PCR技术(兼容1)

适用于检测病理切片中含量较少的靶序列
原位PCR的作用 既往鉴定细胞内特异序列一般采用原位杂交 （ISH）,但在每个细胞中目的片段的拷贝数少于10 的情况下,该方法的敏感度就明显下降。而标准的 PCR则可扩增出细胞内单拷贝的序列,敏感度很高, 但却未能与细胞形态学研究相结合。 ISPCR则可把这两者结合起来,成为细胞学诊断 中一种崭新的检测技术。利用该法可检测细胞内病 毒感染、细胞内基因重排、以及分析细胞内RNA表 达产物等方面发挥一定作用。在检测细胞的潜在感 染方面也具有重要意义。
DNA的变性和复性
5’ 3’
引物
3’
5’
变性、退火
延伸
变性、退火
延伸
PCR扩增原理
2 PCR技术的特点
1 ）高度的灵敏性
PCR产物每轮循环增加一倍
30轮循环
扩增量达230个拷贝（109拷贝）
2 ）特异性
引物
引物
引物的序列及其与模板结合的特异性是决 定PCR反应结果的关键。
引物设计的最大原则是最大限度地提高扩 增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性 扩增。
转化细菌
DNA文库
细菌扩增
从基因组文库中筛选目的基因
probe
裂解 变性
显影
DNA克隆
目的基因
扩增
宿主细胞 复制子 扩增 载体
提取DNA分子
DNA聚合酶
引物
引物
引物
DNA聚合酶
M13噬菌体
Sanger的 测序技术
1977年
Mullis 的构思
1983年
引物
DNA聚合酶
DNA聚合酶
引物
特定DNA片段
Taq 酶 模板DNA
Taq 酶
dNTP
引物 Buffer
循 环 仪
94℃ 55 ℃ 72 ℃
模板DNA
dNTP
引物 Buffer
PCR技术的基本过程(2)
琼脂糖凝胶电泳
PCR技术的基本过程(3)
3 PCR反应条件
1）PCR反应成分
（1）模板
单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制 剂、DNA结合蛋白类。 一般100ng DNA模板/100L。
PCR技术诞生所依赖的社会需求和研究需要
生物样品
DNA片段
……
基 因 诊 断
基 因 治 疗
基 因 工 程 产 品
法 医 学 检 测
人 类 学 研 究
基因组DNA
获取特定DNA片段 扩 增 特 定 片 段
DNA
基因组DNA文库
基因组DNA 限制性内切酶裂解
20kB fragments 基因重组 插入噬菌体载体 体外包装
Kary B. Mullis（1944－）
http://www.karymullis.com
三篇重要论文
The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction (Scientific American, 1990,262(4):5661, 64-5 )
复习
5’ 3’
解旋酶类 DNA聚合酶
dNTP
引物
体内DNA的复制
加热
变 性
加热或强酸、碱性作用 可以使 DNA双螺旋的氢 键断裂,双链解离,形成 单链DNA,这称为 DNA的 变性。
复 温
复 性
解除变性的条件后, 变 性的单链可以重新结合 起来,形成双链,其原有 的特性和活性可以恢复, 这称DNA复性, 也叫退火。
目的基因
扩增
宿主细胞 复制子 扩增 载体
提取DNA分子
4 ）用途广泛
生命学科
医学工程
遗传工程
疾病诊断
法医学
考古学
PCR的反应体系和方法
PCR管加热使模板变性, 退火使引物与模板DNA互 补,延伸需将反应温度升至中温( 72℃),在Tap多 聚酶的作用下,以dNTP为原料,以引物为复制的起 点,合成新链。 如此重复改变反应温度,即高温变性、低温退火 和中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特 异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30 次循环,最终使基因放大了数百万倍; 将扩增产物 进行电泳,经溴化乙锭染色,在紫外灯照射下肉眼 能见到扩增特异区段的DNA带。
（4）循环次数
主要取决于模版DNA的浓度
一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低
错误掺入率增加
经典循环参数（500bp以内）
94℃ 94℃ 55 ℃ 5min 30s 45s
×30次
72 ℃
72℃ 42℃
1min
7min forever
PCR的类型
1）不对称PCR
目的：扩增产生特异长度的单链DNA。
方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限 制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是 0.01∶0.5μM,关键是限制性引物的绝对量。
用途：制备核酸序列测定的模板
制备杂交探针
基因组DNA结构功能的研究
低浓度引物
高浓度引物
2)反向PCR (reverse PCR)
是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片 段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。 可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知 DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的 克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文 库。
荧光标记
荧光定量PCR标记方法
•内掺式染料 SYBR Green I •序列特异性探针 Taqman Molecular Beacons Dual Probes(FRET) •引物特异性探针 Amplifluor (Intergen)
未知序列 已知序列 未知序列
限制酶 未知序列
已知序列
限制酶 未知序列
连接酶
3）多重PCR（复合PCR）
用于检测特定基因序列的存在或缺失。
引物 1 2 3 4 43 2 1
电 泳
DMD：人类肌营养不良基因
A：无外显子8,12,17,19对应 条带,说明病人外显子8～19 缺失 B：病人A中未扩增外显子 带的强度为C的一半,提示为 区域缺失携带者
引物设计：
（1)序列应位于高度保守区,与非扩增区无同 源序列。 （2）引物长度以15-40 bp为宜。
（3）碱基尽可能随机分布,G+C占50-60%。
（4）引物内部避免形成二级结构。
（5）两引物间避免有互补序列。
（6）引物3’端为关键碱基；5’端无严格限 制。
3’
5’
3’
5’
限制性内切酶的识别序列
蛋白质多肽链
9) 荧光定量 PCR（real-time PCR)
• 通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产 物进行标 记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应 的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板 量。
荧光定量 PCR仪
• 光定量PCR仪是一种带有激发光源和荧光信号检测 系统的PCR仪,通常配有电脑系统及相应的分析软件。
Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、 EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。
2）循环参数
(1)变性
使双链DNA解链为单链
94oC 20-30秒 (2) 退火
温度由引物长度和GC含量决定。
增加温度能减少引物与模板的非特异 性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。
（3）延伸
70-75℃,一般为72℃ 延伸时间由扩增片段长度决定
94℃变性
50-65℃退火
XX℃延伸
94℃
55℃
37℃
Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)
100
酶 80 活 性 60
40பைடு நூலகம்
(%)
20 40 50 60 70 80 90 100
温度(℃)
94℃
55℃
72℃
PCR循环
PCR技术的原理
1 PCR技术的基本原理
无细胞分子克隆法：在微量离心管中,加入 适量的缓冲液, 微量的模板DNA,四种脱氧单 核苷酸,耐热性多聚酶, 一对合成DNA的引物, 通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶 段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因 拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环, 最终使基因放大了数百万倍; 扩增了特异区 段的DNA带。
5’
5’
3’GG…GG CC…CC
6）PCR固相分析法
亲和固 相介质 模 板
PCR 扩增
探 针
检测探 针信号
生物素 化引物
可用于基因芯片的制作
7）原位ＰＣＲ
原位聚合酶链式反应（In Still PCR,Is－PCR） 是由Haase等于1990年首创。它是利用完整的细胞 作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段, 在不破坏细胞的前提下,利用一些特定的检测手段 来检测细胞内的扩增产物。 直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细 胞中进行ＰＣＲ扩增。可进行细胞内定位。
启动子序列 定点突变 探针标记
3）操作简便易行
PCR扩增法,只需要数小时,就可以用电泳 法检出1μg基因组DNA中仅含数个拷贝的模板 序列。
通常的DNA 扩增法是分子克隆法, 首先要 构建含有目的的基因的载体, 然后将它导入 细胞后进行扩增,还要用同位索探针进行筛选; 这种方法,要经过DNA内切、连接、转化和培 养等相关的过程,操作复杂,一般需要数周时 间。
分子生物学与临床
中
山
大
中
学
汉
主讲：杨
（yangzhonghan@163.com）
目
录
PCR的概念 PCR技术的创建 PCR的原理 PCR的反应体系和方法 PCR的类型和应用
多聚酶链式反应
（PCR：Polymerase Chain Reaction)
Polymerase: DNA聚合酶
基因组DNA
操作步骤
1. 细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处 理后便适于一般PCR试剂（包括引物和Taq酶）进入 2. PCR扩增细胞内目的片段
3. 原位杂交检测扩增产物
A.阳性对照
B.阴性对照
C.原位检测mRNA表达
8）ＲＴ－ＰＣＲ
mRNA
逆转录酶 杂化双链 ＤＮＡ聚合酶
cDNA
PCR扩增
基因
mRNA
观察
5）锚定PCR（anchored PCR, A-PCR）
（固定化PCR）
PCR的局限：需了解靶基因片段两测的序列
对于未知序列和具有不同末端序列怎么办？
VH
VL
CH1 CH1
VH
VL
CL
CH2 CH2
CL
CH3
CH3
锚定PCR首先合成第一链cDNA,然后再添加一同聚物尾（polydG),与 同聚物尾配对的3’锚定引物（带有限制性内切位点polydC)一起作 PCR扩增 cDNA 末端核酸转移酶 3’GG…GG CC…CC 锚定引物 3’GG…GG CC…CC
1 反应体系
总体积 Buffer dNTP Primer 50-100 l 缓冲液 原料 引物
DNA分子
Taq酶
模板
DNA聚合酶
2 基本过程
TaqDNA聚合酶
模板DNA
dNTP
引物 Buffer
预变性
94oC5’
模板DNA
dNTP 引物
Buffer
PCR技术的基本过程(1)
72 ℃ 5～7 min
模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。
（2）引物浓度
0.1-0.5 mol/L
浓度过高易导致模板与引物错配,反应特 异性下降。 （3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)
0.5-2.5 U/50 l
酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影 响反应产量。
（4）dNTP
dNTP浓度取决于扩增片段的长度
Primer-directed Enzymatic Amplification of DNA with a Thermostable DNA Polymerase (Science,1988,239(4839):487-91 )
Specific Synthesis of DNA In Vitro via a Polymerase Catalyzed Chain Reaction (Methods in Enzymology, 1987,155:335-50 )
引物
DNA聚合酶
DNA片段体外扩增
PCR技术的创建
Kary B. Mullis（穆利斯（美））
Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性,与适当引 物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。 1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得 到实现。 1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了 PCR技术 1989年美国《Science》杂志列PCR 为十余项重大 科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣 获1993年度诺贝尔化学奖。
四种dNTP浓度应相等
浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓 度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度 下降,影响DNA聚合酶的活性。
（5） Mg2+
Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。
0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。
Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量 下降； Mg2+过高影响反应特异性。
C：正常人DMD基因外显子 的一般扩增形式
多重PCR检测DMD基因缺失
4）LP-PCR（Labelled
primers)
利用同位素、荧光素等对ＰＣＲ引物进 行标记,用以直观地检测目的基因。 特别适合大量临床标本的基因诊断 可同时检测多种基因成分
病毒1
病毒2
病毒 3
病毒4
标记引物
ＰＣＲ
PCR产物