第五章 发酵工程的灭菌与空气除菌-董媛

这种现象称作
惯性冲击滞留作用
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惯性冲击滞留作用
气流速度下降到微粒的惯性力不足以使微粒脱离主导气 流对纤维产生碰撞，即在气流的任一处，微粒也随气流改变 方向而绕过纤维前进，即b = 0，纤维的碰撞滞留效率等于 0，这时的气流速度称为惯性碰撞的临界速度vc。
vc =
Vs 1－
Vs — 容器截面的空气速度； — 介质填充密度
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五、空气过滤除菌流程 2、空气净化的流程：
空气高空吸入 前过滤 空气压缩 冷却 油、水分离 加温 空气总过滤器 分过滤器 (无菌空气) 发酵罐/种子罐
空 气 吸 气 口
粗 过 滤 器
空 气 压 缩 机
一 级 冷 却 器
二 级 冷 却 器
分 水 器
空 气 贮 罐
无 菌 空 气
分 过 滤 器
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（二）介质过滤除菌的原理 1、惯性冲击滞留作用
当微生物等颗粒随空气以一定速度流动，在接近纤维时， 气流碰到纤维而受阻，空气就改变运动方向绕过纤维继续前 进。但微生物等颗粒由于具有一定质量，在以一定速度运动 时具有一定惯性，碰到纤维时，由于惯性作用而离开气流碰 到纤维表面上，由于摩擦、粘附作用，被滞留在纤维表面上。
2) 活性炭 3mm ,长5 – 10 mm, 圆柱状，有较大的 表面积，通过物理吸附作用而吸附微生物。； 3）玻璃纤维 8–19 m；
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过滤器进行灭菌时，一般是自上而下通入0.2-0.4 Mpa的 蒸汽，灭菌45min后用压缩空气吹干备用。总过滤器约每 月灭菌一次。
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纤维素酯微孔滤膜，孔径≤0.5μm
2.连续灭菌
※※2.1 发酵培养基的灭菌
1）分批灭菌：又称间歇灭菌，是将配制好的培养 基全部输入到发酵罐内或其他装置中，通往蒸汽 将培养基和所用设备加热至灭菌温度后维持一定 时间，再冷却到接种温度，这一工艺过程也称为
实罐灭菌。
1） 分批灭菌
优点：不需要其他设备，操作简单易行，规模
较小的发酵罐往往采用分批灭菌的方法。
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第二节 培养基与发酵设备的灭菌
工业上具体措施包括 （1）使用的培养基和设备须经灭菌； （2）好氧培养中使用的空气应经除菌处理；
（3）设备应严密，发酵罐维持正压环境；
（4）培养过程中加入的物料应经过灭菌；
（5）使用无污染的纯粹种子。
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一、培养基的灭菌
（一）培养基灭菌方法
1.分批灭菌
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硅酸硼纤维微孔滤膜：孔径0.1μm
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2). 滤纸过滤器：
介质:超细玻璃纤维纸。 孔径:0.5-5μm 厚度: 0.25-1mm 实密度:2600Kg/m3 填充率:14.8%。
除菌效率高，阻 力小，强度低。
用酚醛树脂，甲 基丙烯酸树脂等 处理以提高防湿 能力 用多孔板夹住提 高其抗冲击能力。
dt
KN
死亡速率 残存活菌数
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积分

N
N0
dN / N K dt
0
t
ln(N t / N 0 ) Kt N t 2.303 N t 1 t ln lg K N0 K N0
N0---灭菌开始(t=0)时，原有活菌数（污染度)
存活率
Nt ---经过灭菌时间t后残存活菌数
作属于灭菌，哪 些属于消毒呢？ 消毒“ disinfection” ：采用物理或化学方法杀死容
器、器具内外、车间、厂区等环境中的病原微生物， 但一般只能杀死营养细胞而不能杀死细菌的芽孢。例 如巴氏灭菌法（60℃，30 min）。
灭菌的方法
1、干热灭菌法
常用烘箱，灭菌条件为在160℃下 保温1h，适用范围：金属或玻璃器皿
由耐高温，疏水的，厚度为150μm的聚四氟乙烯薄膜构 成。能绝对滤除所有的大于0.01μm 以上的微粒，能除去几 乎所有空气中夹带的微生物。 过滤器体积小，处理 量大，压降小，除菌 效率高
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聚四氟乙烯微孔滤膜：孔径0.2μm或0.5μm
Fluoropore（TPFE）： 0.2μm，阻力小，疏 水性好，不受水的影响而堵塞滤孔，耐1250C 高温
物，抑制DNA正常复制；
空气在紫外线照射下产生的臭氧（O3）
也有一定的杀菌作用。
http://211.84.144.22/jing/C76/zcr-1.htm
化学灭菌的机理
试举例几种常 用化学消毒剂 浓度及使用范 围？
一些化学物质与微生物细胞中的某种 成分产生化学反应，如使蛋白质变性、核 酸的破坏、酶类失活、细胞膜透性的改变 而杀灭微生物。
实际设计时常采用Nt=0.001
2.3发酵设备的灭菌
• 空罐灭菌 • 空罐灭菌也称空消。无论是种子罐、发酵罐、 还是尿素（或液氨）罐、消泡罐，当培养基（ 或物料）尚未进罐前对罐进行预先灭菌，为空 罐灭菌。 • 为了杀死所有微生物特别是耐热的的芽孢，空 罐灭菌要求温度较高，灭菌时间较长，只有这 样才能杀死设备中各死角残存的杂菌或芽孢。
2） 连续灭菌
概念：是将培养基通过专门设计的灭菌器，进行连 续流动灭菌后，进入预先灭菌过的发酵罐中的灭 菌方式，也称为连消。 条件：在短时间加热使料液温度到灭菌温度126-
132℃，在维持罐中保温5-8 min，快速冷却后进
入灭菌完毕的发酵罐中。
2） 连续灭菌
优点：
1) 减少养分破坏，产品质量较易控制 2) 提高产量，缩短发酵周期 3) 设备利用率高，操作方便 4) 适于自动控制，劳动强度低 缺点：需外设加热、冷却装置，操作复杂，染菌机 会多，不适合含有大量固体物料培养基的灭菌。
原理：在干燥高温条件下，微生物细胞内的各种与温度 有关的氧化还原反应速度迅速增加，致死微生物。
2、射线灭菌法
电磁波、紫外线或放射性物质 适用范围：无菌室、接种箱、工业原料
3、化学试剂灭菌法
化学试剂：甲醛、乙醇或新洁尔灭、高锰酸钾等 适用范围：环境空气、皮肤及器械的表面消毒
紫外线杀菌的机理
微生物细胞在紫外线照射下细胞中DNA 遭到破坏，形成胸腺嘧啶二聚体和胞嘧啶水合
http://211.84.144.22/jing/C76/zcr-1.htm
4、过滤除菌法
利用过滤方法阻留微生物 适用范围：制备无菌空气
5、臭氧灭菌法
适用范围：洁净室和净化设备消毒
臭氧发生器
过滤除菌的方法
实验室内用过哪 些过滤器呢？
用0.01~0.45 μm孔径滤膜对压缩空气、酶 溶液、啤酒及其他不耐热化合物溶液除菌。 过滤除菌的原理
留。这就是阻截（拦截）滞留作用
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3、布朗运动
直径小于1m的微粒在很慢的气流中能产生一种不规则 的直线运动，即布朗运动。 使较小的颗粒凝聚为较大颗粒，随即可能产生重力沉降 或被过滤介质截留； 气流速度大时，凝聚现象为惯性碰撞所取代
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4、重力沉降作用
再小的微粒也有重力； 当微粒所受的重力大于气流对它的拖带力时，微粒就会 沉降。 对于小颗粒而言，只有在气流速度很慢时才起作用。 一般它是与拦截作用相配合的，即在纤维的边界滞留区 内，微粒的沉降作用提高了拦截滞留的捕获效率。
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（二）空气预处理
2．粗过滤器 安装在空气压缩机前的粗过滤器，其主要作 用：捕集较大的灰尘颗粒，防止压缩机受损，同 时也可减轻总过滤器负荷。 粗过滤器一般要求过滤效率高，阻力小，否 则会增加空气压缩机的吸入负荷和降低空气压缩 机的排气量。 常用的粗过滤器有：布袋过滤、填料式过滤、 油浴洗涤和水雾除尘等。
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5、静电吸引作用
许多微生物和孢子都带有电荷 具有一定速度的气流通过介质滤层时，由于摩擦作用而产 生诱导电荷 当菌体所带电荷与介质电荷相反时，即发生静电吸附作用
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四、介质过滤除菌的原料
（一）空气过滤除菌的介质
1）纤维及颗粒状介质的过滤器 ：用于总过滤器。 1）棉花 宜选用纤维细长、疏松的新棉花；
惯性碰撞的临界速度受填充密度的影响
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2、拦截滞留作用
当气流速度在临界速度以下，颗粒不再由于惯性碰撞而 滞留。但是，颗粒质量很小，在气流绕过纤维时，颗粒仍 然随气流运动，在气流速度低时，在纤维周边形成一层边 界滞留区，在滞流区内气流速度更慢，进入滞留区的颗粒 缓慢接近纤维，并与之接触，由于摩擦、粘附作用而被滞
缺点：1）加热和冷却所需时间较长，增加了发酵的准 备时间，也就相应地延长了发酵周期，使发酵罐的利 用率降低。
2）分批灭菌无法采用高温短时间灭菌，因而不可
避免地使培养基中营养成分遭到一定程度的破坏。
150
保温
100 温度/℃ 冷却 加热 50
40
80
120
160
200
240
时间/min
分批灭菌包括升温、保温和冷却3个阶段。
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三、空气净化的方法
热灭菌法 辐射灭菌法 静电除菌法 介质过滤除菌法
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二、空气除菌的方法
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二、空气除菌的方法
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空气的过滤除菌
绝对过滤
深度过滤
介质的空隙
小于被拦截的 微生物大小， 如用聚四氟乙wenku.baidu.com烯或纤维素酯 材料做成的微 孔滤膜。
过滤 介质
介质孔隙大于
总 过 滤 器
空 气 加 热 器
丝 网 除 末 器
旋 风 分 离 器
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五、空气过滤除菌流程
（一）空气预处理 空气预处理的主要目的： 1 ．提高压缩空气的洁净度，降低空气过滤器的 负荷。 2 ．去除压缩后空气中所带的油水，以合适的空 气湿度和温度进入空气过滤器。 采风塔: ≥10m ,上风头, 流速8m/s.
利用高质量的无碱玻璃采用喷制法制成的 1 – 1.5 m的 细丝；
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3）金属烧结管空气过滤器：
压缩空气进入壳程，通过金属微孔滤管的壁除去杂菌和颗粒， 得到的无菌空气由管程排出。 使用寿命长，耐 高热，气体阻力 小，安装维修方 便。
空气预过滤器和 蒸汽过滤器。
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4）微孔膜过滤器----绝对过滤器：
被拦截的微生物 大小，但介质有 一定厚度，机理 是静电，扩散， 惯性及拦截作用。 如棉花过滤器， 超细玻璃纤维纸， 金属烧结管等。
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（二）空气过滤除菌的原理
介质过滤是以大空隙的介质过滤层除去较小颗粒， 这显然不是面积过滤（即不是绝对过滤），而是 一种滞留现象。这种滞留现象是由多种作用机制 构成的，主要有惯性碰撞、阻截、布朗运动、重 力沉降和静电吸引等。
※※2.2. 培养基灭菌动力学——对数残留定 律 *** 微生物死亡速率与任一瞬间残存的活 菌数成正比——对数残留定律 即
热死速度常数（杀菌速度常数） 灭菌时间（min） 与菌的种类和加热温度有关 （min-1）。是判断微生物 受热死亡难易程度的基本依 据。K值俞小，则此微生物 俞耐热。
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第五章 发酵工程的灭菌与空气 除菌
吉林医药学院 董 媛
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本章内容
1 2 3 4
常用灭菌方法和发酵设备种类 培养基的灭菌 发酵设备的清洗和灭菌
空气的除菌
※※灭菌与消毒
灭菌“ sterilization” ：采用物理或化学方法杀死或 除去物料、空气、容器、器具等环境中所有微生物，
实验室内哪些操 包括营养细胞、细菌芽孢和孢子。
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※※第三节 空气的除菌
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分布规律： 微生物在空气中的分布情况与空气环境因 素有关，空气质量愈好，微生物的种类及 数量愈低。发酵工厂通常采用高空采气的 方法。
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二、发酵用无菌空气的概念和质量标准
为确保生产在纯种培养状态下进行，严格无菌条件下
发酵用无菌空气的质量标准要求如下： ① 连续提供，保持一定流量；保证发酵罐0.1-2.0 V/VM 的需气量； ② 保持一定的压强；表压达到0.2~0.4 MPa。 ③ 空气的相对湿度在进入发酵罐之前≤70%。 ④ 进罐前的空气温度要比培养温度略高或相同。 ⑤ 洁净度达到N= 10-3 ；
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2） 连续灭菌
常见的连续灭菌的流程
连消塔—喷淋冷却连续灭菌流程
喷射加热连续灭菌流程
薄板换热器连续灭菌流程
※2.1.2 影响培养基灭菌的因素
1 ）培养基成分
2）培养基成分的颗粒性 5）微生物性质与数量 6）冷空气排除情况 7）泡沫
3）培养基的pH
4）微生物细胞的含水量
8）搅拌
2.1.2影响培养基灭菌效果的因素
利用微生物不能透过滤膜而达到除菌目的。
※※5、湿热灭菌法
利用饱和蒸汽进行灭菌、条件为：121℃，30min 适用范围：广泛应用于生产设备及培养基的灭菌 例：高压灭菌锅
思考 为什么湿热灭菌效果 湿热灭菌的机理
比干热灭菌效果好?
借助蒸汽释放的热能使微生物细胞中的蛋白质、 酶和核酸分子内部的化学键，特别是氢键受到破坏， 引起不可逆的变性，使微生物死亡。在有水分存在 的情况下，蛋白质更易受热而凝固变性。 湿热灭菌的温度和时间需根据灭菌对象和要求 来决定。