胶原蛋白的制备与鉴定
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酸法提取是用酸浸 泡预处理后的材料 ，再经离心等操作 提纯的提取方法。 常用的酸有：乙酸 、盐酸、草酸、柠 檬酸、醋酸以及乳 酸等 .
主要影响因素
在影响酸法提取的诸多因 素中，pH 的影响不大，但 pH 值过小胶原大分子带正 电荷，因电荷之间的排斥 作用使胶原不能形成稳定 的凝胶；
动物皮的种类以及对皮的 预处理也是重要影响因素 之一；酸的种类和浓度、 以及提取温度和时间影响 都较大。一般情况下，提 取率随温度升高、时间延 长而提高，但时间过长或 温度过高导会导致胶原变 性从而使提取率降低。.
影响因素
影响碱法提取的因素 主要有碱浓度、提取 温度、预处理、pH 以及时间。一定范围 内提高碱浓度有利于 提高胶原蛋白提取率 。一定范围内提高温 度，有利于水解得到 相对分子量较小的胶 原产物，但超过范围 会导致胶原的生物活 性丧失。
（3）酶法提取
原理
发展
预处理
主要因素 工艺特点
酶法提取是在预处理 后的材料中加入酶制 剂，溶解材料，wk.baidu.com经 过其他操作提取胶原
2.2、胶原蛋白的提取
• 提取一般由下列步骤组成： • 萃取、分离、提纯
• 2.2.1、萃取
• 萃取具体操作方式和控制条件因皮源的不同而 有所差异。以下是几种常用的方法:
• 酸法提取 • 碱法提取 • 酶法提取 • 此外，还有酸酶结合法、酸碱结合法、酸碱与
热水结合法等。
（1）酸法提取
原理及常用材料
例证
1 叶易春等通过对酸法提取 猪皮胶原分析得出：酸法提 取时，提取时间不同，其相 对分子量及分布基本相同
2 户业丽等以酸法提取鲟鱼皮胶原蛋 白，通过正交试验得出：乳酸较乙 酸、柠檬酸提取率高；随着乳酸浓 度的增加，胶原蛋白的提取率也随 之增加，但当浓度超过1 mol/L 后， 由于胶原蛋白变性导致提取率下降； 在一定范围内浸提时间越长，胶原 提取率增加越快，而后趋于平稳， 最后还有可能会降低。其实验得出 对胶原提取率的影响程度：酸浓度 ＞提取时间＞温度＞固液比。
2.2.2、分离
分离是对提取得得胶原溶液中各类胶原进行初步分级 （1）盐析分级
盐析分级是常用的分离方法：恰当地控制溶液的盐浓度， 使特定的胶原析出。 （2）热胶化分离 利用不同类型的胶原可胶化性的差异，使得部分胶原被胶 化而与其他胶原分离的方法。 （3）变形和复性分离 已知含双硫键的分子在变性后的复性要比不含双硫键的快 的多。I型与II型胶原的分离，可以利用这一性质。
求得该蛋白质样品 中的含氮量．再通 过换算得知样品中 的蛋白质含量
转化蛋白质中的氮
测量氨的含量
计算
虽有普遍性,但操作繁琐费时
光吸收法
由于蛋白质含有芳香族氨基如色氨酸 (Trp)和酪氨酸(Tgr)，故在280nm有吸 收最大峰。用280nm光吸收值可定量 测定该种蛋白质的量，但是每种蛋白
质中的芳香族氨基酸含量不同，故采 用280nm光吸收为1时，吸光度等于 1mg/mI来计算另由于核酸类杂质在 280nm也有光吸收为了排除其扰．采 用280nm和260nm光吸收值用下式计 算蛋白质浓度(mg/mI)=145A～074A。 最难确定的方法是用蛋白质的摩尔吸 光系数计算精确称取1mg～10mg已恒 重过的纯蛋白的样品.配成1mg／mI 浓度的样品．测其在280nm下的光吸 收值可得出该蛋白质的克分子消光系
• 以Ⅰ 型胶原为例，其一级结构， 胶原中含有较为伸展的左手螺旋 区段以及非螺旋区段，在螺旋区 段中则呈现出了（Gly- X- Y）n （其中X，Y 代表非甘氨酸）的周 期性排列。
• 二级结构则由三条呈左手螺旋的 肽链形成的右手大螺旋（如右图 所示）。三股螺旋分子间以一定 间距、呈纵向对称交错排列形成 原纤维，再聚集成纤维，然后形 成更大的纤维束。
考马斯亮蓝 G250法
凯氏定氮法 胶原蛋白的定量分析
光吸收法
福林酚法
••••••
双缩脲法
凯氏定氮法
条件
变氮为氨
蛋白质都有其
恒定的含氮量 (约14％～16 ％),
将一定量的蛋
白质用浓硫酸 消化分解使其 中的氮变成铵 盐
吸收氨
计算
与浓NaOH作用使氨气释放 出后硼酸标准溶液吸收再 用标准酸直接滴定．或用 标准酸液吸收氨气后用反 滴定法滴定残留的酸
2.2.3、提纯
经过提取和分离得到的 胶原样品仍在不同程度 上含有其他类型的胶原， 此外，还携带有某些类 粘蛋白、球蛋白杂质， 需经过进一步提纯。胶 原蛋白的提纯主要使用 层析方法，如离子交换 层析和凝胶过滤层析等。
三、胶原蛋白的鉴定
1、胶原蛋白的定量 蛋白质的定量是研究蛋白质的基本
步骤，定量研究的数据是其它进一步 研究的基础,定量测定蛋白质的浓度的 方法很多,有凯氏定氮法双缩脲法、福 林酚法和紫外光吸收法、考马斯亮蓝 法、氨基酸分析法。
（2）碱法提取
原理
用碱溶解预处理后的材 料，从而达到提取胶原 蛋白的目的。预处理时 除去皮中的脂肪、污渍 、杂质等越好，就越有 利于胶原蛋白的提取。 已经有人以碱法提取皮 革废弃物中的胶原蛋白 ，其中最关键的是脱铬 。
优劣势
采用该法能有效胡提高 提取率，但只能
得到相对分子量较小的 胶原蛋白水解产物，应 用价值并不太高。与其 他提取法相似，提取时 间的延长在一定范围内 可以使提取率增加。
蛋白。
目前国内采用酶法
提取胶原时的水解 温 度 基 本 在 50 ℃ 以上或4 ℃以下， 而胶原在37~38 ℃ 以上就会变性，生
成明胶，故较高温
度下的提取物为变
性胶原，其进一步 应 用 受 到 限 制 [13] 。 低温下虽然有助于
胶原结构的完整， 但酶解时间长。
预处理是除去皮源中 的不同杂物，如钙物 质、脂肪等，以便后 续操作，得到更多更 纯的胶原。李国英等 在通过优化预处理来 提取胶原的研究中指 出：对比而言，预处 理主要集中在去钙上， 因为那些无机物质中 最主要的成分是钙， 钙会降低胃蛋白酶活 性从而影响胶原提取 率。可见预处理对于 胶原提取率的影响较 大。
影响因素主要有酶的 用量、水解pH、水解 时间、以及水解温度。 工艺为：预处理→酶 解→盐析→透析→冷 冻干燥。用酶解法提 取胶原蛋白是目前比 较理想的手段，它具 有反应快、时间短、 对环境友好，提取胶 原蛋白纯度高、水溶 性好、理化性质稳定 等特点
（4）影响因素分析
• 皮源 • 预处理情况 • 提取液浓度 • pH • 提取温度 • 提取时间 • 有的还有提取液固液比、提取工艺等
主要影响因素
在影响酸法提取的诸多因 素中，pH 的影响不大，但 pH 值过小胶原大分子带正 电荷，因电荷之间的排斥 作用使胶原不能形成稳定 的凝胶；
动物皮的种类以及对皮的 预处理也是重要影响因素 之一；酸的种类和浓度、 以及提取温度和时间影响 都较大。一般情况下，提 取率随温度升高、时间延 长而提高，但时间过长或 温度过高导会导致胶原变 性从而使提取率降低。.
影响因素
影响碱法提取的因素 主要有碱浓度、提取 温度、预处理、pH 以及时间。一定范围 内提高碱浓度有利于 提高胶原蛋白提取率 。一定范围内提高温 度，有利于水解得到 相对分子量较小的胶 原产物，但超过范围 会导致胶原的生物活 性丧失。
（3）酶法提取
原理
发展
预处理
主要因素 工艺特点
酶法提取是在预处理 后的材料中加入酶制 剂，溶解材料，wk.baidu.com经 过其他操作提取胶原
2.2、胶原蛋白的提取
• 提取一般由下列步骤组成： • 萃取、分离、提纯
• 2.2.1、萃取
• 萃取具体操作方式和控制条件因皮源的不同而 有所差异。以下是几种常用的方法:
• 酸法提取 • 碱法提取 • 酶法提取 • 此外，还有酸酶结合法、酸碱结合法、酸碱与
热水结合法等。
（1）酸法提取
原理及常用材料
例证
1 叶易春等通过对酸法提取 猪皮胶原分析得出：酸法提 取时，提取时间不同，其相 对分子量及分布基本相同
2 户业丽等以酸法提取鲟鱼皮胶原蛋 白，通过正交试验得出：乳酸较乙 酸、柠檬酸提取率高；随着乳酸浓 度的增加，胶原蛋白的提取率也随 之增加，但当浓度超过1 mol/L 后， 由于胶原蛋白变性导致提取率下降； 在一定范围内浸提时间越长，胶原 提取率增加越快，而后趋于平稳， 最后还有可能会降低。其实验得出 对胶原提取率的影响程度：酸浓度 ＞提取时间＞温度＞固液比。
2.2.2、分离
分离是对提取得得胶原溶液中各类胶原进行初步分级 （1）盐析分级
盐析分级是常用的分离方法：恰当地控制溶液的盐浓度， 使特定的胶原析出。 （2）热胶化分离 利用不同类型的胶原可胶化性的差异，使得部分胶原被胶 化而与其他胶原分离的方法。 （3）变形和复性分离 已知含双硫键的分子在变性后的复性要比不含双硫键的快 的多。I型与II型胶原的分离，可以利用这一性质。
求得该蛋白质样品 中的含氮量．再通 过换算得知样品中 的蛋白质含量
转化蛋白质中的氮
测量氨的含量
计算
虽有普遍性,但操作繁琐费时
光吸收法
由于蛋白质含有芳香族氨基如色氨酸 (Trp)和酪氨酸(Tgr)，故在280nm有吸 收最大峰。用280nm光吸收值可定量 测定该种蛋白质的量，但是每种蛋白
质中的芳香族氨基酸含量不同，故采 用280nm光吸收为1时，吸光度等于 1mg/mI来计算另由于核酸类杂质在 280nm也有光吸收为了排除其扰．采 用280nm和260nm光吸收值用下式计 算蛋白质浓度(mg/mI)=145A～074A。 最难确定的方法是用蛋白质的摩尔吸 光系数计算精确称取1mg～10mg已恒 重过的纯蛋白的样品.配成1mg／mI 浓度的样品．测其在280nm下的光吸 收值可得出该蛋白质的克分子消光系
• 以Ⅰ 型胶原为例，其一级结构， 胶原中含有较为伸展的左手螺旋 区段以及非螺旋区段，在螺旋区 段中则呈现出了（Gly- X- Y）n （其中X，Y 代表非甘氨酸）的周 期性排列。
• 二级结构则由三条呈左手螺旋的 肽链形成的右手大螺旋（如右图 所示）。三股螺旋分子间以一定 间距、呈纵向对称交错排列形成 原纤维，再聚集成纤维，然后形 成更大的纤维束。
考马斯亮蓝 G250法
凯氏定氮法 胶原蛋白的定量分析
光吸收法
福林酚法
••••••
双缩脲法
凯氏定氮法
条件
变氮为氨
蛋白质都有其
恒定的含氮量 (约14％～16 ％),
将一定量的蛋
白质用浓硫酸 消化分解使其 中的氮变成铵 盐
吸收氨
计算
与浓NaOH作用使氨气释放 出后硼酸标准溶液吸收再 用标准酸直接滴定．或用 标准酸液吸收氨气后用反 滴定法滴定残留的酸
2.2.3、提纯
经过提取和分离得到的 胶原样品仍在不同程度 上含有其他类型的胶原， 此外，还携带有某些类 粘蛋白、球蛋白杂质， 需经过进一步提纯。胶 原蛋白的提纯主要使用 层析方法，如离子交换 层析和凝胶过滤层析等。
三、胶原蛋白的鉴定
1、胶原蛋白的定量 蛋白质的定量是研究蛋白质的基本
步骤，定量研究的数据是其它进一步 研究的基础,定量测定蛋白质的浓度的 方法很多,有凯氏定氮法双缩脲法、福 林酚法和紫外光吸收法、考马斯亮蓝 法、氨基酸分析法。
（2）碱法提取
原理
用碱溶解预处理后的材 料，从而达到提取胶原 蛋白的目的。预处理时 除去皮中的脂肪、污渍 、杂质等越好，就越有 利于胶原蛋白的提取。 已经有人以碱法提取皮 革废弃物中的胶原蛋白 ，其中最关键的是脱铬 。
优劣势
采用该法能有效胡提高 提取率，但只能
得到相对分子量较小的 胶原蛋白水解产物，应 用价值并不太高。与其 他提取法相似，提取时 间的延长在一定范围内 可以使提取率增加。
蛋白。
目前国内采用酶法
提取胶原时的水解 温 度 基 本 在 50 ℃ 以上或4 ℃以下， 而胶原在37~38 ℃ 以上就会变性，生
成明胶，故较高温
度下的提取物为变
性胶原，其进一步 应 用 受 到 限 制 [13] 。 低温下虽然有助于
胶原结构的完整， 但酶解时间长。
预处理是除去皮源中 的不同杂物，如钙物 质、脂肪等，以便后 续操作，得到更多更 纯的胶原。李国英等 在通过优化预处理来 提取胶原的研究中指 出：对比而言，预处 理主要集中在去钙上， 因为那些无机物质中 最主要的成分是钙， 钙会降低胃蛋白酶活 性从而影响胶原提取 率。可见预处理对于 胶原提取率的影响较 大。
影响因素主要有酶的 用量、水解pH、水解 时间、以及水解温度。 工艺为：预处理→酶 解→盐析→透析→冷 冻干燥。用酶解法提 取胶原蛋白是目前比 较理想的手段，它具 有反应快、时间短、 对环境友好，提取胶 原蛋白纯度高、水溶 性好、理化性质稳定 等特点
（4）影响因素分析
• 皮源 • 预处理情况 • 提取液浓度 • pH • 提取温度 • 提取时间 • 有的还有提取液固液比、提取工艺等