2010版GMP无菌制剂 实施指南

14.6过滤除菌本节旨在提供系统的方法对除菌过滤工艺进行选择和验证。

除菌过滤过程中的关键设备为除菌（级）过滤器，对其进行的具体确认和验证项目的相关原理和要求等，将在以下14.6.1~14.6.3中详细阐述。

按照不同药品分类，需要、推荐、可选和评估后确定是否进行的确认和验证项目，总结为下表。

很多生产最终灭菌产品的企业，在最终灭菌前，为控制微生物污染水平，使用过滤器对最终灭菌前的产品进行过滤。

此时，不论该企业采用了何种过滤器，包括精度（标称）为0.45μm的过滤器、0.2μm的微生物污染控制过滤器，甚至0.2μm除菌级过滤器，因为这些过滤器的使用目的都是在最终灭菌之前对微生物污染水平进行控制，而不是作为产品生产过程中最后一步的灭菌手段，对这些过滤器的工艺验证要求，低于非最终灭菌产品除菌过滤过程中所使用的除菌级过滤器。

14.6.1除菌级过滤器的验证/细菌截留【法规要求】编者理解：在这里法规要求的第一个要点是在采用除菌过滤方法时，首先确认采用的过滤器为“除菌级”的，即“除菌过滤器”。

达到此要求后，除菌过滤法中的其它无菌保障措施才有意义。

定义过滤器是否为除菌级，需要依据过滤器的微生物截留能力，并完成相关的标准方法确认和工艺验证。

而过滤药液所用的时间、流速、温度、滤出总量、过滤器二侧压力（压差）、药液对微生物的生存性的影响和过滤器的重复使用等情况，都是可能影响过滤器细菌截留能力的重要因素，需要在验证过程中考虑并确证。

【背景介绍】除菌过滤是指除去流体中微生物的工艺过程，该过程不应对产品质量产生不良影响。

包括液体和气体除菌过滤。

药品生产中采用的除菌过滤膜的孔径一般不超过0.22um（或者0.2um，这两种标称没有区别）。

当膜过滤器在1960年代出现在市场上时，0.45um孔径的膜被认为是“除菌级”的液体过滤器，并被成功应用于注射剂的除菌过滤。

这些过滤器采用黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens）进行挑战确认。

在1960年发布的论文中，美国FDA的Frances Bowman博士观察到经0.45um过滤器“除菌”过滤后的培养基被某种可以在104～106/cm2挑战水平下穿透该孔径滤膜的微生物反复污染。

这导致ASTM F-838标准的出台，该挑战水平成为验证液体除菌级过滤器的标准方法。

11Committee D19. F838-05 Standand test Method for Determining Bacterial Retention of Membrane Filters Utilized for Liquid Filtration. American Society for Testing and Materials International (ASTM): 2005因为缺乏工业界内的统一标准来衡量孔径，孔径的标称对预测微生物截留和比较不同生产商生产的过滤器产品没有实际的意义。

因而，需要用微生物截留能力来定义除菌级过滤器。

通常，除菌级液体过滤器指在工艺条件下每cm2有效过滤面积可以截留107 CFU（colony forming unit, 集落/菌落形成单位）的缺陷假单胞菌（Brevundimonas diminuta, ATCC 19146）的过滤器。

【技术要求】A. 除菌级过滤器的细菌截留验证细菌挑战实验验证过滤器滤膜的级别并采用有代表性的挑战微生物证明其从某产品或该产品家族中完全去除微生物。

除菌级过滤器的验证需要考虑两个主要因素：●滤膜级别，使用可适用的标准化试验或类似的方法以细菌挑战的方式进行。

●工艺验证，由过滤器的使用者或指派的实验设施（例如，过滤器的生产者或合同实验室），使用有代表性的微生物进行挑战，证明过滤器在生产条件下，可以完全去除每个产品或产品家族中的微生物。

应建立针对每个产品组的科学解释并可能需要在实施验证前经合适的监管机构审查。

这两种过滤器测试理念是不能互换的，并应当被独立验证。

这些测试的目的是为了证明过滤生产过程产生无菌的滤出液。

B. 影响细菌截留的因素应对可能影响细菌截留的因素进行风险评估，包括但不限于：（1）过滤器源的因素，包括过滤器类型、结构、基础聚合物、表面改性化学、孔径分布和过滤膜的厚度等。

（2）工艺源的因素生产工艺、产品或者料液对挑战微生物的生存性、理化形态的影响；实际微生物污染水平决定缺陷假单胞菌是否可以作为相关微生物；产品或者料液中的实际微生物污染水平（是否低于10CFU/100ml）影响过滤除菌工艺的设计和效能；还应考虑潜在的因产品配方或工艺条件，影响微生物的细胞大小或其它生理和形态学特性，从而造成微生物穿透的情况。

应考虑评估的工艺源因素：●流体组分（配方、表面活性剂、添加剂）●流体性质（pH值、粘度、渗透压，离子强度）●工艺条件（时间、温度、压差、流速、灭菌方法和重复使用）●产品、料液和生产环境中实际微生物污染的特点和水平C. 气体除菌过滤器对于气体除菌过滤器的细菌截留要求，尚没有统一的标准。

但是，液体细菌挑战被认为是气体除菌过滤器的“最差条件”，因而，参照液体除菌级过滤器执行的细菌截留验证是被广泛接受的。

其它可以选择的方法，包括细菌（孢子）气溶胶挑战和噬菌体/病毒气溶胶挑战试验。

【实施指导】本部分实施指导，均为针对液体过滤器的。

下文的实例分析部分会介绍一个气体除菌过滤器参照执行的例子。

A. 细菌截留验证研究细菌截留验证研究的目的是获得文件证据，证明在模拟工艺条件下，过滤过程可以持续去除悬浮于产品或替代流体中的高水平的标准细菌或相关微生物污染分离物。

研究的目的决定是使用膜片还是全尺寸工艺过滤器。

如果研究的目的是验证特定膜材的细菌截留效能，那么使用小的测试膜片通常被认为是可以满足条件的。

被用来确定工艺过滤器物理完整性的检测方法应当与细菌截留测试结果关联。

工艺时间和压差会影响细菌截留实验的结果。

在完整的工艺时间进行细菌挑战实验可以对那些与时间有关的因素进行评估，这些因素包括过滤器兼容性，完整性的维持和发生时间依赖的穿透等。

细菌挑战实验验证过程中的压差应达到或超过工艺过程的最大压差和/或最大的工艺流速（在过滤器制造商的设计规范内）。

在验证过程中同时模拟压差和流速可能是不可能的。

在设计模型挑战条件时过滤器的使用者应该确认哪个参数与特定工艺的相关性更高，并形成基本解释以支持相关决定。

对膜过滤器进行产品细菌截留验证时需要考虑以下事项：●应对过滤工艺进行一次彻底评估，包括溶剂性质（例如水基的、酸、碱、有机的）、过滤时间、工艺压差、工艺流速、工艺温度和过滤器设计规范。

●产品细菌截留验证研究应包括多个过滤膜批次（通常三个批次）。

有些情况下，产品性质被认为对过滤膜有攻击性，过滤器的确切数目和实验设计视工艺而定。

●在用于细菌截留验证研究的三个批次中至少应有一个批次是进行预研究时或使用前物理完整性测试时的数值通过但是接近（例如，10％之内）过滤器生产商提供的合格规范限值的。

●细菌截留验证研究中使用的过滤膜的物理完整性检测数值应包括在实验报告中。

物理完整性检测应使用已有规范值的水、产品或其它润湿流体来进行测试，并在进行微生物挑战前完成。

●如果细菌挑战实验后测试用微生物在任何过滤器的下游被回收到，那么就需要对此进行调查。

如果调查确认测试用微生物穿透完整性检测达标的过滤器，那么就应重新考虑此种过滤器在这些工作条件下的适用性。

●具有相同组分而只有浓度不同的同一族产品，可以用挑战极限浓度的方法进行验证，替代性地接受中间的浓度。

如果某一产品被确定为最差情况的代表，对此的解释和数据需要和模型一起提供。

●过滤器的重复使用对于制药过程来说通常是不实际的或者不被推荐的。

然而，如果除菌级过滤器被重复使用了，需要说明理由，重复使用的参数也需要经过验证。

B. 细菌截留验证研究——风险评估不同等级的风险与过滤工艺参数是相联系的，有些与过滤前产品中的微生物繁殖有关，而另外一些与较高的细菌穿透过滤器的风险相关。

见表2。

表14-7 工艺风险评估因素C. 挑战微生物选择标准缺陷假单胞菌（B.diminuta）ATCC ®19146TM（历史上为P. diminuta），被选择作为细菌挑战实验的微生物。

如果使用了其它细菌，这些细菌必须小至可以挑战除菌级过滤器的截留能力，并可以模拟在产品中发现的最小微生物。

相应地，替代挑战微生物可被用于验证研究，只要原有的过滤前微生物污染水平被发现是更相关的。

如果可能，自有微生物污染水平应该被描述、计数和鉴别，因为这些微生物有穿透除菌级过滤器的潜在可能性。

被分离的微生物形态也要考虑。

挑战微生物的尺寸需要通过穿透0.45微米孔径的膜来确认，这是每个挑战实验的阳性对照。

在标准培养基条件下生长的缺陷假单胞菌（见下“培养基维护和挑战微生物制备”）在高挑战水平下（通常≥107）会少量透过0.45微米滤膜。

有些情况下，缺陷假单胞菌不一定是代表最差条件的模型。

如果选用了不同的挑战微生物，需要提供文件解释。

D. 培养基维护和挑战微生物制备缺陷假单胞菌ATCC®19146TM可以冻干的形式从美国典型培养物中心（ATCC）或者本国的同等机构获得。

在按照ATCC的规程复壮微生物后，可以按照微生物操作规范在适宜的培养基中冷藏或冷冻保存。

需要建立用于挑战研究的工艺分离物的储存条件。

两种标准技术被公认适宜用于细菌挑战实验用缺陷假单胞菌的制备和维护。

它们是SLB 法和FCP法（冷冻细胞浆法）。

两种方法都被发现可有效生产适宜的缺陷假单胞菌悬液，缺陷假单胞菌的尺寸大约为直径0.3-0.4微米，长度0.6-1.0微米。

替代的培养基和培养方法也可能同样有效制备缺陷假单胞菌，只要这些方法可以生产出单一的，分散的细胞，尺寸适宜穿过0.45微米孔径的膜过滤器。

替代培养法需要被验证。

库存的细菌挑战培养物的聚集情况可用光学显微镜检查。

如果观察到聚集现象，将保存培养物置于超生波清洗槽的冷水中10分钟是可将团聚物分散的一个方法。

水浴的气穴作用可将细菌细胞分散，不影响细胞活性。

应使用光学显微镜、活性计数和0.45微米孔径对照过滤器的下游回收来确认分散效果。

细菌挑战实验浓度应保证在目标工艺时间里提供始终如一的挑战，挑战的水平达到基于过滤器表面积至少107 CFU/cm²。

当计算细菌挑战浓度时，应综合考虑诸如流速、时间和压差等操作参数。

大于等于107/cm²的细菌挑战水平就是对除菌级过滤器的要求（历史上用0.2微米孔径来标称的过滤器）。

这一水平来源于Bowman的观察和她的建议，即缺陷假单胞菌在大于104－106 CFU/ cm²细菌挑战水平时可穿透0.45微米标称的膜，应当用107 CFU/cm2缺陷假单胞菌来证明0.2微米标称的膜为“除菌级”，以确保有足够的灵敏度发现超尺寸孔。