
3. 跃迁：电子在激发态能级上停留的时间很短，随后会再次跃迁到较低的能级。
在这个过程中，荧光光子被释放出来。
光子的能量通常比激发光的能量低，对应着较长波长的光。
4. 发射：荧光光子的发射可以通过荧光光谱来观察。
荧光光谱通常是一个峰状曲线，波峰对应着荧光发射的波长。
通过比较样品的荧光光谱与已知荧光性化合物的光谱，可以确定样品是否具有荧光性质。
5. 荧光颜色：荧光发射的波长与化合物的结构密切相关，不同化合物具有不同的荧光颜色。
因此，荧光颜色也可以用来进行分子荧光定性分析。
需要注意的是，分子荧光定性分析只能确定一个化合物是荧光性还是非荧光性，
并不能提供关于分子结构和化合物量的定量信息。
为了进行准确的分子荧光定性分析，通常需要使用荧光光谱仪或相关的仪器。
分子荧光分析
荧光光谱:固定激发光波长和强度，而让物质发出
的荧光通过单色器测定不同波长的荧光强度。以
荧光的波长〔λ〕为横坐标，荧光强度〔IF〕为
纵坐标作图，便得荧光光谱。
蒽的激发光谱和荧光光谱
硫酸奎宁的激发光谱和荧光光谱
影响荧光发光的因素
分子构造影响荧光发光
分子产生荧光的条件 ：
①物质必须具有能吸收一定频率紫外光的特定 构造；
NH3
NH2
NH
OH H
OH H
pH<2 无荧光
7~12 蓝色荧光
>13 无荧光
定量分析方法
校准曲线法：以量的标准物质，按试样一样 方法处理后，配成一系列不同浓度的标准
溶液1，.校在准仪器曲调线零法后：再以浓度最大的标准 溶后测液2出作.标其基准他准标，对准调照溶节法液荧:的光相强对度荧读光数强为度10和0；空然 白溶3液．的多相组对分荧混光合强物度；的扣荧除光空分白析值:后，
以荧光强度为纵坐标，标准溶液浓度为横 坐标，绘制标准曲线；然后将处理后的试 样配成一定浓度的溶液，在同一条件下测 定其相对荧光强度，扣除空白值后，从校 准曲线上求出其含量。
分子荧光分析法在医学检验中的应用
尿液中的色胺的测定
尿中色胺的含量是色氨酸代谢的 一个标志。色胺有天然荧光，激发峰 285nm，荧光峰360nm。把尿或组织液 的色胺萃取出来，就可直接检测。在 0.1~8μg/15mL范围内，荧光强度与色 胺浓度呈线性关系。
2 苯环上取代基的类型：
给电子基团。如-OH、-NH2常使荧光增强。
与π电子体系互相作用较小的取代基。如-SO3H对 分子荧光影响不明显。
吸电子基团如-COOH、-CO减弱甚至破坏荧光。
3 具有刚性平面构造的分子：
分子荧光的名词解释
分子荧光的名词解释近年来，分子荧光作为一种广泛应用于科学研究和实际应用中的技术手段，越来越受到人们的关注。
作为一种物理现象，分子荧光在化学、生物学、医学以及材料科学领域中扮演着重要的角色。
在本文中，我们将对分子荧光的定义、原理和应用进行详细解释。
首先，让我们来解释一下分子荧光的定义。
分子荧光是指一种物质在受到光激发后，通过光致激发和退激发过程，发出辐射的现象。
这个现象可以理解为当分子吸收能量较高的激发光子后，电子处于激发态，然后发生非辐射性跃迁回到基态，释放出辐射光子的过程。
这种辐射光子的能量通常比激发光子的能量低，因此分子荧光出现的波长较长，可见光区域内。
分子荧光的原理可以从分子结构和电子能级的角度进行解释。
分子结构多样性决定了其在激发态和基态之间的跃迁方式和过程，而电子能级的分布则决定了激发态和基态之间的能量差。
当一个分子处于基态时，其电子处于最低能量的电子轨道上。
当外界光激发分子时，电子从基态跃迁到激发态，此时电子处于高能级的电子轨道上。
然后，由于电子处于不稳定状态，会经历非辐射性过程，释放出能量。
最终，电子跃迁回基态，释放出能量的同时，也会发出荧光光子。
分子荧光在科学研究和实际应用中具有广泛的应用价值。
在化学领域，分子荧光被用于研究材料的发光性质、电子转移和能量传递等过程。
通过分析荧光光谱的形状和荧光寿命的变化，可以了解分子结构、溶剂极性以及溶剂对分子光学性质的影响。
在生物学研究中，分子荧光被广泛应用于细胞成像、蛋白质结构和功能研究，以及分子信号传导等方面。
通过与荧光探针结合，可以实现对细胞内生物分子的高灵敏度和高选择性的检测。
在医学领域，分子荧光被用于荧光探针的设计和制备，用于疾病的早期诊断和治疗。
通过标记荧光分子，可以实现对肿瘤、病毒等疾病标志物的检测和定位。
此外，在材料科学领域，分子荧光还被用于设计制备具有特定发光性能的材料，如有机发光二极管（OLED）和荧光传感器等。
总之，分子荧光作为一种重要的物理现象，在化学、生物学、医学和材料科学领域中发挥着重要作用。
分子荧光分析法实验
4800
4200
3600
3000
C
2400
1800
1200
600
0 550 560 570 580 590 600 610 620
W avelen g th (n m )
（☆注意：在一定浓度范围内适用）
? 问题：
试比较荧光法与紫外-可见分光光度法的分析性能。
1.4 荧光仪的基本构造
？问题：荧光光度 计与紫外-可见分光 光度计在光路设置 上有什么不同？为 什么？
02
维生素Ｂ２（核黄素）在一定波长的激 发光照射下会发射出绿色荧光，根据荧 光强度在一定浓度范围内与荧光物质浓 度成正比，用标准曲线法对样品进行定 量分析，在线性良好的情况下，也可用 浓度直接读出被测样品的浓度。
2.2 实验流程
VB2的荧光 光谱的绘制
标准工作曲 线的制作
未知液的测 定
1.开机： 打开RF-5301荧光分光光度计的电源开关，打印机开关，开启
1.5 分子荧光分析法的应用简介
常规分析应用：
01
定性分析：φf；λex；λem；峰 形等
03
其它（略）
02
定量检测： F = K﹒I0﹒φf﹒C
04
高端生化研究：
05
分子相互作用研究；
06
代谢动力学跟踪；
07
显微成像（物理迁移与化学衍化的 原位“显迹”）
二、维生素B2含量的荧光法测定
01 2.1 实验原理
5.空白溶液测试：
设置好仪器的工作条件后，把装有去离子水的样品池置于试样架内， 在荧光光路上插入ＵＶ－35滤光片，合上样品室盖子，在计算机 屏幕上点击“AUTO ZERO”，观察屏幕右下脚的基线值接近零时， 再点击“READ”读数，得空白溶液数值。
分子荧光
举例1
• 美国量子点公司的研究小组选择活细胞和固定细 胞为样本，用两种QDs(QD一535:绿色和QD一 630，红色)直接连接IgG(免疫球蛋白)，通过蛋白 Her-3-Monoelonalanti-Her-antibody—IgG--QDs 系统，将量子点特异性标记到了表达Her2癌症 Marker)的人乳腺癌细胞(SK一BR一3eell)的细胞 膜上，并验证了QDs一IgG标记的非特异性吸附很 弱。这项研究为体外检测癌细胞提供了一个新方 法
举例2
• 对于本事有荧光特性的物质 如NADH辅酶,本身有荧光特性. 在cell悬浮液中,在一定的荧光波长条件下被 激发.cell内的NADH会发出另一波段的荧光. 峰值处的荧光强度与cell内NADH水平成正 比.由此说明细胞的分解代谢的活性.
谢谢大家 !
• 将巯基乙醇连到CdS/ZnS的ZnS外壳上，游 离在外的羧基使QDs具有良好的水溶性,而 且为生物分子(例如蛋白、肽、核酸)的共价 偶联提供了连接位点。用修饰过的QDs标 记一种单抗，证实标记不影响单抗与多克 隆抗体的反应。量子点的光稳定性、水溶 性及与生物分子连接这几个首要问题的解 决，为半导体纳米晶体在生物学的应用打 开了大门。
无辐射跃迁振动驰豫来自内转换体系间跨越
式中，为荧光量子产率为激发光强度，b为 激发光强度，c分别为发光物质的摩尔吸光 系数和摩尔浓度,由此可见,只要发光物质的 浓度不是太大在 一定条件下，其荧光强度 与其浓度成正比.这就是荧光的定量分析基 础.
3.仪器简介 –具体由王阳同学介绍!
4.应用
• 对于不发光的分子(如多种氨基酸,蛋白质等) 用量子点QDs标记 (CdS/ZnS,CdTe,BaS,SiS,HgS,SeS等) 以上物质大多有生物毒性. 可以用荧光碳点来标记.
分子荧光和原子荧光
分子荧光和原子荧光引言：荧光是一种常见的光学现象，通过吸收光能后再发射出特定波长的光。
荧光现象在生物学、化学、物理学等领域被广泛应用。
分子荧光和原子荧光是荧光现象的两种重要形式，它们具有不同的特点和应用领域。
本文将分别介绍分子荧光和原子荧光的原理、特点和应用。
一、分子荧光分子荧光是指分子吸收光能后，电子被激发到高能级，然后经过非辐射跃迁返回基态时发射荧光。
分子荧光的原理是基于分子内部的电子跃迁过程。
当分子受到激发时，电子从基态跃迁到激发态，此时分子处于不稳定状态。
然后，电子通过非辐射跃迁返回基态，分子释放出一定的能量，这部分能量以光的形式发射出来，形成荧光。
分子荧光的特点：1. 分子荧光的发射光谱范围较宽，通常涵盖可见光和近红外光区域。
2. 分子荧光的发射光谱具有特定的波长和强度，可以用于分析和检测。
3. 分子荧光的强度受到溶剂、温度、pH值等环境因素的影响，可以用于环境监测和生物传感器等应用。
4. 分子荧光的寿命较短，通常在纳秒量级，因此可以通过测量荧光寿命来区分不同物质。
分子荧光的应用：1. 生物荧光标记：分子荧光可以用于生物分子的标记和追踪，如荧光染料用于细胞成像和蛋白质定位等应用。
2. 分析检测：分子荧光可以用于分析检测，如荧光光谱法、荧光定量PCR等。
3. 荧光显微镜：分子荧光可以用于荧光显微镜成像，可观察和研究微观结构和细胞内过程。
二、原子荧光原子荧光是指原子吸收光能后，电子从低能级跃迁到高能级，再经过辐射跃迁返回基态时发射荧光。
原子荧光的原理是基于原子内部电子的跃迁过程。
当原子吸收光能后，电子被激发到高能级，形成激发态原子。
然后，电子通过辐射跃迁返回基态，释放出一定的能量，这部分能量以光的形式发射出来，形成原子荧光。
原子荧光的特点：1. 原子荧光的发射光谱具有特定的波长和强度，可以用于元素分析和检测。
2. 原子荧光的发射光谱范围较窄，通常集中在紫外光和可见光区域。
3. 原子荧光的发射光谱中具有特征峰，可以用于元素定性和定量分析。
分子的荧光原理
分子的荧光原理分子的荧光是指在吸收能量后，分子会发出光的现象。
荧光是一种从分子的高能级到低能级跃迁的过程，其原理可以通过分子的电子能级结构来解释。
在分子中，电子存在于不同的能级上。
当分子受到光的激发时，电子会从基态跃迁到激发态。
这个跃迁的过程需要满足一定的能量差，即跃迁能级的差异。
分子激发态的寿命通常比较短暂，其持续时间通常在纳秒到微秒的范围内。
在分子激发态，电子会在能级之间进行不同的跃迁。
其中一种跃迁是非辐射跃迁，即电子从高能级跃迁到低能级而不发生光的辐射。
这种跃迁会产生热量，使得分子发生振动、转动等运动，最终将能量散失。
另外一种跃迁是辐射跃迁，即电子从高能级向低能级跃迁时发射出光的辐射。
这种跃迁产生的光称为荧光。
荧光的发生需要满足一系列条件。
首先，分子必须能够吸收能量，这需要光的频率与分子的能级差异相匹配。
当光的频率与分子的能级差异相匹配时，分子吸收光的能量，电子跃迁到激发态。
其次，分子必须有足够长的寿命以保持在激发态上足够长的时间，这样才能产生可观测到的荧光信号。
最后，分子在激发态上的电子需要足够稳定，以便发生辐射跃迁，释放出光的能量。
分子的荧光发生过程可以用一个简单的能级图来表示。
在能级图中，基态能级用E0表示，激发态能级用E1表示。
当分子受到激发时，电子从基态能级跃迁到激发态能级。
在激发态能级上，电子可以通过非辐射跃迁返回基态能级，也可以通过辐射跃迁返回基态能级。
当电子发生辐射跃迁时，分子会发出与跃迁能级差异相对应的光。
荧光的发射光谱是离散的，具有特征性的谱线。
这是因为分子的能级结构是离散的，所以只有在特定的能级差异下才能发生辐射跃迁。
荧光光谱可以提供关于分子结构和环境的信息。
在实际应用中，荧光可以用于分子探针、生物成像、化学分析等领域。
总结起来，分子的荧光是分子在受到光激发后发出光的现象。
荧光的发生需要分子能级结构的支持，吸收光的能量、通过非辐射跃迁返回基态能级或通过辐射跃迁释放光的能量。
分子荧光技术及其在分子生物学中的应用
分子荧光技术及其在分子生物学中的应用分子荧光技术，一种非常重要的工具，它通过利用荧光分子及其化学和物理性质，实现了对生物大分子的高地域性、高灵敏度、高速度、多参数监测能力。
在基础研究、药物筛选、生物成像等许多领域都应用于广泛。
1、荧光分子的种类及特点荧光分子，根据其荧光色素的种类不同，可以被分为蛋白质荧光标记物、化学发光荧光标记物和基于荧光染料的标记物等几种。
荧光染料，比如是吲哚染料、荧光素、吖啶、酒绿素等，具有强烈的吸光度和荧光性质，广泛应用于生物分子的荧光标记中。
吸收谱与发射谱之间的差异称为荧光光谱，关于荧光光谱显得更加特别和与众不同，其具有宽敞，对环境敏感，稳定性等特点。
荧光分子，通过吸光度测量、激发并发射荧光的过程被开发出来。
2、荧光标记技术的分类荧光标记技术的种类比较多，如共聚焦显微镜、荧光萤光光谱、FRET、光吸收、生物传感器等，这些方法可以根据用途、目的等大致分为以下几类：(1) 荧光显微镜。
该技术的优势在于可以在原位、快速、高分辨率地分析荧光标记分子的位置、数量。
(2) 荧光探针。
荧光探针技术可以实时、定量监测生化过程中的分子信息，如钙离子、酸碱度等生理、生化影响。
(3) 流式细胞术。
流式细胞分析技术的合成体现了荧光技术在大分子体系研究中被广泛应用。
(4) 生物传感器。
生物传感器是一种快速、灵敏、定量检测和分析生物分子的新技术。
通过组合荧光分子的化学性质与单分子生物学的初步技术，可以发展出各种各样的检测方法。
3、荧光技术在分子生物学研究中的应用(1) 蛋白质荧光标记蛋白质荧光标记是蛋白质分子在输运、淀合、非诊断物降解、应激、亚细胞结构及与其他蛋白质相互作用时的识别标志。
其中，绿色荧光蛋白（GFP）是最常用的蛋白质荧光标记。
GFP起源于水母Aequorea victoria。
它的分子总体为25 kDa，它的融合蛋白可以通过生物合成和分泌机制在具有特定功能的细胞或组织中专门标记。
这些融合蛋白常用于大脑、器官生物成像、环境污染监测等研究。
分子荧光分析法简介课件
荧光光谱的测量
总结词
荧光光谱的测量是荧光分析中的重要环节，通过测量可以得到待测物的荧光发射光谱和 激发光谱。
详细描述
在测量荧光光谱时，需要使用光谱仪在特定的激发波长范围内扫描，记录待测物的荧光 发射光谱和激发光谱。同时，还需控制实验条件，如温度、溶剂等，以确保测量结果的
准确性和可靠性。
荧光量子产率的测定
荧光寿命的测定有助于了解荧光染料的发光 持续时间和能量衰减规律，有助于深入理解 荧光分析的原理和应用。
详细描述
荧光寿命的测定通常使用脉冲或时间相关偏 振光谱技术进行。通过测量染料在不同时间 点的荧光强度，可以计算出荧光寿命。该参 数对于优化实验条件、提高荧光分析的灵敏
度和特异性具有指导意义。
CHAPTER 05
CHAPTER 03
分子荧光分析法的分类
荧光分光光度法
总结词
一种常用的荧光分析方法，通过测量荧光光谱和荧光强度，对荧光物质进行定性和定量分析。
详细描述
荧光分光光度法基于荧光物质在不同波长光的激发下会发出不同波长的荧光原理，通过测量荧光光谱和荧光强度 ，可以确定荧光物质的成分和浓度。该方法具有高灵敏度、高选择性等优点，广泛应用于生物、医学、环境等领 域。
时间分辨荧光分析法
总结词
一种高灵敏度的荧光分析方法，通过测量荧光物质在不同时间点的荧光强度，对荧光物质进行定性和 定量分析。
详细描述
时间分辨荧光分析法利用荧光物质在不同时间点的荧光特性，通过测量不同时间点的荧光强度，可以 消除背景荧光的干扰，提高检测的灵敏度和准确性。该方法具有高灵敏度、高分辨率等优点，在生物 、医学、环境等领域有广泛应用。
分子荧光分析法的应用实例
在环境监测中的应用
产生分子荧光应该具备的条件
产生分子荧光应该具备的条件分子荧光是由分子吸收光能后，发生激发态到基态的跃迁而发生的。
产生分子荧光通常需要满足一些特定的条件。
以下是一些产生分子荧光所具备的条件：
1. 电子激发：分子需要吸收光子，使得分子内的电子从基态激发到激发态。
这通常发生在紫外光区域。
2. 荧光发射：在电子激发后，分子会经过一个短暂的激发态存在期间，然后发生荧光发射，即电子返回到基态并释放能量的过程。
3. 激发态寿命：分子的激发态寿命足够长，使得电子在激发态存在的时间足够发生荧光发射。
激发态寿命的长短与分子结构、环境等因素相关。
4. 分子结构：分子的结构对其荧光性质有很大影响。
某些分子结构更容易发生荧光，而某些结构可能并不适合。
5. 溶剂效应：溶剂的性质可以影响分子的激发态和基态的能量差异，从而影响分子的荧光性质。
6. 光密度：光密度越高，吸收的光子数目越多，从而激发更多的分子到激发态，增加荧光发射的强度。
7. 温度：温度的变化可能会影响分子的振动和旋转状态，从而影响荧光特性。
8. 禁阻规则：分子的激发态和基态之间的跃迁必须符合一定的选择规则，这就是所谓的禁阻规则，确保发生荧光的合法跃迁。
总体而言，产生分子荧光的条件是一个复杂的过程，涉及分子的电子结构、光学性质、环境等多个因素。
这些条件的具体要求因分子的种类而异。
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荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态（
多为 S1→ S0跃迁），发射波长为 l ‘2的荧光； 10-7～10 -9 s
。
由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长
长；
l
‘ 2
>
l
2
>
l
1
；
磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级→基态（
T1 → S0跃迁）； 电子由S0进入T1的可能过程：（ S0 → T1禁阻跃迁）
影响荧光强度的外部因素 1.溶剂的影响
同一物质在不同溶剂中，其荧光光谱的形状和强度都有差别。 一般情况下，荧光波长随着溶剂极性的增大而长移，荧光强度也有 所增强。这是因为在极性溶剂中，ππ*跃迁所需的能量差△E小， 而且跃迁几率增加，从而使紫外吸收波长和荧光波长均长移，强度 也增强。
溶剂粘度减小时，可以增加分子间碰撞机会，使无辐射跃迁增 加而荧光减弱。故荧光强度随溶剂粘度的减小而减弱。由于温度对 溶剂的粘度有影响，一般是温度上升，溶剂粘度变小，因此温度上 升，荧光强度下降。
S0 →激发→振动弛豫→内转移→系间跨越→振动弛豫→ T1 发光速度很慢： 10-4～100 s 。
光照停止后，可持续一段时间。
二、激发光谱与荧光(磷光)光谱
excitation spectrum and fluore-scence spectrum
荧光(磷光)：光致发光，照射光波长如何选择？
1.荧光(磷光)的激发光谱曲线
5.荧光熄灭剂
荧光熄灭是指荧光物质分子与溶剂分子或溶质分子相互 作用引起荧光强度降低的现象。引起荧光熄灭的物质称为 荧光熄灭剂(quenching medium)。如卤素离子、重金属离子 、氧分子以及硝基化合物、重氮化合物、羰基和羧基化合 物均为常见的荧光熄灭剂。
6、散射光
小部分光子和物质分子相碰撞，使光子的运动方向发生 改变而向不同角度散射。
2.电子激发态的多重度
电子激发态的多重度：M=2S+1
S为电子自旋量子数的代数和(0或1)；
平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则)，三重态能级比相 应单重态能级低；
大多数有机分子的基态处于单重态；
S0→T1 禁阻跃迁； 通过其他途径进入 (见能级图)；进入的 几率小；
势能
基态
LVMO
HOMO
激发单重态
苯胺在pH7～12的溶液中主要以分子形式存在，由于NH2为提高荧 光效率的取代基，故苯胺分子会发生蓝色荧光。但在pH<2和pH＞ 13的溶液中均以苯胺离子形式存在，故不能发射荧光。
4.内滤光作用和自吸现象
内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发 射的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾；
自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收 光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。
固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光(磷
光)强度与照射光波长的关系曲线 （图中曲线I ） 。 激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光
强度最大；
2.荧光光谱(或磷光光谱)
固定激发光波长(选 最大激发波长), 化合物 发射的荧光(或磷光强度) 与发射光波长关系曲线( 图中曲线II或III)。
S0 M=1 (a)
S1 M=1 (b)
S2 M=1 (c)
激发三重态
反键轨道 *，*
分子轨道
成键轨道 ，
分子轨道
T1
T2
M=3
M=3
(d)
(e)
2.激发态→基态的能量传递途径
电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射 跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；
传递途径
辐射跃迁
无辐射跃迁
荧光 延迟荧光 磷光
（2）定量方法
标准曲线法： 配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制
标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强 度，在标准曲线上求出浓度； 比较法：
在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度， 比较；
3.荧光分析法的应用
(1)无机化合物的分析
与有机试剂配合物后测量；可测量约60多种元素。 铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法； 氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定； 铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定； 铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定； 铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定
2.化合物的结构与荧光
（1）跃迁类型：* → 的荧光效率高，系间跨越过程的速 率常数小，有利于荧光的产生； （2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移 （3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作 用，故具有很强的荧光。
（4）取代基效应：芳环 上有供电基，使荧光增 强。
三、影响荧光强度的因素
第四章 分子发光分析法
molecular luminescence analysis
2008年的诺贝尔化学奖
日本科学家下村修、美国科学家马丁·沙尔菲和美籍华裔科学家钱永 键获得2008年的诺贝尔化学奖。这三位科学家因在发现和研究绿色 荧光蛋白方面做出贡献而获奖。
荧光量子点
第一节 分子荧光与磷光
瑞利光：光子和物质发生弹性碰撞，不发生能量交换，只 是光子运动方向发生改变。其波长与入射光波长相同。
拉曼光：光子和物质发生弹性碰撞，发生能量交换，光子把 部分能量转移给物质分子或从物质分子获得部分能量。从而 发射出比入射光稍长或稍短的光。
散射光对荧光测定有干扰，尤其是波长比入射光波长更长的 拉曼光，与荧光波长接近，对测定的干扰大，必须采取措施 消除。拉曼光的干扰主要来自溶剂，当溶剂的拉曼光与被测 物质的荧光光谱相重叠时，应更换溶剂或改变激发光波长
二、荧光分析方法与应用
1. 特点
（1）灵敏度高 比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级；为什么？
检测下限：0.1～0.1 g/cm-3 相对灵敏度：0.05 mol/L 奎宁硫酸氢盐的硫酸溶液。 （2）选择性强
既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱； （3）试样量少
缺点：应用范围小。
2.定量依据与方法
molecular fluorescence and phosphorescence
一、分子荧光与磷光产生过程 二、激发光谱与荧光光谱 三、荧光的产生与分子结构关系 四、影响荧光强度的因素
一、荧光与磷光的产生过程
由分子结构理论，主要讨论荧光及磷光的产生机理。
1. 分子能级与跃迁
分子能级比原子能级复杂； 在每个电子能级上，都存在振动、转动能级； 基态(S0)→激发态(S1、S2、激发态振动能级)：吸收特定 频率的辐射；量子化；跃迁一次到位； 激发态→基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快 、激发态寿命最短的途径占优势； 第一、第二、…电子激发单重态 S1 、S2… ； 第一、第二、…电子激发三重态 T1 、 T2 … ；
系间跨越 内转移 外转移 振动弛豫
激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大 ，发光强度相对大； 荧光：10-7～10-9 s, 第一激发单重态的最低振动能级→基态； 磷光：10-4～10 s；第一激发三重态的最低振动能级→基态；
内转换
振动弛豫 内转换
S2
系间跨越
S1
能
T1 T2
量
吸 收
发
射
该型仪器可进 行荧光、磷光 和发光分析；
同步扫描技术
根据激发和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持的 关系，同步扫描可分为固定波长差(l)和固定能量差及可 变波长三种；
同步扫描技术可简化光谱，谱 带变窄，减少光谱重叠，提高分辨 率； 如图。
合适的l可减少光谱重叠； 酪氨酸和色氨酸的荧光激发光谱相 似，发射光谱严重重叠，但 l<15nm的同步光谱只显示酪氨酸 特征光谱； l>60nm时，只显示色 氨酸的特征光谱，实现分别测定。
(1)定量依据 荧光强度 If正比于吸收的光量Ia和荧光量子效率 ： If = Ia 由朗伯-比耳定律： Ia = I0(1-10- l c ) If = I0(1-10- l c ) = I0(1-e-2.3 l c ) 浓度很低时，将括号项近似处理后：
If = 2.3 I0 l c = Kc
图l 2 ,l 1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最
低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如l
‘ 2
)
。
c. 镜像规则 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一
样）成镜像对称关系。
镜像规则的解释
基态上的各振动能级分布 与第一激发态上的各振动能级 分布类似；
基态上的 零振动能级与 第一激发态的 二振动能级之 间的跃迁几率 最大，相反跃 迁也然。
2.温度的影响
荧光强度对温度变化敏感，温度增加，分子运动速度加 快，分子间碰撞的几率增加，外转换去活的几率增加，荧光 效率降低。例如荧光素钠的乙醇溶液，在0℃以下，温度每降
低10℃， f增加3％，在80℃时， f为1。
3. 溶液pH
对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制； 当荧光物质本身是弱酸或弱碱时，溶液的pH值对该荧光物质的 荧光强度有较大影响，这主要是因为在不同酸度中分子和离子间的 平衡改变，离子结构发生变化，因此荧光强度也有差异。每一种荧 光物质都有它最适宜的发射荧光的存在形式，也就是有它最适宜的 pH值范围。例如苯胺在不同pH值下有下列平衡关系：
荧光发射光谱 荧光激发光谱
磷光光谱
200 260 320 380 440 500 560 620 室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱
3.激发光谱与发射光谱的关系
a.Stokes位移
激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比
激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。 b.发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如能级