酶法提取生猪皮胶原工艺条件的研究

工 艺 技 术
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食品工业科技
酶法提取生猪皮胶原工艺条件的研究
（北京化工大学化学工程学院， 北京 !"""#$） 施辉阳 张 鹏
究工作主要侧重于产物的结构及生物理化性能方
要： 以生猪皮为原料， 利用酶法提取胶原。对实验中各主要影 响因素进行了分析，实验结果表明，以胶原提取率为指 标， 胃蛋白酶作用效果最佳； 酶提取的最优条件为： %& ， ! （酶 ） （原 料 ） 盐析的最优条件为： ’! (!’)" ， *#+； %& ， ,-./ 浓度 %01/ 2 3 ， 产率 （以干 45+。以优化后的工艺提取胶原， 重计） 可以达到 !56， 纯度可以达到 $5746。 测定了产物的 紫外和红外光谱图， 结果表明， 利用胃蛋白酶提取的猪皮 胶原最大程度地保持了其天然结构，可以应用于高附加 值领域。 关键词： 胶原， 猪皮， 酶 摘
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胶原的紫外分光吸收测定
采用日本岛津公司的 789:!!! 紫外分光光度计
（酶） ： J 作用 H 作用 I$ 实验号 空白 温度 （C ;(
胶原的傅立叶变换红外图谱
胶 原 样 品 冷 冻 干 燥 后 ， 采 用 *;<%&=> ?@ 8#"!A
光谱仪进行测定。
89()$$$ 紫外分光光度计 ;<
恒温水浴锅 GH1IJ； 离心机
日本岛津公司； :!(
=4>?@AB CD 9.&$, ， E’7’DF #$$C 电 子 天 平
天津市中环科技开发公司； K#(#%
LA>M61N； ’7OP’ %(# 冷冻干燥机
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胶原的提取方法
胶原具有较低的热稳定性，温度超过其稳定
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从表 5 可以看出， 以胶原的提取率为指标， 胃蛋 白酶的作用效果最显著。这可能是由于酶提取在浓 其 0,)F: 接 近 于 度为 !"#$%& ’ ( 的醋酸介质中 进 行 ， 胃蛋白酶的最适 0,) 造成的 （木瓜蛋白酶和胰酶的 。 因此， 我们选用胃蛋白酶提取 最适 0, 接近于中性） 猪皮胶原。
值后即发生变性。虽然各文献报道的胶原变性温 度因其原料来源不同而略有差异，但都不超过 胶原是由动物细胞合成的一种生物性高分子， 在食品工业/%0等领域都有着广泛的应用。 以猪皮为原料，利用酶法提取胶原具 有 如 下 优 势： 猪皮被作为下脚料， 1& 在猪肉的加工分割过程中， 其利用效率很低， 除 少 部 分 用 于 制 革 工 业 外2大 部 分 有待开发和利用， 原料充足； 可 3& 用蛋白酶处理猪皮， 以水解掉胶原纤维的末端肽， 提高胶原的产率， 且不 会破坏胶原的三股螺旋结构 /#0。 目前国内有关酶法提取生猪皮胶原的 研 究 成 果 较少， 胡 胜 /)0 等 使 用 工 业 化 的 蛋 白 酶 提 取 猪 皮 胶 原 ， 得到的主要是胶原的水解产物。李贺/+0等使用胃蛋白 酶提取生猪皮胶原， 并测定了产物的结构表征， 其研 猪皮胶原的提取要保持在较低温度下 +$R 。因 此 ， 整 个 实 验 过 程 保 持 在 低 于 %$R 进行。 参 照 文 献 /.0 ， 下进行。
H 盐析 I *+J& 浓 J 盐析 空白 温度 （C ） 度 （$%& ’ (） 时间 （D ）
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从表 ) 可以看出，酶用量是影响 胶 原 提 取 率 的 主要因素， 其次是提取时间， 提取温度的影响相对较 即 /C ， （酶） （原 小； 提 取 的 最 优 方 案 为 H)I:J:， ! B! 料） 由验证 E5B#! ， A)D 。由于实验方案中并无此实验， 实验得到胶原的提取率为 2!")26 。
原沉淀。
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纯化干燥
盐析后得到的胶原沉淀溶解于
!""# 年第 $ 期
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!"#$%"$ &%’ ($")%*+*,- *. /**’ 0%’1234用量外， 反应温度、 反应时间、 0, 等都 有 不 同 程 度 的 影响。参考有关文献并经初步实验， 确定醋酸溶液的 初始 0, 为 用量为每 5G 猪皮中加入 5!$( 醋酸溶液， 选定胃蛋白酶作用温度 （H） 、 胃蛋白酶用量 （I） 和胃 )。 蛋白酶作用时间 （J） 为主要因素， 根据表 ) 设计正交 实验， 酶提取完成后用两层医用纱布过滤， 测定滤液 中胶原的含量， 计算胶原的提取率 （提取率 E 提取液中 ， 结果见表 )。 胶原总量 ’ 猪皮原料中胶原总量） 表) 酶提取实验方案与结果 胶原提 取率 （6）
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盐析条件的优化
采用优化后的酶提取工艺制备一 定 量 的 猪 皮 胶
原提取液用于盐析实验， 测定其中的胶原含量。经初 、 （I ） 、 盐析时间 步实验， 选定盐析温度 （H ） *+J& 浓 度 （J ） 为主要因素， 根据表 : 设计正交实验， 盐析后测 定产物中胶原的含量， 计算胶原的回收率 （回 收 率 E 盐析产物中胶原总量 ’ 胶原提取液中胶原总量） ， 结 果见表 : 。 表: 实验号 盐析实验方案与结果 胶原回 收率 （6）
中图分类号： !"#$%&# 文献标识码： ’ 文 章 编 号 ： %$$#($)$* （#$$+ ） $,($$-)($)
国生物技术发展中心；假丝酵母脂肪酶 司； 胰酶 白酶 北京化学试剂公司； 7( 羟脯氨酸
"4561 公
生化试剂， 分
中国医药集团上海化学试剂公司； 木瓜蛋
中国科学院生物物理所中生公司； 乙酸、 氯化 钠 析纯， 北京化工厂； 其它试剂 均为分析纯。
!"#$%& ’ ( 的 醋 酸 溶 液 中 ， 然 后 在 !"!)$%& ’ ( 的
（ 中透析， 所得胶原 沉 淀 ， 冷冻干燥即 *+),-. / 0,1"2 ） 可得到高纯度的产品。
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胶原含量的测定方法
参照文献 324 的方法测定猪肉及其制品中羟脯氨
酸的含量。 羟脯氨酸是胶原的特征成分， 根据文献 3#4， 羟脯氨酸仅存在于胶原、 弹性蛋白和伸展蛋白中， 而 不存在于一般蛋白质中。其在胶原中的含量为胶原 因此， 可以通过测定羟脯氨酸的含量 总质量的 5!6 ， 来计算胶原的含量。
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结果与讨论
蛋白酶种类的选择
在常用的蛋白酶中，胃蛋白酶常常被 用 来 提 取
动物组织中的胶原，此外也有用木瓜蛋白酶和胰酶 提取胶原的报道。我们对这三种酶的作用效果进行 了对比实验，目的是筛选出一种适用于提取生猪皮 胶原的酶。 取一定量的猪皮进行预处理， 测定猪皮中胶原 的含量。取胃蛋白酶、 木瓜蛋白酶和胰酶， 分别用 福 林 法 测 定 酶 活 。预 处 理 过 的 猪 皮 原 料 分 成 三 份 ， 分别加入三种蛋白酶 （胃 蛋 白 酶 和 猪 皮 的 质 量 比 控制木瓜蛋白酶和胰酶的用量， 使三种 为 5B5!! ， 蛋白酶具有相同的活力单位） ， 酶提取温度设定为 酶 提 取 时 间 为 A)D 。 酶提取完成后用两层医用 /C ， 纱布过滤， 测定滤液中胶原的含量， 计算胶原的提 取 率 （提 取 率E提 取 液 中 胶 原 总 量 ’ 猪 皮 原 料 中 胶 原总量） 。 三种蛋白酶的提取率见表 5 。 表5 指标 胶原提取率 （6） 三种蛋白酶提取率的比较 蛋白酶 胃蛋白酶 木瓜蛋白酶 胰蛋白酶
（XP#V) ） 中处理一段时 酶， 在 $&.6?@ W 7 的 醋 酸 溶 液 间 （,#H 以内） ， 用两层医用纱布过滤。
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盐析
在 滤 液 中 直 接 加 入 =1Q@ 固 体 进 行 盐
， 离心分离， 得到胶 析 （=1Q@ 最 终 浓 度 小 于 +6?@ W 7）
收稿日期： #$$)(%#(%. 作者简介：施辉阳 （!$*89 ） ， 男， 在读硕士， 研究方向： 酶法生产精细化 工产品。
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预处理
新鲜猪皮洗净脱毛后切碎，加入
%$S 的 =1Q@ 溶液浸泡 %#H ，以除去盐溶性蛋白及 其
他可溶性杂质。用去离子水洗涤三 次 后 按 ! （酶 ） T! （猪皮） 处理 #+H 脱脂。 U%T%$$ 加入假丝酵母脂肪酶， 倒掉处理液， 用去离子水洗涤 #V) 次。
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酶提取
在预处理过的猪皮原 料 中 加 入 蛋 白
面。在本论文中， 我们采用新的提取工艺， 并且对影 响酶法提取生猪皮胶原的各主要因素进行了分析， 确立了最佳工艺条件。同时还对产物进行了紫 外 和 红外光谱分析。
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材料与方法