PCR技术(兼容1)

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PCR技术

PCR技术聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）又称为无细胞克隆系统或特异性DNA 序列体外引物定向酶促扩增法，是利用单链寡核苷酸引物对特异DNA片段快速进行体外酶促扩增的一种方法,由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增。

这一反应是指数反应，可在短时间内使极微量的目的DNA片段特意的扩增上百万倍，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。

它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究,还可用于疾病病的诊断或任何有DNA,RNA的地方．在聚合酶链式反应实验中，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。

因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA 聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。

但往往DNA聚合酶不能耐高温，耐热DNA 聚合酶—TaqDNA聚合酶的发现对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用。

PCR工作原理将适当的反应体系置于特殊的装置自动温度循环器中，加热至高温（一般为94℃，90s），将所需要扩增的靶DNA单链热变性处理，解开为两个寡核苷酸单链。

降低温度（退火如55℃，90s），引物与互补DNA结合后，以把DNA为模板，TaqDNA聚合酶催化四种dNTP按从5’到3’方向将引物延伸，自动合成新的DNA链，使DNA重新复制成双链。

然后又开始第二轮循环扩增。

引物在反应中不仅起引导作用，而且起着特意的限制扩增DNA片段大小的作用。

新合成的DNA链含有引物的互补序列，又可作为下一轮聚合反应的模板。

PCR的反应循环周期如下1.模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；2.模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；3.引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

PCR技术

PCR反应系统的组成
• 三、PCR反应系统的组成 • 引物在PCR反应中的浓度一般在0.1～ 1μmol/L之间。浓度过高易形成引物二聚体且产生非特异性产物。一般来说用低浓度引物经济、特异，但浓度过低，不足以完成30个循环的扩增反应，则会降低PCR的产率。
PCR反应系统的组成
• 四、TaqDNA聚合酶的量 • 典型PCR反应混合物中，所用酶浓度为2.5U/μl，常用范围为1～4U/100μl。由于DNA模板的不同和引物不同，以及其它条件的差异，多聚酶的用量亦有差异，酶量过多会导致非特异产物的增加。由于生产厂家所用兵配方、制造条件以及活性定义不同，不同厂商供应的TaqDNA聚合酶性能也有所不同。Cetus公司酶定义是：1 个酶单位是指在以下分析条件下，于74℃， 30min内使10nmmol的dNTP掺入酸不溶性成分所需的酶。测定时间为10min，折算成30min掺入量。
电泳分析
• 在实际工作中常采用琼脂糖凝胶电泳。一般情况下先在电泳缓冲液或凝胶中加1%溴化乙锭（EB）（每100ml加100μl），然后将已经制备好的1%～2%琼脂糖凝胶（用电泳缓冲液配制）放入电泳槽内，加入待测样品10μl，同时用分子量标准品作标记 • 由于溴化乙锭可与双链DNA形成结合物，在紫外灯下能发射荧光，使EB的荧光强度增强 80～100倍，所以，电泳后凝胶在紫外灯下可直接观察
原理
• 这样，每一双链的DNA模板，经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的 DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以 2n的批数形式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106～107倍。

从零开始学PCR技术（一）：PCR技术简介

从零开始学PCR技术（一）：PCR技术简介展开全文PCR 可能是分子生物学中使用最广泛的技术。

虽然我本科学的是生物科学，提过DNA，也跑过 PCR，但现在都快忘了 PCR 的步骤是三个还是四个了。

赶快网络搜索之，整理成一个从零开始学系列。

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一项利用 DNA 双链复制原理，在生物体外复制特定 DNA 片段的的核酸合成技术。

可在短时间内大量扩增目的 DNA 片段，而不必依赖大肠杆菌或酵母菌等生物体。

DNA 的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。

双链 DNA 在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在 DNA 聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。

在实验中发现，DNA 在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。

因此，通过温度变化控制 DNA 的变性和复性，加入设计引物，DNA 聚合酶，dNTP 就可以完成特定基因的体外复制，这是 PCR 的理论基础。

一、反应体系PCR 反应是在体外模拟DNA 的复制过程，因此反应体系中必须具有 DNA 复制所需的基本要素：1.模板（template），含有需要扩增的 DNA 片段。

2.引物（primer），一对引物决定了需要扩增的起始和终止位置。

3.聚合酶（polymerase ），DNA 聚合酶复制需要扩增的区域。

4.脱氧核苷三磷酸（dNTP），用于构造新的互补链。

5.缓冲液（buffer），提供适合聚合酶行使功能的化学环境。

二、反应步骤标准 PCR 过程分为三步：1.变性（Denaturation）：利用高温使 DNA 双链分离。

DNA 双链之间的氢键在高温下（93 - 98℃）被打断。

2.退火（Annealing）：在 DNA 双链分离后，降低温度使得引物可以结合于单链 DNA 上。

3.延伸（Extension）：DNA 聚合酶由降温时结合上的引物处开始沿着 DNA 链合成互补链。

pcr技术

pcr技术PCR技术简述PCR（聚合酶链式反应）是一种在分子生物学领域中广泛应用的技术，它通过扩增DNA序列，使得微量的DNA可被放大到足够进行分析和检测。

PCR技术的发明者是美国生物化学家凯瑟琳·穆利斯和基瑞克·穆利斯，他们在1983年首次描述了PCR技术的原理和应用。

PCR技术的原理基于DNA的双链结构以及DNA聚合酶的酶活性。

首先，需要将DNA样本经过解链处理，使得DNA的两条链分离。

然后，通过引物（primers）的引导，DNA聚合酶在适当的温度下，将碱基按序合成新的DNA链。

在这个过程中，由于DNA聚合酶的高保真性，其错误复制的错误率非常低。

PCR技术的应用非常广泛。

一方面，PCR技术可以用于DNA的克隆，即通过扩增特定目标序列，大量复制所需的DNA片段。

这项技术在基因工程、遗传学、疾病诊断以及法医学中有着重要的应用。

另一方面，PCR技术还可用于DNA的测序，即通过大量扩增DNA片段的方法，快速获取准确的DNA序列信息。

这项技术在基因组学、进化生物学等领域具有重要意义。

PCR技术具有许多优点。

首先，PCR技术具有高效快速的特点。

在PCR反应中，只需几个小时就能从微量的DNA样本扩增出大量的DNA。

其次，PCR技术的扩增过程是在体外进行的，不依赖于生物体，也不受DNA序列的限制。

第三，PCR技术对DNA样本的要求较低，只需微量的DNA就可以进行扩增。

最后，PCR技术的扩增结果可以被检测和分析，从而实现对特定DNA序列的定量和定性研究。

然而，PCR技术也存在一些限制。

首先，由于PCR技术的扩增过程是指数型增长，因此存在扩增产物的竞争问题，这可能导致非特异性扩增。

其次，PCR技术对引物的设计和选择要求较高，如果引物选择不当，可能会导致扩增失败或非特异性扩增。

此外，PCR技术还存在杂交、污染和抑制等问题，这可能对结果的准确性产生影响。

为了解决PCR技术的一些限制，研究人员对PCR技术进行了改进和创新。

PCR技术

循环次数按变性，退火，延伸的程序进行PCR循环，可以根据需要确定循环次数。循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板 DNA的浓度。一般的循环次数选在 30～40次之间。如有需要，可将上次的PCR产物稀释后，重新进行PCR循环。
上述过程结束后，从PCR仪中取出PCR管，用微量移液器从中取10μL ，加入Loading Buffer(12μL)，充分混匀，制成混和均匀的混合物。六﹒ PCR扩增产物的检测分析凝胶电泳常用的有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳，前者主要用于DNA片段大于100bp者，后者主要用来检测小片段DNA。
（1）制胶琼脂糖凝胶厚度要适中。过薄则加样孔样品会溢出来，过厚观察时荧光穿透不强以至有些小片段DNA带型不易分辨。如配制2%凝胶100ml，称取琼脂糖2g于三角瓶中，加入 100ml 0.5×TBE液，微波炉加热2-5min，使琼脂糖完全溶解（注意不要暴沸），置室温等温度下降至60℃时，加入终浓度 0.5μg/ml的EB液，充分混匀后倒板（注意排除气体）。
PCR仪：
冷冻离心机：
核酸电泳仪：
制冰机：
实验步骤：
一.引物设计引物设计原则： 1. 引物与模板的序列要紧密互补 2. 引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构 3. 引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。使用不合适的 PCR 引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚体带），不出带或出带很弱，等等。
ddH2O 21μL
总计 50μL
三.将装有上述混合物的PCR管放入冷冻离心机，1000r/m离心10s,用于混匀反应物。四.将管置于PCR仪中，设置反应参数：预变性 95℃ 5min 变性 95℃ 30s

PCR检测技术(一) 模板

dNTP是PCR反应所必须的底物，为四种的混合物当四种核苷酸的浓度相同时可将核苷酸的错误掺人率降至最低。最相宜的dNTP终浓度应按照被扩增片段的长度和碱基组成来确定。普通用法的浓度为0.2mol/L。
3.DNA聚合酶
目前PCR扩增中最常用的DNA聚合酶是TagDNA聚合酶，它是由水生栖热菌(Ther-masaquaticus)产生，热稳定性好，可耐94℃高温，在此温度下短时光内对活力无多大影响。最适反应温度为72℃,70℃催化核酸链延伸的速度是2800核苷酸/min，在100uL反应体系中普通用2单位，它的用量多少对PCR扩增效率及特异性有一定影响。除了TagDNA聚合酶外，近年来耐热的pfuDNA聚合酶也被广泛地用于PCR反应，此酶是山极端嗜热的激烈热球菌(Pyrococcusfuriosus)产生的DNA聚合酶，是迄今发觉的掺人错误率最低的耐热DNA聚合酶，但其延长速度比TagDNA聚合酶低550核苷酸/min；另外得到应用的还有一种rTthDNA聚合酶，因为PCR反应以DNA模板举行扩增反应，而rTthDNA聚合酶可将反转录和聚合作用融合在一起，挺直由其将RICA反转录后扩增出大量的DNA片段，因而可大大简化操作程序，提高效率。
TagDNA聚合酶往往会在DNA链3'末端加上非模板互补核苷酸，从而产生不易克隆的PCR产物。通过用其他DNA聚合酶(如T4DNA聚合酶)处理扩增产物，补平或除去突出末端可解决这一问题。
4．反应缓冲液
PCR反应中常用的反应缓冲液含10～50mmol/L(pH8.3～8.8)的Tris-HCl,50mmol/LKCl和1.5mmol/LMgCl2。反应缓冲液的pH至关重要，假如KCl浓度过高，则会抑制酶的活性。在反应中存在适当浓度的Mg2+至关重要，它是TagDNA聚合酶活力所必须的，并可影响PCR产物的特异性和产量、引物退火的程度、模板与PCR产物链的解离温度、引物的特异性、引物二聚体的形成以及酶的活性和精确性等。因为EDTA或磷酸根能影响Mg2+的浓度，所以应注重模板DNA溶液中的EDTA浓度和PCR反应中所加模板和引物的量以及dNTP浓度(dNTP可提供磷酸基团，从而影响Mg2+浓度)。要获得最佳反应结果，必需挑选合适的Mg2+浓度，普通为2～5mmol/L。

PCR技术

7）连接介导PCR (Ligation-mediated PCR)
8)反向PCR (Reverse PCR)
用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段，对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。
限制性内切酶
限制性内切酶
未知序列
已知序列
未知序列
DNA连接酶
9）多重PCR（Multiplex PCR，又称复合PCR）
PCR体系 PCR程序
PCR示例
10×PCR Buffer dNTP
Forward primer (10 uM) Reverse primer (10 uM)
H2O Taq DNA
2 ul 0.4 ul 0.4 ul 0.4 ul 15. 6 ul 0.2 ul 1 ul (50 ng)
Total volume 20 ul
模板：DNA
引物：P1 P2
DNA聚合酶：Taq
原料：dNTP
反应缓冲液辅助因子：Mg2+
Taq
P2
Mg2+
P1
dATP dCTP
dTTP dGTP
PCR反应条件
1）PCR反应成分
（1）模板单、双链DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA
结合蛋白类。 DNA模板一般100ng /100L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。
是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同。
多重PCR的主要用于多种病原微生物的同时检测或鉴定以及某些遗传病及癌基因的分型鉴定。
10）标记引物PCR（Labelled primers， LP-PCR)

PCR技术

PCR技术PCR技术的历史、原理及其应用摘要：分子克隆（molecular）、DNA测序（DNA sequencing）和聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）是分子生物学的三大主流技术，在这3种技术中PCR技术在实践中的应用日益广泛，并随着分子生物学实验技术的成熟而不断创新和拓展。

本文就PCR技术的发展历程、相关原理以及其在不同领域的相关技术的应用作简单的综述。

关键词：PCR；原理；应用聚合酶链反应( Polymerase Chain Reaction , PCR)是20世纪80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术，它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点,是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑[1]。

现已被广泛应用于农学、植物病理学等领域的研究。

最初的PCR 技术相当不成熟，但在随后的几十年里，PCR 技术被不断改进，它从一种定性的分析方法发展到定量测定；从原先只能扩增几个kb 的基因到目前已能扩增长达几十个kb 的DNA 片段[2]。

1.PCR技术的发展历史1971年Khorana最早提出核酸体外扩增的设想。

但是，当时的基因序列分析方法尚未成熟，对热具有较强稳定性的DNA聚合酶还未发现，寡核苷酸引物的合成仍处在手工、半自动合成阶段，这种想法似乎没有任何实际意义。

1985年，美国科学家Kary Mullis发明了PCR 技术，并在Science杂志上发表了关于PCR技术的第一篇学术论文。

从此，PCR技术得到了生命科学界的普遍认同，Kary Mullis也因此而获得1993年的诺贝尔化学奖。

但是，最初的PCR技术相当不成熟，在当时是一种操作复杂、成本高昂、“中看不中用”的实验室技术。

1988年初，Keohanog通过对所使用的酶的改进，提高了扩增的真实性。

尔后，Saiki等人又在黄石公园从生活在温泉中的水生嗜热杆菌内提取到一种耐热的DNA聚合酶，使得PCR技术的扩增效率大大提高。

pcr技术课件ppt简短

通量PCR检测。
pcr技术的应用范围
01
02
03
基础研究
基因克隆、基因表达、基因组测序、单核苷酸多态性(SNP)检测等。
医学诊断
感染性疾病、遗传性疾病、肿瘤等疾病的诊断。
生物多样性研究
物种鉴定、种群遗传学分析、生态学研究等。
02
CATALOGUE
pcr技术的基本步骤
样本准备
样本类型
选择合适的样本类型，如血液、组织等，以便后续实验操作。
根据目的基因序列，选择特异性好、扩增效率高的引物。
确认模板DNA的质量
设置合理的反应体系
确保使用的模板DNA无降解、无污染，浓度和纯度适中。
根据引物、模板和PCR仪的规格，设置合理的反应体系。实验Βιβλιοθήκη 的注意事项控制好反应温度和时间
PCR反应中，每个温度点的反应时间和升温/降温速度应保持一致。
避免出现非特异性扩增
将DNA模板、引物、dNTPs、酶等试剂加入PCR反应管中。
进行PCR扩增
将PCR反应管放入PCR仪中，按照设定的程序进行扩增。
产物检测和分析
收集PCR扩增产物，进行电泳分析或荧光定量PCR等检测方法，确定目标基因序列是否被成功扩增。
实验后处理
数据分析和结论
对实验数据进行统计和分析，得出结论。
将用过的引物和模板妥善储存，以备后续实验使用。
仪器的维护与保养
定期对PCR仪进行维护和保养，确保设备的正常运行。
05
CATALOGUE
pcr技术的优缺点
优点
01
02
03
04
灵敏度高
PCR技术可以检测出微量的 DNA，灵敏度非常高。

PCR技术及原理

PCR技术及原理PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种在医学、生物学和法医学等领域广泛应用的技术，它可以在短时间内扩增特定DNA片段。

PCR技术的原理基于DNA的复制过程，通过PCR可以在不进行其他复制方式的情况下在试管中复制DNA序列。

本文将详细介绍PCR技术的原理以及相关的步骤和应用。

PCR技术的原理是通过DNA的聚合酶链式反应来扩增特定DNA片段。

PCR的反应体系通常包含DNA模板、引物、聚合酶和四种不同的核苷酸。

PCR的过程分为三个不同的步骤：变性、退火和延伸。

下面将对每个步骤进行具体说明。

1. 变性（Denaturation）：在此步骤中，PCR反应混合液中的DNA模板加热至94-98℃，使其双链DNA断裂成两条单链DNA。

DNA的双链断裂是由于高温使DNA中的氢键断裂，从而使两条链分开。

这一步骤通常持续约30秒至1分钟。

2. 退火（Annealing）：在此步骤中，PCR反应混合液的温度被降低至48-72℃，引物与目标DNA序列互补结合。

引物是一对特异性的寡核苷酸序列，通常由20-30个核苷酸组成，其两端分别与目标DNA序列的两端互补。

当引物与目标DNA序列互补结合时，它们的3'末端会朝向DNA的中心延伸。

这一步骤的时间通常为30-60秒。

通过多轮的PCR反应，可以在短时间内产生大量特定的DNA片段。

每一轮PCR循环会产生数量翻倍的DNA，这使得PCR具有很高的扩增特异性。

PCR技术有许多应用。

在医学领域，PCR可以用于检测和诊断病毒、细菌和基因突变等。

在法医学中，PCR可以用于DNA鉴定。

在生物学中，PCR可以用于克隆和表达基因，研究基因调控机制等。

此外，PCR技术还可以用于DNA测序、产前诊断、人类遗传学研究等领域。

总而言之，PCR技术是一项重要而广泛应用的分子生物学技术。

其原理基于DNA的复制过程，通过变性、退火和延伸三个步骤，可以在短时间内扩增特定DNA片段。

pcr技术课件

pcr技术课件PCR技术课件PCR（聚合酶链反应）是一种基于DNA复制的技术，它在分子生物学和遗传学研究中起着重要的作用。

PCR技术的课件可以帮助学生更好地理解PCR的原理、应用和意义。

本文将介绍PCR技术的基本原理、扩增过程、应用领域以及PCR在医学诊断和基因工程中的应用。

一、PCR技术的基本原理PCR技术是通过反复进行DNA的复制来扩增目标DNA片段。

它主要由三个步骤组成：变性、退火和延伸。

首先，将DNA样本加热至95°C，使DNA双链解开成两条单链。

然后，将温度降至50-60°C，引入引物（即DNA复制的起始点），使其与目标DNA序列互补结合。

最后，将温度升至72°C，加入DNA聚合酶，使其在引物的引导下合成新的DNA链。

这样，每一轮PCR循环都会产生两倍于前一轮的DNA数量，从而实现DNA的指数级扩增。

二、PCR技术的扩增过程PCR技术的扩增过程包括若干个PCR循环，每个循环由三个步骤组成。

在第一轮循环中，目标DNA片段的数量翻倍。

在第二轮循环中，这些新合成的DNA片段再次翻倍，以此类推。

通过多次循环，可以在短时间内扩增出大量的目标DNA片段。

三、PCR技术的应用领域PCR技术在分子生物学和遗传学研究中有广泛的应用。

它可以用于基因克隆、基因定位、基因表达分析、DNA指纹鉴定等。

在基因工程领域，PCR技术也是不可或缺的工具，可以用于构建重组DNA、检测基因突变等。

四、PCR技术在医学诊断中的应用PCR技术在医学诊断中有着重要的应用价值。

例如，PCR可以用于检测病原体的存在，如细菌、病毒和寄生虫等。

通过PCR技术，可以快速、准确地诊断出某些传染病，如艾滋病、乙肝和结核病等。

此外，PCR技术还可以用于检测基因突变，从而帮助医生确定某些遗传性疾病的诊断和治疗方案。

五、PCR技术在基因工程中的应用PCR技术在基因工程中有着广泛的应用。

例如，PCR可以用于构建重组DNA，即将不同来源的DNA片段连接在一起，形成新的DNA序列。

PCR技术介绍精品课件(一)

PCR技术介绍精品课件(一)PCR技术介绍精品课件——掌握基因分子生物学核心技术的利器PCR（Polymerase Chain Reaction）技术是一种非常重要的基因分子生物学核心技术，在疾病检测、基因工程、药物研发、环境监测等方面具有广泛的应用。

PCR技术介绍的精品课件是掌握该技术的有效工具。

一、PCR技术实现的原理PCR技术是利用DNA聚合酶作为酶催化剂，最小量的DNA模板进行体外扩增，使其在几个小时内扩增成1000万甚至10亿份以上，实现DNA分子的大规模扩增和检测。

PCR反应分为三个步骤：变性、退火、延伸。

变性是使双链DNA变成单链DNA，退火是让引物与目标DNA序列的特定区域结合，从而制造重复扩增模板；延伸是将DNA聚合酶介导的dNTP延伸至3'-OH端，最终形成双链DNA。

PCR反应可以进行20-40次的循环，以成倍地扩增目标DNA。

二、PCR技术介绍的内容1. PCR技术的基本原理该部分对PCR技术的原理进行详细阐述，包括PCR反应的三个步骤、PCR反应体系的组成、PCR反应不同温度时，DNA的状态变化。

同时，应用画图软件进行动态模拟，使学生直观地感受PCR反应的过程。

2. PCR技术中引物的设计和合成方法引物是PCR反应中的重要组成部分，正确的引物设计对PCR反应结果的准确性有很大影响。

该部分将介绍引物的设计原则和方法，如引物长度的选择、GC含量的控制、引物序列的互补性等等，并展示引物合成的实验过程。

3. PCR技术的应用该部分主要介绍PCR技术在不同领域的应用，如遗传病的诊断、基因工程、药物研发、环境监测等，同时以实际案例为例进行深入探讨。

三、课件特色和优势1. 直观易懂该精品课件采用了动态模拟的方式，并借助图片、表格、视频等元素，使学生直观地感受PCR技术的核心原理和应用。

2. 实践操作该精品课件不仅介绍PCR技术的原理和应用，更是通过实验演示的方式，精准地展示样品制备、PCR反应、基因分析等关键步骤。

PCR技术简介

一.PCR出现假阴性原因：
1．模板因素： 2．酶失活： 3．引物： 4．Mg2+浓度： 5．反应体积的改变： 6．物理原因： 7．靶序列变异：
PCR出现假阴性原因分析及解决方案
模板因素：（1）模板中含有杂蛋白；（2）模板中含有Taq酶抑制剂；（3）模板中蛋白质残留，特别是染色体中的组蛋白残留；（4）提取制备模板时丢失过多；（5）模板核酸变性不彻底。
PCR出现片状拖带或涂抹带解决方案
1.减少酶量或调换另一来源的酶；
2.减少dNTP浓度； 3.适当降低Mg2+浓度；
4.增加模板量，减少循环次数。
LA PCR技术

LA PCR (Long and Accurate PCR) 技术，运用此技术可大量正确地扩增长达40 kbp 的DNA片段。 LA PCR技术扩展了PCR的应用范围, 可在Genome解析、基因诊断、长片段DNA的克隆及变异导入等方面发挥优势。
PCR出现假阴性ห้องสมุดไป่ตู้因分析及解决方案

靶序列变异：
靶序列变异导致假阴性的情况常常发生在靶序列变异正好发生于特异性引物与之结合部的中间，使引物失效。

解决方案：
根据已知序列重新选择区段设计引物。
二.PCR出现假阳性原因：
1.引物设计不合适；
2.靶序列或扩增产物的交叉污染。
（1）整个基因组或大片段的污染；（2）空气中的小片断核酸污染。
PCR出现假阴性原因分析及解决方案

反应体积的改变：
做小体积PCR后，再做大体积时，一定要重新摸索条件，而非简单地将反应体系中的各个成分加大几倍，否则易失败。
PCR出现假阴性原因分析及解决方案

PCR技术

2.PCR反应的缓冲液
PCR的缓冲液一般制成10×，但用时稀释到1 × 10×PCR缓冲液 500mmol/L KCL （有利于引物的退火） 100mmol/L Tris.CL （一种双极性离子缓冲液，主要靠其调节pH, 使TaqDNA聚合酶的作用环境维持偏碱性。） 15mmol/L MgCL2（镁离子能影响Taq酶的活性，直接影响反应的特异性和扩增DNA的的产率） 0.1% 明胶（保护酶不变性失活）
四.建立新方法文件

2.根据自己的需要，对所显示的循环参数进行修改，生成自己的方法，操作如下： A. 修改各个部分的温度种类：将光标移至上图所示的 “1”或“4”或“12”位置，用数字键输入相应的数字即可，对于Hold过程，输入0表示取消该部分，对于Cycle过程，允许的不同温度的阶段数范围为2-6，输入数字后再按 Enter键确认；
二、主菜单

打开仪器电源几秒钟后，仪器即显示如下主菜单界面：

此时可利用功能键进入各个功能菜单： F1－RUN：运行一个PCR方法； F2－Create：建立一个方法文件； F3-Edit：编辑一个方法文件； F4－Util：机器内置功能菜单； F5－User：用户名菜单。
三、新增用户名

C、用箭头键移动光标至你想修改的参数上，用数字键输入新的参数； D、所有需要修改的参数都修改完成之后，你可以选择开始运行（F1-Start）或者把修改过的程序保存下来(F2-Store)。
六、如何运行PCR 方法文件

1、在主菜单下，按F1-Runห้องสมุดไป่ตู้进入运行功能子菜单：

2、用箭头键移动光标选择你所要运行的文件； 3、如果你对所选的文件的参数没把握，可以按F2View查看所选文件参数； 4、如果参数正确，按F1-Start，输入样品的体积：

PCR技术

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（3）GC的含量 GC的含量
一对引物的GC含量和Tm值应该协调，引物的GC含量和Tm值应该协调， G+C一般占40-60%。 G+C一般占40-60%。根据公式Tm=4（G+C）+2（A+T）可估计根据公式Tm=4（G+C）+2（A+T）,可估计引物的Tm值引物的Tm值。
31
（4）两引物间避免有互补序列，尤其避免3’端）两引物间避免有互序列，尤其避免3’端的互补的互补重叠。一般来讲，引物自身连续互一般来讲，引物自身连续互补碱基不能超过3个，一对引物间也不易多于四个连续个，一对引物间也不易多于四个连续碱基的互补碱基的互补性。
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三、PCR的反应三、PCR的反应体系和方法
PCR管加热使模板变性, 退火使引物与模板DNA互补,延伸需将反应温度升至中温( 72℃),在Tap多聚酶的作用下,以dNTP为原料,以引物为复制的起点,合成新链。如此重复改变反应温度,即高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍; 将扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色,在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段的 DNA带。
4
引物
DNA聚合酶 DNA聚合酶
DNA聚合酶 DNA聚合酶
引物
特定DNA 特定DNA片段 DNA片段
1983年
Mullis的构思 Mullis的构思
5
94℃变性
5050-65℃退火
XX℃延伸
6
DNA聚合酶：大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的 Klenow片段，缺点： ①Klenow酶不耐高温， 90℃会变性失活，每次循环都要重新加入。 ②引物链延伸反应在37℃下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。由于Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。

PCR技术简介(1)

分子生物学概论 ‐‐ PCR技术简介前言一滴残留在裙子上的精液使得美国总统Bill Clinton不得不坦承他与白宫实习生有不正当的关系。

因为他知道现在的生物科技就连一个精子也能被用来做为证据。

这种将极微量的生物标本化为可供鉴定的现代技术正是PCR(Polymerase chain reaction)‐‐聚合酶链式反应具有的特色之一。

这也是分子生物医学令人震撼的一例。

何谓PCR简单的说，PCR就是利用DNA聚合酶对特定基因做体外或试管内 (In Vitro) 的大量合成。

基本上它是利用DNA聚合酶进行专一性的连锁复制.目前常用的技术,可以将一段基因复制为原来的一百亿至一千亿倍。

PCR的要素基本的PCR须具备１.要被复制的DNA模板 (Template) ２.界定复制范围两端的引物(Primers). ３.DNA聚合酶 (Taq. Polymearse) 4.合成的原料及水。

PCR的反应包括三个主要步骤，分别是1). Denaturation 2). Annealing of primers, and 3). Extension of primers。

所谓 Denaturing乃是将DNA加热变性，将双股的DNA加热后转为单股DNA以做为复制的模板. 而Annealing 则是令 Primers于一定的温度下附着于模板DNA两端。

最后在DNA聚合酶 (e.g. Taq‐polymerase) 的作用下进行引物的延长 (Extension of primers)及另一股的合成。

PCR的历史PCR的发展可以说是从DNA合成酵素的发现缘起。

DNA合成酵素最早于1955年发现 (DNA polymerase I), 而较具有实验价值及可得性的Klenow fragment of E. Coli 则是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所发现, 但由于这个酵素是一种易被热所破坏之酵素, 因此不符合一连串的高温连锁反应所需。

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在适中温度下进行延伸，完成一个DNA的复制循环。
通过连续循环，DNA片段数量呈指数增长。
PCR技术的发明和发展
1985年，Mullis和Cetus公司的合作者Michael Smith在《科学》杂志上首次公开描述了PCR方法。
1987年，Innis、Gelfand、 White等人建立了PCR技术的标准化方案。
退火
将温度降至50℃左右，引物与单链DNA结合，形成局部
双链。
延伸
温度上升至72℃，DNA聚合酶从引物起始合成新的DNA
链。
降温及终止反应
每个循环结束后降低温度以终止反应，准备进入下一个循环
。
03
PCR技术的操作步骤
准备PCR反应所需的试剂和设备
01
准备PCR仪、离心机、移液器等设备，确保其正常工作。
按照设定的程序进行PCR扩增，记录扩增曲线和数据。
分析扩增产物
将PCR产物进行电泳或荧光检测，观察扩增结果。
利用凝胶成像系统或荧光检测仪对产物进行分析，确定产物的大
小和浓度。
根据需要，可以进行克隆、测序等后续操作，进一步验证PCR产
物的准确性和特异性。
04
PCR技术的优缺点
优点
高灵敏度
PCR技术PPT课件
目录
• PCR技术简介 • PCR技术的基本原理 • PCR技术的操作步骤 • PCR技术的优缺点 • PCR技术的应用实例 • PCR技术的未来展望
01
PCR技术简介
什么是PCR技术
聚合酶链式反应（PCR）是一种在体外快速扩增特定DNA片段的分子生物学技术。
它利用耐高温的DNA聚合酶（通常为Taq酶）在高温下将双链DNA分子变性解旋为单链，然后通过低温退火使引物与单链DNA分子结合，最后

pcr技术课件

pcr技术课件PCR技术课件PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种重要的分子生物学技术，被广泛应用于基因检测、疾病诊断、遗传学研究等领域。

本文将介绍PCR技术的原理、应用以及未来发展前景。

一、PCR技术的原理PCR技术基于DNA的复制原理，通过反复进行DNA的扩增，使得微量的DNA 样本在短时间内得到大量复制。

PCR反应一般包括三个步骤：变性、退火和延伸。

首先是变性步骤，将DNA样本加热至95°C，使DNA双链解开成两条单链。

接下来是退火步骤，将反应温度降至50-65°C，引入两个特异性引物（primers），它们能够与待扩增的DNA序列的两端互补结合。

引物的选择非常重要，它们决定了扩增的目标序列。

然后是延伸步骤，将反应温度升至72°C，引入DNA聚合酶（DNA polymerase），它能够将引物延伸，合成新的DNA链。

这个过程会重复多次，每次延伸会在目标序列的两侧合成新的DNA链，形成两个新的DNA分子。

通过不断重复这三个步骤，可以在短时间内扩增出大量的目标DNA序列。

PCR 技术的核心是DNA聚合酶，它具有耐高温的特性，可以在变性和延伸步骤中持续工作。

二、PCR技术的应用1. 基因检测：PCR技术可以用于检测基因突变、基因表达水平等。

例如，在肿瘤诊断中，可以通过PCR扩增出肿瘤相关基因的突变序列，从而帮助医生确定病情和治疗方案。

2. 疾病诊断：PCR技术在疾病诊断中起到了重要作用。

例如，通过PCR扩增出病原体的DNA序列，可以快速准确地诊断出感染病原体的种类和数量，从而指导治疗。

3. 遗传学研究：PCR技术可以用于分析个体的遗传信息，揭示遗传变异与疾病的关系。

例如，通过PCR扩增出人类基因组中的特定区域，可以研究基因多态性与疾病易感性之间的关联。

4. 法医学应用：PCR技术在法医学领域也有广泛应用。

通过PCR扩增出DNA样本中的特定序列，可以用于犯罪嫌疑人的DNA鉴定、亲子关系的确认等。

何为PCR技术：简述其原理及应用

何为PCR技术：简述其原理及应用引言聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一种重要的分子生物学技术，被广泛应用于DNA的扩增、检测与分析等领域。

PCR技术的发展极大地促进了基因工程、医学诊断以及生物学研究的进展。

本文将对PCR技术的原理及其应用进行简要介绍。

PCR技术的原理PCR技术基于DNA的体外扩增原理，通过反复进行一系列的温度循环，使目标DNA在体外大量复制，从而快速获得大量同一段特定DNA序列。

PCR反应体系的核心组成部分包括DNA模板、引物、聚合酶和核苷酸等，温度循环则包括变性、退火和延伸三个步骤。

具体而言，PCR反应以高温（95℃）使DNA模板的双链分离，即变性。

然后，反应体系降温至适宜引物的退火温度（50-65℃），使两个引物与DNA模板上的互补序列结合。

聚合酶将在较高温度下（72℃）延伸引物，合成新的DNA链，延伸的过程称为延伸。

该温度循环反复进行，每次循环会使DNA的量指数倍增加，最终可得到大量的特定DNA序列。

PCR技术的应用领域PCR技术具有快速、高效、敏感、特异性等优势，被广泛应用于各个领域，如遗传学、医学、生态学和法医学等。

以下是PCR技术的常见应用领域：1.基因工程与分子生物学研究：PCR技术能够在较短的时间内合成大量特定DNA序列，为基因克隆、蛋白表达、DNA测序等研究提供了便利。

2.医学诊断：PCR技术可以对人体样本中的病原体或特定基因进行检测，如检测病毒感染、细菌感染、遗传性疾病等。

PCR技术在医学诊断中的应用已经成为常规操作。

3.环境监测与生态学研究：PCR技术可以用于快速、准确地检测环境中的微生物种群及种群的基因变化，有助于了解环境中的生物多样性、生态系统稳定性等内容。

4.古生物学研究：PCR技术可应用于古DNA的提取与扩增，从而检测和研究已经灭绝的物种，帮助了解古生物的进化、迁移等情况。

总之，PCR技术基于DNA的体外扩增原理，通过温度循环反应迅速产生大量特定DNA序列。

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一、PCR的定义：
PCR（polymerase chain reaction) ：
聚合酶链式反应，又称体外DNA扩增技术。
近年来发展起来的一种体外扩增特异 DNA片段的技术。
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DNA扩增的传统方法：一般采用分子克隆法，需将构建的含有目的基因的载体导入细胞进行扩增，并需要用探针进行筛选，牵扯到DNA酶切、连接、转化、培养及探针杂交等技术，虽然技术上已无难点，但操作复杂，需数周到数月的时间，且不利于普及。
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3. 延伸 (Extension):
将反应温度调节到酶的最适温度，在DNA聚合
酶、4种 dNTPs 及镁离子等存在的条件下，以引物的 3′ 端开始，结合单核苷酸，形成与模板链互补的
新DNA链。72 ℃ 1′
上述 3 步为一个循环，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25～40个循环后DNA可扩增 106 ～ 109 倍。
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四、PCR反应体系：
常用30μl 各种成分的实际用量应根据实验者选
用的该成分的终浓度及所拥有的储备液浓度进行核算。
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10×buffer： 1×30 / 10 = 3μl
MgCl2: dNTPs:
1.5×30 / 5 = 1.8μl 0.2×30 / 10 = 0.6μl
引物 P：
0.4×30×2 / 10 = 2.4μl
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5
扩增的特异性取决于引物与模板DNA的特异结合，基本反应步骤分三步：
1. 变性 (Denaturation)：加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两
条单链。94℃ 30″ 2. 退火 (复性) (Annealling):