分子荧光光谱原理
第九章分子荧光光谱法Molecular-fluorescence-spectroscopy
特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。 基本流程如图： 单色器：选择激发光波长 的第一单色器和选择发射 光(测量)波长的第二单色 器； 光源：灯和高压汞灯，染 料激光器(可见与紫外区) 检测器：光电倍增管。
仪器框图
该型仪器可进 行荧光、磷光 的发光分析；
同步扫描技术
根据激发和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持的 关系，同步扫描可分为固定波长差(Δλ)和固定能量差及可 变波长三种；
辐射复合发光过程：
1. 自由激子复合(X)； 2. 导带电子—中性受主复合
(e，A0)； 3. 施主—受主对复合
(D0，A0)； 4. 束缚于中性施主上的——
激子复合 (D0，X)； 5. 中性施主——价带空穴的复合(D0，h)；
中性受主、电离施主或受主上的和等电子杂质上的束缚激子复合而发 光。
3.激发光谱与发射光谱的关系
（4）取代基效应：芳环 上有供电基，使荧光增 强。
3.内滤光作用和自吸现象
内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射 的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾；
自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收 光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。
4、溶液荧光的猝灭
碰撞猝灭： 氧的熄灭作用等。
四、仪器结构流程
2. 激发态分子的失活: 激发态分子不稳定，它要以辐射
或无辐射跃迁的方式回到基态。
λ1
λ2
λ2/
λ3
λ4
无辐射跃迁:
(1) 振动弛豫：激发态分子由同一电子能级中的较高振动能 级转至较低振动能级的过程，其效率较高。 (2) 内转换：相同多重态的两个电子能级间，电子由高能级 回到低能级的分子内过程。 (3) 系间窜越： 激发态分子的电子自旋发生倒转而使分子的 多重态发生变化的过程。 (3) 外转换：激发态分子与溶剂或其它溶质相互作用、能量 转换而使荧光 （或磷光）减弱甚至消失的过程。荧光强度的
分子荧光光谱法
荧光光谱 磷光光谱
辐射跃迁只使激发态分子衰变到基态的不同振动 能级，然后通过振动松弛进一步损失能量。
图2 萘的激发光谱I、荧光II和 磷光光谱III
荧光与分子结构的关系
具有大的共轭π键的结构 化合物
ϕF
λex/nm
λem/nm
含有π→π＊跃迁能级的芳 苯
0.11
205
278
香族化合物的荧光最强芳环 蒽
0.29
286
321
越大其荧光峰越移向长波长 萘
0.46
365
400
方向，且荧光长度往往比较
丁省
0.60
390
480
强。
戊省
0.52
580
640
取代基的影响
给电子基团，如-0H、-OR、 -NH2、-CN、-NR2等，使 荧光增强。
分子荧光光谱法
molecular fluorescence analysis
CONTENTS
01 概述/ 02 荧பைடு நூலகம்分析基本原理/ 03 荧光分析仪器 /
04 检测结果与分析/ 05 对比与发展 /
Part 01
概述
overview
原子光谱法 分子光谱法
主要研究内容
The Main Contents Of The Research
系间窜越 isc
03 不同多重态的两个电子态间的非辐射跃迁过 程（例如S1---T1，T1---S0）
内转换
振动弛豫
S2
系间跨越
S1
能
量
分子荧光光谱原理
首次建立了辣椒及辣椒素对照 品的三维荧光指纹图谱; 研究 表明，不同品种辣椒具有各自 特征的指纹图类型和特征指纹; 三维荧光指纹图谱可用来作为 鉴别辣椒品种和评价辣椒素含 量的有效手段
荧光光谱在食品中的应用
检测农药残留与污染物
同步荧光分析中，诺氟沙星、盐酸洛美沙星和乳酸左氧氟沙星三种 药物光谱重叠严重在 pH =2.87 的 BR 缓冲溶液中，波长差 Δλ =190nm 时，诺氟沙星、盐酸洛美沙星和乳酸左氧氟沙星的测量线 性范围分别为 0.016～0.40、0.01～0.336 和 0.01～0.336μg / mL; 检出限分别为0.0126、0.006 和 0.0072μg / mL。 采用恒能量同步荧光光谱法测定苯并芘 多环芳烃具有高荧光量子产率，可利用三维荧光光谱法进行测定
分子荧光光谱的特点
信息量大 灵敏度高
荧光不受来 自激发光的本底 的干扰，灵敏度 大大高于紫外可见吸收光谱， 测量用量很，方 法简便。 荧光光谱能提供较 多的参数，如激发 谱、发射谱、峰位、 峰强度、荧光寿命、 荧光偏振度等；还 可以检测一些紫外可见吸收光谱检测 不到的时间过程。
多元素测定
原子荧光 是向各个方向 发射的，便于 制作多道仪。
L/O/G/O
分子荧光光谱应用原理
荧光是受光激发的分子从第一激发单重态的最低振动 能级回到基态所发出的辐射，通常发生于具有刚性结构和 平面结构π 电子共轭体系的分子中。随着 π 电子共轭度和 分子平面度的增加，荧光强度随之增大，光谱相应红移， 其荧光光谱的形状和强度也相应发生变化，因此荧光光谱 是提供具有共轭结构的分子的组分分布与浓度大小的有效 测试手段之一。
分子荧光光谱分析的特点
虽然原子荧光光谱分析法有以上优点，但由于荧光 淬灭效应，以致在测定复杂基体的试样及高含量样品时， 尚有一定困难。此外，散射光的干扰也是原子荧光分析 中的一个麻烦问题。因此，原子荧光光谱分析法在应用 方面尚不及原子吸收光谱法和原子发射光谱法广泛，但 可作为这两种方法的补充。
分子荧光光谱法
菲
线状环结构比非线状 结构的荧光波长长
• 芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系， 芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系， 多数能发生荧光 • 多环芳烃是重要的环境污染物，可用荧光 多环芳烃是重要的环境污染物， 法测定 • 3，4 - 苯并芘是强致癌物 ， 苯并芘是强致癌物
λ ex = 386 nm λem = 430 nm
（二）荧光与有机化合物结构的关系
物质只有吸收了紫外可见光，产生π 物质只有吸收了紫外可见光，产生π → π*，n → π* 跃迁， 跃迁，产生荧光 跃迁相比，摩尔吸收系数大10 π → π*与n → π*跃迁相比，摩尔吸收系数大102~103， 寿命短 跃迁常产生较强的荧光， π → π*跃迁常产生较强的荧光， n → π*跃迁产生的 荧光弱
1. 电子自旋状态的多重性
大多数分子含有偶数电子，基态分子每一个轨道 大多数分子含有偶数电子， 中两个电子自旋方向总是相反的↑↓ 中两个电子自旋方向总是相反的↑↓ ，处于基态单 重态。 当物质受光照射时， 重态。用 “S0” 表示 ；当物质受光照射时，基态 分子吸收光能产生电子能级跃迁， 分子吸收光能产生电子能级跃迁，由基态跃迁至 更高的单重态，电子自旋方向没有改变， 更高的单重态，电子自旋方向没有改变，净自旋 = 0 .这种跃迁是符合光谱选律的 第一激发单重态 S1
VR S2 IC VR S1 ISC
VR：振动驰豫 ： IC：内部转换 ： ISC：系间窜跃 ：
T1
S0 吸光 吸光
S0
3. 荧光光谱的产生—辐射去激 荧光光谱的产生—
处于S 处于S1或T1态的电子返回S0态时，伴随有发光现 态的电子返回S 态时， 象，这种过程叫辐射去激 发光 S0 S1或T1 荧光： （1）荧光： 当电子从第一激发单重态S 当电子从第一激发单重态S1的最低振动能级回到基 态S0各振动能级所产生的光辐射叫荧光 荧光是相同多重态间的允许跃迁，产生速度快， 荧光是相同多重态间的允许跃迁，产生速度快， 10-9~10-6s，又叫快速荧光或瞬时荧光，外部光源停 又叫快速荧光或瞬时荧光， 止照射， 止照射，荧光马上熄灭 无论开始电子被激发至什么高能级，它都经过无辐 无论开始电子被激发至什么高能级， 射去激消耗能量后到S 的最低振动能级，发射荧光， 射去激消耗能量后到S1的最低振动能级，发射荧光， 荧光波长比激发光波长长。 荧光波长比激发光波长长。 λ 荧>λ激
荧光光谱原理
荧光光谱原理荧光光谱是一种分析样品中荧光物质的方法，它是利用物质在受到激发后发出的荧光来进行分析的。
荧光光谱原理是基于物质分子在吸收能量后从基态跃迁到激发态，然后再从激发态跃迁回基态时发出荧光的原理。
在这个过程中，分子的激发态能级和基态能级之间的能量差决定了荧光发射的波长，因此荧光光谱可以用来研究分子的结构、环境和相互作用等信息。
荧光光谱的原理可以用来解释荧光物质的发光特性。
当荧光物质受到激发后，其分子内部的电子会跃迁到激发态，这个过程需要吸收一定的能量。
当分子从激发态跃迁回基态时，会释放出能量，这部分能量就以荧光的形式发射出来。
荧光发射的波长和强度可以提供关于样品的信息，比如样品的组成、纯度、浓度等。
荧光光谱的原理还可以用来解释荧光物质的激发和发射过程。
在激发过程中，荧光物质吸收能量，使得分子内部的电子跃迁到激发态。
这个过程是一个快速的过程，通常在纳秒到皮秒的时间尺度内完成。
而在发射过程中，分子从激发态跃迁回基态，释放出荧光。
荧光发射的波长和强度受到激发光的波长和强度的影响，因此可以用来研究激发光和荧光物质之间的相互作用。
除了用来研究荧光物质的发光特性和激发发射过程外，荧光光谱的原理还可以用来研究分子的结构和环境。
由于不同的分子在激发后会发出不同波长的荧光，因此可以通过测量荧光发射的波长来研究分子的结构。
此外，分子的环境也会影响其激发和发射过程，因此可以通过荧光光谱来研究分子的环境信息。
总之，荧光光谱原理是基于分子在受到激发后发出的荧光来进行分析的。
通过研究荧光发射的波长和强度，可以得到关于样品的信息，比如样品的组成、纯度、浓度、结构和环境等。
荧光光谱在化学、生物、环境等领域都有广泛的应用，是一种重要的分析方法。
荧光光谱的原理及应用
荧光光谱的原理及应用1. 引言荧光光谱是一种常见的光谱分析技术，基于物质在受到激发后发射荧光光线的原理。
本文将介绍荧光光谱的原理、测量方法以及在生物医学、环境科学和材料科学等领域的应用。
2. 荧光光谱的原理荧光光谱是由物质吸收能量后产生的荧光信号在不同波长范围内的强度分布。
其原理基于以下步骤：1.激发：物质通过吸收能量（如电子激发或能量转移）而进入激发态。
2.稳定：物质从激发态返回基态时，通过发射荧光光子来释放多余的能量。
3.衰减：发射的荧光光子会在介质中衰减，随着波长逐渐增加，荧光强度逐渐降低。
4.探测：荧光信号由光谱仪探测并记录。
3. 荧光光谱的测量方法荧光光谱的测量方法通常分为以下步骤：1.光源选择：根据被测物质的特性选择适当的光源，如氘灯或氙灯等。
2.激发波长选择：根据被测物质的吸收光谱选择合适的激发波长。
3.光谱仪调节：调整光谱仪的参数，如光栅角度和波长选择器，以获得所需的测量范围和分辨率。
4.校准：使用已知荧光标准品进行光谱仪的校准。
5.测量：将被测物质溶解在适当的溶剂中，通过光谱仪测量荧光光谱。
6.数据处理：对获得的荧光光谱进行数据处理和分析，如峰面积计算、峰位置确认等。
4. 荧光光谱在生物医学中的应用荧光光谱在生物医学中有多种应用，包括：•荧光标记：通过将荧光染料或荧光标记蛋白等与生物分子结合，可以实现对细胞、分子和蛋白质的可视化和定量分析。
•免疫荧光：通过测量特定抗原与标记抗体结合后的荧光光谱，可以进行生物分子的定量测量和蛋白质表达的研究。
•荧光成像：利用荧光探针对生物样品进行成像，可以研究细胞活动、分子交互作用以及肿瘤生长过程等。
5. 荧光光谱在环境科学中的应用荧光光谱在环境科学中也有多种应用，如：•污染物检测：通过测量污染物的荧光光谱特征，可以对水体、大气和土壤中的有机污染物进行快速、灵敏和定量的检测。
•环境监测：荧光光谱可以用于监测水质、空气质量和土壤污染等环境指标，提供环境质量评估和预警。
荧光光谱原理
荧光光谱原理荧光光谱是一种分析化学技术，利用物质在受到激发后发出的荧光来研究其结构和性质。
荧光光谱原理是基于分子在受到紫外光或可见光激发后，发生能级跃迁并发出荧光的现象。
在荧光光谱分析中，我们需要了解荧光的激发机理、发射机理以及荧光光谱的特点和应用。
首先，荧光的激发机理是指分子在受到激发光的作用下，内部电子从基态跃迁到激发态，形成激发态分子。
在这个过程中，分子吸收了激发光的能量，使得电子跃迁到高能级轨道上。
这种激发态是不稳定的，分子会很快返回到基态，释放出能量。
这种能量以荧光的形式发出，产生荧光现象。
不同的分子在受到不同波长的激发光作用下，会产生不同的荧光颜色和强度，这为荧光光谱分析提供了基础。
其次，荧光的发射机理是指分子从激发态返回到基态时，释放出的能量以荧光的形式发出。
这种发射是在非辐射跃迁的过程中完成的，因此发出的荧光具有特定的波长和强度。
通过测量样品发出的荧光光谱，我们可以得到有关样品结构和性质的信息。
荧光光谱的特点是具有高灵敏度和高选择性。
由于荧光的发射是在非辐射跃迁的过程中完成的，因此荧光光谱对于样品的检测具有很高的灵敏度。
同时，不同的化合物在受到激发后会产生不同的荧光光谱，因此荧光光谱具有很高的选择性，可以用于分析复杂的混合物。
荧光光谱在生物医学、环境监测、食品安全等领域有着广泛的应用。
在生物医学领域，荧光光谱被用于药物分析、生物标记物检测等方面；在环境监测领域，荧光光谱可以用于水质、大气和土壤中有机污染物的检测；在食品安全领域，荧光光谱可以用于检测食品中的添加剂和有害物质。
由于荧光光谱具有高灵敏度和高选择性，因此在这些领域有着重要的应用前景。
总之，荧光光谱原理是基于分子在受到激发后发出荧光的现象。
了解荧光的激发机理、发射机理以及荧光光谱的特点和应用，有助于我们更好地理解和应用这一分析技术。
荧光光谱在化学分析和生物医学等领域有着广泛的应用前景，将为科学研究和工程技术提供重要支持。
荧光相关光谱fcs原理
荧光相关光谱fcs原理
荧光相关光谱（FCS）原理是指通过测量和分析荧光涂层在推动层面引起的荧
光强度随时间的变化，从而获取有关推动层面参数及其统计特性的信息。
FCS 原
理主要包括自相关函数和交叉相关函数两部分。
自相关函数涉及到了光子计数、时间延迟并统计的过程。
单个分子在一个微小的体积元内发射出一个光子后，这个光子会经过空间分离并以一定的时间延迟被探测器接收。
然后使用自相关函数的算法对记录到的光子计数的时间序列进行统计
分析，从而得到荧光寿命、动力学、分子的扩散系数等信息。
交叉相关函数则是用于描述两个不同荧光源之间的关联性。
通过对不同波长的荧光信号进行交叉相关分析，可以获得不同分子的动力学信息和相互作用的信息。
此外，FCS 原理还包括了对荧光相关光谱的数据拟合。
通过拟合产生的荧光相关光谱可以获得一些重要的分子信息，如荧光强度随时间的变化、分子的扩散系
数以及分子的浓度等。
这些信息不仅可以帮助分析荧光源的发射机制，也有助于研究分子的运动行为以及分子间的相互作用等。
通过FCS原理，科学家不仅可以对单个分子的行为进行任意深入地研究，还能利用荧光相关光谱来研究生物系统中的分子过程，如蛋白质的折叠和功能机制、DNA和RNA的复合和解离过程等，由此带来了巨大的科学研究价值。
34--荧光光谱的原理及应用简介-王林
表示不同激发波长下所引起物质发射某一波长荧光的相对效率。
激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最 大，称为最大激发波长 λex
9/28
发射光谱：使激发光波长固定在λex处，然后对发射光谱扫描，
测定各种波长下相应的荧光强度，以荧光强度F 对发射波长λ
(1) 灵敏度高 比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级； 检测下限：0.1～0.1µg/cm-3
(2) 选择性强 既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱；
(3) 试样量少 缺点：应用范围小。
23/28
无机化合物分析中的应用
无机化合物在与有机试剂配合物后测量；可测量约60多种元素。 ① 铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法； ② 氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定； ③ 铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定； ④ 铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定； ⑤ 铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定
13/28
荧光光谱和荧光强度的影响因素
4.重原子效应
重原子具有增强系间窜越的作用，将增大从S1态向T1态的系间 窜越的速率常数和量子产率，从而导致降低荧光量子产率。
5.有序介质的影响
表面活性剂或环糊精溶液这类有序介质，对发光分子的发光特 性有着显著的影响。
6.其他溶质的影响
分子的荧光强度会因为与其他溶质的相互作用而受到影响。
荧光
fluorescence
磷光
phosphorescence
受光激发的分子从第一激 发单重态的最低振动能级 回到基态所发出的辐射
从第一激发三重态的最低 振动能级回到基态所发出 的辐射
荧光分析法是根据物质的荧光谱线的位置及其强度进行物 质鉴定和含量测定的仪器方法。
分子荧光光谱法
去激发光 * * n
基态
在光致激发和去激发光的过程中，分子中 的价电子（ 、n电子）处于不同的自旋状 态，通常用电子自旋状态的多重性来描述
1. 电子自旋状态的多重性
大多数分子含有偶数电子，基态分子每一个轨道 中两个电子自旋方向总是相反的 ，处于基态单 重态。用 “S0” 表示 ；当物质受光照射时，基态 分子吸收光能产生电子能级跃迁，由基态跃迁至 更高的单重态，电子自旋方向没有改变，净自旋 = 0 .这种跃迁是符合光谱选律的 第一激发单重态 S1
应用最广泛的一种光 源，可发射250~800nm
很强的连续光源
2、单色器
荧光计用滤光片作单色器，荧光计只能用于定量 分析，不能获得光谱
大多数荧光光度计一般采用两个光栅单色器，有
较高的分辨率，能扫描图谱，既可获得激发光谱， 又可获得荧光光谱
第一单色器作用：分离出所需要的激发光，选择
最佳激发波长 光物质 ex
f
ex /nm
em /nm
苯
0.11
205
278
萘
0.29
286
310
蒽
0.46
365
400
线状环结构比非线状
菲
结构的荧光波长长
350
• 芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系， 多数能发生荧光 • 多环芳烃是重要的环境污染物，可用荧光 法测定 • 3，4 - 苯并芘是强致癌物
ex = 386 nm em = 430 nm
浓度高时， If与C不呈线形关系，有时C增大， If 反而降低因为有时发生荧光猝灭效应
荧光猝灭
——荧光物质与溶剂或其它物质之间 发生化学反应，或发生碰撞后使荧光强度 下降或荧光效率f 下降称为荧光猝灭。 使荧光强度降低的物质称为荧光猝灭剂
荧光光谱
10
荧光熄灭
碰撞熄灭 能量转移 氧的熄灭 自熄灭和自吸收
11
荧光分光光度计
基本结构 光源 单色器 吸收池 检测器
12
二、荧光仪器（光源与检测器处于相互垂直的位置） 荧光仪器（光源与检测器处于相互垂直的位置）
光源
第一单色器 或滤光片
激发
记录仪 荧光 第二单色器 或滤光片
样品池 样品池
1）光源：氙灯、高压汞灯、激光； ）光源：氙灯、高压汞灯、激光； 2）样品池：石英（低荧光材料）； ）样品池：石英（低荧光材料） 3）两个单色器：选择激发光单色器；分离荧光单色器； ）两个单色器：选择激发光单色器；分离荧光单色器； 4）检测器：光电倍增管。 ）检测器：光电倍增管。
5
荧光分析的特点： 荧光分析的特点：
灵敏度高：视不同物质，检测下限在 灵敏度高：视不同物质，检测下限在0.1~0.001µg/mL 之间。 之间。可 见比UV-Vis的灵敏度高得多！WHY？ 的灵敏度高得多！ 见比 的灵敏度高得多 选择性好：可同时用激发光谱和荧光发射光谱定性。 选择性好：可同时用激发光谱和荧光发射光谱定性。 结构信息量多：包括物质激发光谱、发射光谱、光强、 结构信息量多：包括物质激发光谱、发射光谱、光强、 荧光量 子效率、荧光寿命等。 子效率、荧光寿命等。 应用不广泛：主要是因为能发荧光的物质不具普遍性、 应用不广泛：主要是因为能发荧光的物质不具普遍性、 增强荧 光的方法有限、外界环境对荧光量子效率影响大、 光的方法有限、外界环境对荧光量子效率影响大、 干扰测量的因素较多。
1、定性分析 、 任何荧（ 光都具有两种特征光谱： 任何荧（磷）光都具有两种特征光谱：激发光谱与 发射光谱。它们是荧（ 光定性分析的基础。 发射光谱。它们是荧（磷）光定性分析的基础。 激发光谱可用于鉴别荧光物质；在定量时， 激发光谱可用于鉴别荧光物质；在定量时，用于选择 最适宜的激发波长。 最适宜的激发波长。 2、定量分析 、 If=Kc 该式只有在εlc＜＜ ＜＜0.05才成立，即荧光分析必须在极 才成立， 该式只有在 ＜＜ 才成立 稀的溶液中才可以用于定量测定，否则校正曲线弯曲。 稀的溶液中才可以用于定量测定，否则校正曲线弯曲。
现代生物仪器分析第三章 分子荧光光谱法
第二节 荧光分析的原理
（一）荧光发生机理 物质的基态分子受一激发光源的照射， 被激发至激发态，在返回基态时，产生 波长与入射光相同或较长的荧光。 通过测定物质分子产生的荧光强度进行
分 析 的 方 法 称 为 荧 光 分 析 (fluorescence analysis)。
1、分子的激发态
荧光和磷光这两种光致发光过程的机理不同， 可从实验观察激发态分子寿命的长短来加以区 别： 对于荧光来说，当激发光停止照射后，发光 过程几乎立即停止（在10-9～10-6秒，荧光寿 命fluorescence life time ）。 磷光则将持续一段时间（在10-3～10秒）。
荧光分析法发展简史
2、分子荧光和磷光的产生
分子在室温时基本上处于电子能级的基态。当吸 收了紫外—可见光后，基态分子中的电子只能跃 迁到激发单线态的各个不同振动—转动能级，根 据自旋禁阻规律，不能直接跃迁到激发三重态的 各个振--转能级。 处于激发态的分子是不稳定的，它可能通过辐射 跃迁和无辐射跃迁等分子内的去活化过程释放多 余的能量而返回至基态，发射荧光是其中的一条 途径。
世界上第一次记录荧光现象是16世纪 西班牙的内科医生和植物学家 N.Monardes。 1575年他提出在含有一种木头切片的 水溶液中，可观察到极可爱的天蓝色。
1852年，stokes在考察奎宁和叶绿素的 荧光时，用分光光度计观察到其荧光的 波长比入射光的波长稍微长些，从而导 入了荧光是光发射的概念。 18工作。应用铝—桑色素配 合物的荧光进行铝的测定。 19世纪以前，荧光的观察是靠肉眼进行 的，直到1928年，才由Jette和West完成 了第一台荧光计。
激发单重态与激发三重态的性质不同
分子荧光光谱法
单色器： 第一单色器——选择激发光波长λ1 （＞250nm的紫外 光），称为激发单色器。 第二单色器——选择(测量)发射光（荧光）波长λ2 ， 与激发光入射方向垂直，称为荧光单色器。
样品池： 采用低荧光材料，通常为石英池。 检测器： 光电倍增管。
Ⅳ、荧光法的应用
荧光法灵敏度高、选择性好，可用于痕量 分析，但是能产生荧光的物质较少，使其 应用范围较小。
（2）Stokes位移 Stokes位移是指激发光谱与荧光光谱之间的波长 差值。 荧光的波长总是大于激发光的波长。这是由于发 射荧光之前的振动驰豫和内转换过程损失了一定的能 量。
（3）荧光光谱的形状与激发光波长无关 电子跃迁到不同激发态，吸收不同波长的能 量，产生不同的吸收带，但荧光均是激发态电子 回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到 基态而产生的，这与荧光物质分子被激发至哪一 能级无关。因此，荧光光谱的形状和激发光的波 长λ1无关。
溶液浓度较低时：
F K I 0 2.303bc
当入射光的λ1 和 I0一定时 ： F=Kc 即： 在低浓度时，溶液的荧光强度与荧光物质 的浓度成正比。 ————这是荧光法定量的基础。
7.影响荧光强度的因素
（1）内部因素
自猝灭——发光物质分子间碰撞而发生的能量无辐射 转移。自猝灭随溶液浓度的增加而增加。
分子荧光产生机理
1.光谱类型
荧光光谱是物质分子 吸收紫外光后产生的分子 发射光谱。 2.跃迁类型
分子中原子的电子能 级跃迁，伴随振动能级的 跃迁。
3.分子的激发与失活
（1）分子的激发
基态→激发态(S1、S2、激发态振动能级)：吸收特定 频率的辐射，跃迁一次到位。 激发态→基态：多种途径和方式，速度最快、激发态 寿命最短的占优势。
光谱实验-本科实验讲义2011
0 1 lg lg T T tr
（2）
当一束平行单色光垂直照射到同种物质不同浓度，相同液层厚度的均匀透 明溶液时，入射光通量与溶液浓度的关系为
lg
0 k c tr
（3）
式中 k´为另一比例常数，它与入射光波长、液层厚度、溶液性质和温度有关。c 为溶液浓度。这就是比尔（Beer）定律。比尔定律表明；当溶液液层厚度和入射 光通量一定时，光吸收的程度与溶液浓度成正比。必须指出的是：比尔定律只能 在一定浓度范围才适用。因为浓度过低或过高时，溶质会发生电离或聚合，而产 生误差。 当溶液厚度和浓度都可改变时，这时就要考虑两者同时对透射光通量的影 响，则有 A lg
6
介质；三是吸收过程中，吸收物质互相不发生作用。 （2）吸光度的加和性 在多组分的体系中，在某一波长下，如果各种对光有吸收的物质之间没有 相互作用，则体系在该波长的总吸光度等于各组分吸光度的和，即吸光度具有加 和性，称为吸光度加和性原理。可表示如下：
A总 A1 A2 A3 An An
图 7 单色器（光栅）工作原理 常用的色散元件有棱镜和光栅两种，目前主要以光栅为主。 （3） 样品吸收池 吸收池又叫比色皿，是用于盛放待测液和决定透光液层厚度的器件。吸收 池一般为长方体（也有圆鼓形或其他形状，但长方体最普遍），其底及二侧为毛 玻璃，另两面为光学透光面。为保护两个光学面，必须做到： 第一，拿取吸收池时，只能用手指接触两侧的毛玻璃，不可接触光学面。 第二，不能将光学面与硬物或脏物接触，只能用擦镜纸或丝绸擦试光学面。 第三，凡含有腐蚀玻璃的物质溶液，不得长时间盛放在吸收池中。 第四，吸收池使用后应立即用水冲洗干净。生物样品、胶体或其它在吸收池光学 面上形成薄膜的物质要用适当的溶剂洗涤。 第五，不得在火焰或电炉上进行加热或烘烤吸收池。 （4） 检测系统 检测器又称接受器，其作用是对透过吸收池的光作出响应，并把它转变成 电信号输出， 其输出电信号大小与透过光的强度成正比。 常用的检测器有光电池、 光电管及光电倍增管等，它们都是基于光电效应原理制成的。作为检测器，对光 电转换器要求是：光电转换有恒定的函数关系，响应灵敏度要高、速度要快，噪
分子荧光光谱法
分子荧光光谱法又称分子发光光谱法或荧光分光光度法，即通常所谓的荧光分析法。
法。
该法是一种利用某一波长的光线照射试样，该法是一种利用某一波长的光线照射试样，该法是一种利用某一波长的光线照射试样，使试样吸收这一辐射，使试样吸收这一辐射，使试样吸收这一辐射，然后在发然后在发射出波长相同或波长较长的光线的化学分析方法。
如果这种再发射约在 s 内发生，则称为荧光；若能在生，则称为荧光；若能在 s 或更长的时间后发生，则称磷光。
分子荧光光谱法就是利用这种再发射的荧光的特性和强度来对荧光物质进行定性和定量分析的。
荧光分析法的突出优点是灵敏度高，其测定下限比一般分光光度法低二至四数量级。
级。
选择性也比分光光度法好，选择性也比分光光度法好，选择性也比分光光度法好，但其应用不如分光光度广泛，但其应用不如分光光度广泛，但其应用不如分光光度广泛，因为只有有限数量因为只有有限数量的化合物才能产生荧光。
的化合物才能产生荧光。
一、基本原理一、基本原理（一）（一） 荧光光谱的产生荧光光谱的产生荧光物质分子吸收了特定频率辐射后，荧光物质分子吸收了特定频率辐射后，由基态跃迁至第一电子激发态由基态跃迁至第一电子激发态由基态跃迁至第一电子激发态（或更（或更高激发态）高激发态）的任一振动能级，的任一振动能级，的任一振动能级，在溶液中这种激发态分子与溶剂分子发生碰撞，在溶液中这种激发态分子与溶剂分子发生碰撞，在溶液中这种激发态分子与溶剂分子发生碰撞，以以热的形式损失部分能量后，而回到第一电子激发态的最低振动能级（无辐射跃迁）。
然后再以辐射形式去活化跃迁到电子基态的任一振动能级，然后再以辐射形式去活化跃迁到电子基态的任一振动能级，便产生荧光。
便产生荧光。
由于无辐射跃迁的几率大，因此分子荧光波长常常比激发光长。
因此分子荧光波长常常比激发光长。
激发光源的波长通常是激发光源的波长通常是在紫外区，在紫外区，荧光也可能在紫外区，荧光也可能在紫外区，荧光也可能在紫外区，但更多是在可见区。
分子荧光光谱法(原理和方法)
概述
分子荧光光谱法(Molecular fluorescence spectroscopy )又称
为荧光光谱法或荧光分析法．是以物质所发射的荧光强度 与浓度之间的线性关系为依据进行的定量分析，以荧光光 谱的形状和荧光峰对应的波长进行行的定性分析．
荧光团杂化纳米二氧化硅微球
化合物
C6H5OH C6H5O— C6H5NH2
+ C6H5NH3
相对荧光 强度 18 10 20
0
荧光分光光度计
荧光分光光度计既可用于定量分析， 也可用于测绘激发光谱和荧光光谱
。荧光分光光度计既可用于定 量分析，也可用于测绘激发光谱 和荧光光谱。第一单色器选择激 发光波长（＞250nm的 紫外光）故称为激发单色器 第二单色器（荧光单色器） 与激发光入射方向垂直， 并选择荧光波长，可提高方法的选择性和准确度。
1. 激发
在室温下物质分子大部分处于基态的最低振动能级且电子自旋配对为单重
态．当吸收一定频率的电磁辐射发生能级跃迁时，可上升到不同激发态
的各振动能级，其中多数分子上升至第一激发单重态这一过程约需１０-
15秒.
激发
2 去活化过程
激发态分子的失活: 激发态分子不稳定，它要以辐射 或无辐射跃迁的方式回到基态
对于很稀的溶液，投射到样品溶液上的被吸收的激发光不到2%时， 即εbc＜=0.05时，上式的第二项后的各项可以忽略不计。则
F = φI0[1-(1-2.303 εbc)]=2.303 φ I0 εbc
当I0一定时 并且浓度C很小时,荧光强度与荧光物质浓度成正比
F = K·C
(K = 2.303 φ I0 εb)
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分子荧光光谱的特点
信息量大 灵敏度高
荧光不受来 自激发光的本底 的干扰，灵敏度 大大高于紫外可见吸收光谱， 测量用量很，方 法简便。 荧光光谱能提供较 多的参数，如激发 谱、发射谱、峰位、 峰强度、荧光寿命、 荧光偏振度等；还 可以检测一些紫外可见吸收光谱检测 不到的时间过程。
多元素测定
原子荧光 是向各个方向 发射的，便于 制作多道仪。
分子荧光光谱新技术
同步荧光光谱技术
同步荧光技术是在同时变化激发和发射波长的情况下 进行扫描，由测得的荧光强度信号对发射或激发波长作图， 即为同步荧光光谱。该法近几年得到迅速发展和广泛的应 用，出现了许多的新技术，如导数恒能量同步荧光法、三 维同步荧光法和可变角同步荧光法等。和常规荧光分析法 相比，同步荧光分析法具有谱图简化、选择性提高、光散 射干扰减少等特点，并且不需要预分离、操作简便、节省 分析成本、缩短分析时间，尤其适合对多组分混合物的分 析。
L/O/G/O
Thank You!
前表面荧光方法，以美拉德反应的产物糠氨酸 为指标，检测生乳中添加复原乳的含量，可以 检测到添加量 5%以上的复原乳。
与新油相比，煎炸后的食用油在 370～380nm 附近的 荧光峰消失，而 461nm 和479nm 附近出现的新荧光峰， 用以鉴定煎炸食用油。
荧光光谱在食品中的应用
分析食品种类
3 年陈、5 年陈、8 年陈酒 的荧光峰分别504、488、 505nm，最佳激发波长都在 370nm附近; 该研究为黄酒 的特征标识、品牌鉴定、年 代鉴别、黄酒食用安全等研 究提供了有科学意义的参考
首次建立了辣椒及辣椒素对照 品的三维荧光指纹图谱; 研究 表明，不同品种辣椒具有各自 特征的指纹图类型和特征指纹; 三维荧光指纹图谱可用来作为 鉴别辣椒品种和评价辣椒素含 量的有效手段
荧光光谱在食品中的应用
检测农药残留与污染物
同步荧光分析中，诺氟沙星、盐酸洛美沙星和乳酸左氧氟沙星三种 药物光谱重叠严重在 pH =2.87 的 BR 缓冲溶液中，波长差 Δλ =190nm 时，诺氟沙星、盐酸洛美沙星和乳酸左氧氟沙星的测量线 性范围分别为 0.016～0.40、0.01～0.336 和 0.01～0.336μg / mL; 检出限分别为0.0126、0.006 和 0.0072μg / mL。 采用恒能量同步荧光光谱法测定苯并芘 多环芳烃具有高荧光量子产率，可利用三维荧光光谱法进行测定
食品中含有很多具有荧光特性的物质如芳香族氨基酸、 蛋白质中色氨酸残基、多酚类物质、黄酮类物质、叶绿素、 维生素、核黄素以及美拉德产物等，一些食品添加剂、农 药和工业污染物也具有内源性荧光，这些物质的荧光图谱 为食品定性定量技术提供基本信息。
荧光光谱在食品中的应用
食品质量控制
肉与肉制品在加工 贮藏过程中的脂质 氧化和蛋白质氧化 问题
分子荧光光谱新技术
前表面荧光技术
荧光物质激发后，向四面八方发射荧光。为了消除入 射光与散射光的影响，一般取与激发光成直角的方向测量 荧光。这种方法有其自身的局限性，当样品的吸光度大于 0.1 或是大浊度样品时，发射光透出会遇到很大阻碍，普 通荧光方法就已不再适用。前表面荧光方法是将入射光与 样品成 30° 56° 或 ，只对比色杯表面一层的待测物质进行 检测，样品的光照面较大，可减少样品位置的敏感性，适 用于不透明的样品，省去了很多对样品前处理的步骤，适 用于快速检测。
分子荧光光谱新技术
三维荧光光谱技术
三维荧光光谱，是发射强度、激发波长、发射波长的三维 矩阵光谱，有两种表示方法，分别是以发射波长、激发波长、 荧光强度各自为轴的三维荧光立体图和等高线图，前者能较 完整地表达研究体系的荧光信息，后者具有指纹性，全面展 示了样品的所有荧光信息，可用峰位置、荧光强度、主峰陡 度以及走向角等特征参数对样品进行识别。
L/O/G/O
分子荧光光谱应用原理
荧光是受光激发的分子从第一激发单重态的最低振动 能级回到基态所发出的辐射，通常发生于具有刚性结构和 平面结构π 电子共轭体系的分子中。随着 π 电子共轭度和 分子平面度的增加，荧光强度随之增大，光谱相应红移， 其荧光光谱的形状和强度也相应发生变化，因此荧光光谱 是提供具有共轭结构的分子的组分分布与浓度大小的有效 测试手段之一。
分子荧光光谱分析的特点
虽然原子荧光光谱分析法有以上优点，但由于荧光 淬灭效应，以致在测定复杂基体的试样及高含量样品时， 尚有一定困难。此外，散射光的干扰也是原子荧光分析 中的一个麻烦问题。因此，原子荧光光谱分析法在应用 方面尚不及原子吸收光谱法和原子发射光谱法广泛，但 可作为这两种方法的补充。
荧光光谱在食品中的应用
脂质氧化导致过 热味的产生，并 且其二级产物具 有毒害作用。 荧光强度和 氧化程度高 度相关 蛋白质氧化反 应产生一些具 有荧光特性的 物质。
荧光光谱在食品中的应用
辨别食品真伪
采用前表面技术获得饮料的总荧光光谱和同步荧光光谱，结合 主成分分析和聚类分析技术对饮料分类。这些饮料的发射光谱 和同步荧光光谱波长差为90nm，有很好的区分度。
L/O/G/O
分子荧光光谱原理 与其在食品中的应用
食品工程 刘洋
分子荧光光谱在食品安全中的应用
主要内容
分子荧光光谱 分子荧光光谱的原理
分子荧光光谱的特点
分子荧光光谱新技术 分子荧光光谱的应用
分子荧光光谱应用原理
• 分子发光：处于基态的分子吸收能量（电、热、化学和光能等） 被激发至激发态，然后从不稳定的激发态返回至基态并发射出 光子，此种现象称为发光。发光分析包括荧光、磷光、化学发 光、生物发光等。 • 荧光：物体经过较短波长的光照，把能量储存起来，然后缓慢 放出较长波长的光，放出的这种光就叫荧光。 • 荧光的产生：气态自由原子吸收光源的特征辐射后，原子的外 层电子跃迁到较高能级，然后又跃迁返回基态或较低能级，同 时发射出与原激发波长相同或不同的发射即为原子荧光。原子 荧光是光致发光，也是二次发光。当激发光源停止照射之后， 再发射过程立即停止。