常见病原菌的灭菌抑菌保藏原理及方法
微生物菌种保藏的原理和方法
微生物菌种保藏的原理和方法一、原理：1.休眠状态：微生物菌种在低温下可进入休眠状态，减缓代谢活动，延长存活时间。
2.冷冻保存：通过降低温度到零下或较低的温度，减慢微生物体内化学反应速率，延缓其代谢活动和死亡过程。
3.干燥保存：通过去除菌种周围的水分，降低微生物体内化学反应速率，延缓其代谢活动和死亡过程。
4.冻干保存：先冷冻再干燥保存，通过冷冻降低微生物体内的水分活性，再通过干燥去除冻结水，使菌种能在实验室条件下保存较长时间。
二、方法：1.冷冻保存：（1）使用离心管或培养管制备菌种的蛋白质保护液，可以是细胞培养基、缓冲液等。
（2）将培养物转移到保护液中，使其悬浮均匀。
（3）加入保护剂，如甘油或DMSO（二甲亚砜），提高菌种的冷冻抵抗力。
（4）将混合物分装到小容器或冻存管中。
（5）使用特定的冷冻方案，将菌种快速冷冻，并存储在低温下，通常为零下80℃或更低的温度。
2.干燥保存：（1）用无菌技术转移到无菌条件下的试管中。
（2）将菌种培养在无菌的固体培养基上。
（3）收集培养物，将其平均分布在无菌试管或培养皿中。
（4）将试管或培养皿放在无菌的通风柜中，使培养物在无菌环境下干燥。
（5）将干燥的培养物贮存在干燥无菌容器中。
3.冻干保存：（1）将培养物转移到无菌离心管或培养皿中。
（2）使用细菌培养基将菌种制备为细菌悬浮液。
（3）在细菌悬浮液中加入保护剂，如蔗糖或甘露醇。
（4）将混合物分装到冻干瓶中。
（5）使用低温冷冻机将菌种冷冻为固体，再将其放入冻结干燥机中进行冻干。
（6）将冻干的菌种贮存在密封的冻干瓶中。
4.长期保存：通常，冷冻保存和冻干保存可以实现长期保存，但仍需定期检测和维护保存条件。
在微生物菌种保藏过程中，还需注意以下几点：1.选择合适的保存条件：根据菌种的特性和要求，选择适宜的保存方法和温度。
2.制备合适的保存液：保存液的配方和pH值应与菌种相适应，以保证菌种的存活和精确性。
3.保持无菌操作：在菌种保藏过程中，需保持无菌操作，以防止细菌污染。
多种菌种保藏的原理和方法
多种菌种保藏的原理和方法多种菌种的保藏是为了保持其生物特性和保存其遗传信息，以便后续研究和应用。
在微生物学研究和应用中，常见的菌种保藏方法有冷冻保藏、干燥保藏、冷冻干燥保藏、凝胶保藏和液氮保藏等。
以下将详细介绍这些保藏方法的原理和具体步骤。
一、冷冻保藏冷冻保藏是最常见的菌种保藏方法之一、其原理是通过在超低温条件下将菌株冷冻保存，阻止其新陈代谢和繁殖，从而使菌株保持低活性状态。
冷冻保存可以使用明胶冻块、甘油、液氮等不同保藏物质，具体步骤如下：1.选取新鲜的菌株，生长到对应的阶段。
2.制备保存液，通常使用明胶冻块（10%明胶+10%蔗糖+10%琼脂）、甘油（20%甘油+10%消毒水）、液氮等。
选择合适的保存液可以根据菌株的特性和使用要求进行调整。
3.微生物菌株生长到对应阶段后，用无菌工具将其移至保存液中。
4.放置在超低温冷冻箱中，通常设置在-80℃的环境下保存，避免产生晶状冰或冻伤。
可以考虑使用其他液氮冷冻方法，如液氮喷雾冷冻法等。
5.菌株保存时间根据所用保存液和保存条件而有所不同。
文献上常见的冷冻保存时间一般为6个月，但很多菌株可以保藏数年或数十年。
二、干燥保藏干燥保藏是将菌株通过脱水处理后进行保存。
此方法的原理是通过将菌株暴露在干燥条件下，除去菌体内的水分，从而抑制其活性，确保长时间保存。
常见的干燥保藏方法有真空冷冻干燥法和常温干燥法。
1.用无菌试管或无菌孢子瓶盛装菌株，通常使用液体培养基等。
2.将菌株液体培养基均匀均匀分配到无菌培养皿或钢平。
3.将培养皿置于通风恒温箱中进行干燥，可以选择真空干燥或通风干燥。
真空干燥通常在-80℃下真空干燥24小时以上，而常温干燥则需要3-7天左右。
4.干燥后的培养物使用无菌器具封装密封保存，放置在低湿、阴凉的地方，通常保存在常温下60-70%相对湿度的环境中或4℃冰箱中。
三、冷冻干燥保藏冷冻干燥保藏是将菌株进行预冷冻处理，然后在真空条件下进行干燥保存。
此方法的原理是在菌株处于冷冻状态下脱水处理，从而更好地保存菌株的生物学特性。
5菌种保藏的原理和方法ppt课件
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（三）固体曲保藏法
适用菌种：产孢子的真菌 该法麸皮、大米、小米或麦粒等天然农产品为
产孢子培养基，使菌体产生大量的休眠体（孢 子）后加以保存。 注意：控制适当的水分。 保存期：1-3年
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（四）沙土管干燥保藏法
原理：低温、寡营养 保藏期：4-5 ℃冰箱 保存期1-2年。 适用菌种：产孢子的丝状真菌和放线菌以及产
冻干燥对微生物引起的冻结损伤。 常采用脱脂牛奶或血清。 ③菌悬液制备：与保护剂混合，放在安瓿瓶内； ④冷冻干燥（用低温酒精或干冰（-15 ℃以下）使之速冻，
在低温下用真空泵抽干）
8 保藏期：将安瓿瓶熔封，低温4-5 ℃，保藏5-10年。
（五）真空冷冻干燥保藏法
影响保藏效果的因素: 菌种、菌龄和样品中的含水量。 适用菌种：适用于各种微生物。 特点：保藏期长、变异小、适用范围广，较理想保藏
养基营养成分、低温、干燥、隔氧及添加保护剂 等方法。
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二、菌体曲保藏法 沙土管干燥保藏法 真空冷冻干燥保藏法 液氮保藏法 悬液保藏法 低温保藏法
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（一）斜面保藏法
原理：低温 方法： 将培养好的斜面菌种，置于4-5℃冰箱保存，定
期移植到新的斜面培养基上继续保藏。 一般保存期3-6个月。 注意事项: 冰箱的温度； 培养基水分蒸发情况（用橡皮塞代替棉塞）。 优点：简便，适合于实验室中菌种的短期保藏。 缺点：短期内多次传代，易引起菌种变异、退化，染菌
几率增加。
4 适用菌种：细菌、放线菌、酵母、丝状真菌等短期保藏
（二）穿刺保藏法
原理：低温、缺氧 保藏期： 4-5℃冰箱 保存期6-12个月 适用菌种：各种好气性细菌 液体石蜡作用：防止培养基失水并隔绝氧气 液体石蜡保藏法 （在斜面菌种上加入灭菌后
常见微生物的菌种保藏及原理
常见微生物的菌种保藏及原理微生物指的是在显微镜下可见的微小生物（如细菌、真菌等）。
由于微生物在各种环境中具有重要的应用价值，如食品加工、制药、环境修复等，因此对微生物菌种的保藏具有重要意义。
目前常见的微生物菌种保藏方法主要包括冷冻保存、干燥保存、冷冻干燥保存和液氮保存等。
下面将介绍这些保存方法的原理及其在微生物保藏中的应用。
一、冷冻保存冷冻保存是最常见且简单的微生物保藏方法之一、其原理是通过降低菌种的生长和代谢速度来延缓细胞死亡，从而使菌种长时间保存。
常见的冷冻保存方式有两种：低温保存和液氮保存。
1.低温保存低温保存常用的温度为-80℃。
将微生物菌种培养物加入附加剂（如甘油、蔗糖）后，迅速冷冻至-80℃，然后保存在低温冰箱中。
这种方法简单易行，并且不需要特殊仪器设备，适用于大多数微生物菌种的保存。
2.液氮保存液氮保存是一种极低温的保存方法，常用温度为-196℃。
液氮保存可以在较长时间内保持微生物菌种的细胞完整性和代谢活性。
液氮保存通常需要配备专门的液氮保存设备，如液氮罐和液氮冷冻器。
虽然保存设备和条件较为复杂，但是液氮保存方法适用于保存需求较严格的微生物菌种。
二、干燥保存干燥保存是通过去除菌种的水分来实现菌种长时间保存的一种方法。
常见的干燥保存方法主要有两种：常温干燥保存和真空冷冻干燥保存。
1.常温干燥保存常温干燥保存是将微生物菌种培养物均匀涂布于无菌玻璃片或滤纸上，然后在室温下进行干燥。
干燥后的微生物菌种可以直接保存，也可以以泡脱水的方式进行保存。
常温干燥保存适用于耐受干旱的微生物菌种。
2.真空冷冻干燥保存真空冷冻干燥保存是将微生物菌种培养物在真空条件下进行冷冻干燥。
首先，将菌种培养物在低温下冷冻，然后在低压下去除水分。
真空冷冻干燥保存可以保持菌种的细胞完整性和代谢活性。
这种方法适用于保存需求较严格的微生物菌种。
三、液氮保存液氮保存是将微生物菌种培养物冷冻在液氮温度下进行保存的方法。
如前所述，液氮保存要求采用极低温的液氮温度（-196℃）进行保存。
常见病原菌的灭菌、抑菌方法 及原理
消毒就是消除毒害，这里的“毒害”就是 指传染源或致病菌的意思，英文中的“disinfection”也是“消除传染”的意思。所以， 消毒是一种采用较温和的理化因素，仅杀 死物体表面或内部一部分对人体有害的病 原菌，而对被消毒的物体基本无害的措施。 例如一些常用的对皮肤、水果、饮用水进 行药剂消毒的方法；对啤酒、牛奶、果汁 和酱油等进行消毒处理的巴氏消毒法，等 等。
有害微生物的控制措施
杀灭法
抑制法
消毒（部分杀灭， 仅杀灭病原体）
灭菌（彻底杀灭 一切微生物）
防腐 化疗 （抑制霉腐微生物） （抑制宿主体内 的病原菌）
杀菌
溶菌
灭菌
化学灭菌法
生物灭菌法
物理灭菌法
气体灭菌法
液体灭菌法
抗生素
噬菌体
细菌素
高温灭菌法 辐射灭菌法 超声波灭菌法 微波灭菌法
激光灭菌法
静高压灭菌法
防腐就是利用某种理化因素完全抑制霉 腐微生物的生长繁殖，从而达到防止食品 等发生霉腐的措施。
化疗即化学治疗。它是利用具有高度选择毒力 (selectivetoxicity，即对病原菌具有高度毒力而对宿 主无显著毒性)的化学物质来抑制宿主体内病原微 生物的生长繁殖，借以达到治疗该传染病的一种 措施。用于化疗目的的化学物质称化学治疗剂 (chemotherapeutant)。最重要的化学治疗剂如各 种抗生素、磺胺类药物和中草药中的有效成分等。
高温灭菌法
干热灭菌法
湿热灭菌法
火焰灼烧法
烘箱内热 空气灭菌法
常压下
加压下
巴氏消毒法 （杀死病菌）
煮沸消毒法 低温间歇灭菌法 常规加压 灭菌法 （杀繁殖体） （杀死芽孢）
连续加压 灭菌法
低温维持法
菌种保藏的方法
菌种保藏的方法菌种保藏是一种重要的微生物资源保护方式，对于研究、应用和开发微生物具有重要意义。
以下是几种常见的菌种保藏方法及其操作步骤。
一、低温冷冻保藏法低温冷冻是一种常用的微生物保藏方法，适用于大多数真菌、细菌和酵母菌。
其主要原理是将菌株保存在低温下，使其生理活动缓慢，以延长菌种的保藏时间。
操作步骤：1. 选择菌株：选择生长良好、菌株特性完整的菌株进行保藏。
2. 菌株处理：将菌株经过预处理，如鉴定鉴别、菌落孤立等。
3. 制备保存液：根据不同菌株的需要，制备适宜的保存液，常用的保存液有甘油、甘露醇等。
4. 菌种保存：将菌株用保鲜膜包裹，放入保存管中，加入保存液，密封保存管。
5. 冷冻保存：将保存管放入低温冰箱或液氮罐中进行冷冻保存。
二、干燥保藏法干燥保藏法是一种简便、经济的保藏方法，适用于真菌、细菌、放线菌等微生物。
其基本原理是将菌种与干燥剂混合，使其水分含量降低，从而实现微生物的休眠状态。
操作步骤：1. 选择菌株：选择生长良好、菌株特性完整的菌株进行保藏。
2. 菌株处理：将菌株经过预处理，如鉴定鉴别、菌落孤立等。
3. 制备干燥剂：根据不同菌株的需要，选择合适的干燥剂，如硅胶、氧化钙等。
4. 菌种混合：将菌株与干燥剂按照一定比例混合均匀。
5. 干燥保存：将混合物均匀地散布在无菌培养基上，置于通风干燥的环境中进行保存。
三、冷冻冻干保存法冷冻冻干保存法是一种较为复杂的菌株保藏方法，适用于难保存的微生物，如厌氧菌、放线菌等。
其主要原理是将菌株在低温下冻结干燥，从而保护微生物的活力。
操作步骤：1. 选择菌株：选择生长良好、菌株特性完整的菌株进行保藏。
2. 菌株处理：将菌株经过预处理，如鉴定鉴别、菌落孤立等。
3. 制备保存液：根据不同菌株的需要，制备适宜的保存液，如甘油、甘露醇等。
4. 冷冻过程：将菌株加入保存液中，放入冷冻机冷冻至低温（通常为-80℃）。
5. 冻干过程：将冷冻的菌株经过真空排气、结冰降温等步骤进行冻干处理。
常见病原菌的灭菌和抑菌的方法
低病原菌的传播。
基因编辑技术
03
利用基因编辑技术，修改病原菌的基因，以阻止其繁殖和传播。
社会和环境影响
抗菌药物的排放
抗菌药物的排放会对环境造成影响，需要采取措施减少其排放。
抗菌残留物的危害
抗菌残留物可能会对人体健康造成潜在危害，需要加强对其安全 性的研究和监测。
公众意识
提高公众对病原菌传播和防控的认识，加强个人卫生习惯的培养， 以降低病原菌的传播风险。
化学灭菌法
气体灭菌
使用环氧乙烷、甲醛等化学气体，通过熏蒸方式杀死病原菌。适用于医疗器械、塑料制品等的消毒。
液体消毒剂
使用酒精、次氯酸钠等液体消毒剂，通过浸泡或擦拭方式杀死病原菌。适用于皮肤、手术器械等消毒 。
04 抑菌方法
物理抑菌法
温度控制
通过加热、冷冻等手段改 变温度，抑制病原菌的生 长和繁殖。
耐药性的问题已经成为全球公共卫生领域的重大挑战，需要国际合 作来解决。
新型抗菌药物研发
针对耐药性病原菌，需要研发新型抗菌药物，以保持其有效性。
新技术的研发和应用
新型灭菌技术
01
利用紫外线、等离子体、高温等新型灭菌技术，以减少对环境
的污染和破坏。
抗菌材料
02
研发具有抗菌功能的材料，如抗菌涂料、抗菌纺织品等，以降
生物抑菌法
益生菌
抗体
通过补充益生菌，调节肠道微生物平 衡，抑制病原菌的生长。
利用特异性抗体与病原菌结合，阻止 其附着和繁殖。
噬菌体
利用噬菌体特异性地感染和杀死特定 病原菌。
05 灭菌和抑菌的挑战与未来 发展
耐药性的问题
抗生素滥用
过度使用抗生素会导致病原菌产生耐药性，降低抗生素的有效性。
常见微生物的菌种保藏及原理ppt课件
（三）、菌种保藏的方法
1、斜面低温保藏法 2、石蜡油封藏法 3、砂土管保藏法 4、麸皮保藏法 5、冷冻真空干燥保藏法 6、液氮超低温保藏法
1、斜面低温保藏法
将菌种接种在适宜的斜面培养基上,待菌种生长完全后,置于4℃ 左右的冰箱中保藏,每隔一定时间（保藏期）再转接至新的斜面 培养基上,生长后继续保藏,如此连续不断.此法广泛适用于细菌、 放线菌、酵母菌和霉菌等大多数微生物菌种的短期保藏及不宜 用冷冻干燥保藏的菌种.放线菌、霉菌和有芽孢的细菌一般可保 存6个月左右,无芽孢的细菌可保存1个月左右,酵母菌可保存3个 月左右.如以橡皮塞代替棉塞,再用石蜡封口,置于4℃冰箱中保藏, 不仅能防止水分挥发、能隔氧,而且能防止棉塞受潮而污染.这 一改进可使菌种的保藏期延长.
该法的优点是简便易行,容易推广,存活率高,故科研和生产上对 经常使用的菌种大多采用这种保藏方法.其缺点是菌株仍有一定 程度的代谢活动能力,保藏期短,传代次数多,菌种较容易发生变 异和被污染.
2、石蜡油封藏法
此法是在无菌条件下,将灭过菌并已蒸发掉水分的液体石蜡倒入 培养成熟的菌种斜面（或半固体穿刺培养物）上,石蜡油层高出 斜面顶端lcm,使用的液体石蜡要求优质无毒, 化学纯规格,其灭菌条件是：150～170℃烘箱内灭菌lh；或121℃ 高压蒸汽灭菌60～80min,再置于80℃的烘箱内烘干除去水分.
（一）、菌种保藏的目的
微生物在使用和传代过程中容易发生污染、变异甚 至死亡,因而常常造成菌种的衰退,并有可能使优良菌 种丢失.菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持其原 有性状和活力的稳定,确保菌种不死亡、不变异、不 被污染,以达到便于研究、交换和使用等诸方面的需 要.
微生物菌种保藏方法
微生物菌种保藏方法菌种是一种重要的生物资源，菌种保藏是重要的微生物基础工作。
菌种保藏就是利用一切条件使菌种不死、不衰、不变，以便于研究与应用。
(一)常规保藏方法1 目的1.1 了解菌种保藏的基本原理1.2 掌握几种常用的菌种保藏方法。
2 原理菌种保藏的方法很多。
其原理却大同小异，不外乎为优良菌株创造一个适合长期休眠的环境,即干燥、低温、缺乏氧气和养料等。
使微生物的代谢活动处于最低的状态，但又不至于死亡，从而达到保藏的目的。
依据不同的菌种或不同的需求，应该选用不同的保藏方法。
一般情况下，斜面保藏、半固体穿刺,石蜡油封存和砂土管保藏法较为常用，也比较容易制作。
3 材料3.1菌株待保藏的适龄菌株斜面3.2培养基肉汤蛋白胨斜面，半固体及液体培养基。
3.3 试剂10%HCl无水氯化钙、石蜡油、五氧化二磷。
3.4 器具用于菌种保藏的小试管(10*100毫米)数支、5毫升无菌吸管、l 毫升无菌吸管等、灭菌锅、真空泵、干燥器、冰箱无菌水、筛子(40目、120目)、标签、接种针、接种环、棉花、牛角匙等等。
4 流程斜面保藏→半固体穿刺保藏→石蜡油封存→砂土管保藏5 步骤5.1斜面保藏5.1.1流程标记试管→接种→培养→保藏5.1.2步骤5.1.2.1贴标签取无菌的肉汤蛋白胨斜面数支。
在斜面的正上方距离试管口2-3厘米处贴上标签。
在标签纸上写明接种的细菌菌名、培养基名称和接种日期。
5.1.2.2斜面接种将待保藏的细菌用接种环以无菌操作在斜面上作划线接种。
5.1.2.3培养置37恒温箱中培养48小时。
5.1.2.4保藏斜面长好后，直接放入4℃的冰箱中保藏。
这种方法一船可保藏三个月至半年。
5.2半固体穿刺保藏5.2.1流程标记试管→穿刺接种→培养→保藏5.2.2 步骤5.2.2.1贴标签取无菌的半固体肉汤蛋白等直立柱数支，贴上标签，注明细菌菌名、培养基名称和接种日期。
5.2.2.2穿刺接种用接种针以无菌方式从待保藏的细菌斜面上挑取菌种，朝直立柱中央直刺至试管底部，然后又沿原线拉出。
菌种保藏的原理
菌种保藏的原理菌种保藏是指将某种细菌或真菌的种子、孢子、菌丝等保存起来，以便长期保存和使用。
菌种保藏的原理主要通过控制温度、湿度和气氛条件，抑制微生物的活动，从而延缓其生长和死亡的过程。
下面将详细介绍菌种保藏的原理及其重要性。
一、1. 温度控制：温度是细菌或真菌生长和存活的重要因素之一。
菌种保藏一般选择较低的温度，如常见的保存温度为-80℃或液氮温度下。
低温能够减缓细胞内生化反应的进行，从而减慢菌种的代谢活动，延缓细菌或真菌的衰老和死亡。
2. 湿度控制：保持适宜的湿度有助于细菌或真菌的保藏。
一般来说，较低的湿度有利于防止微生物的繁殖和生长，但过低的湿度可能导致菌种失活。
因此，菌种保存时需要在恰当的湿度条件下进行，以避免菌种的损失。
3. 气氛控制：气氛是菌种保藏过程中的关键因素之一。
一般来说，菌种保藏需要采用无氧气氛或富含二氧化碳的气氛，以抑制革兰氏阳性细菌和真菌的生长。
在无氧或富CO2气氛下，微生物的生长速度减慢，从而有利于菌种的长期保存。
二、菌种保藏的重要性1. 保护珍贵菌种资源：菌种保藏能够有效地保护珍贵的细菌和真菌资源，防止其因环境变化、病原微生物感染等原因而丧失。
2. 长期保存和使用：通过菌种保藏，可以将菌株保存数年甚至几十年，延长其使用寿命，方便科研工作者进行实验和研究。
3. 传承和交流：菌种保藏有利于细菌和真菌资源的传承和交流，能够使科研工作者之间进行菌株的共享和合作，促进科学研究的发展。
4. 生物工程的发展：菌种保藏为生物工程的发展提供了坚实的基础。
通过保存不同的菌株，科研人员可以进行基因工程、酶工程等研究，推动生物技术的进步。
综上所述，菌种保藏的原理主要是通过控制温度、湿度和气氛等条件，抑制微生物的生长和代谢活动，延缓其衰老和死亡的过程。
菌种保藏具有重要的意义，可以保护珍贵菌种资源、实现长期保存和使用、促进科研交流以及推动生物工程的发展。
在实际操作中，科研工作者需要根据不同的菌种特性和需求，选择适当的保存方法和条件，以确保菌株的完整性和稳定性。
微生物菌种保藏原理与方法
1 简易保藏法
定期移植时间间隔： 一般不产芽孢的细菌约2周至1个月； 放线菌、酵母菌和丝状真菌4~6个月； 石蜡油封法一般可保藏1年。 优缺点：操作简单，可随时观察菌种生长状况，
但较费时费力，因经常移植传代，微生物物易 发生变异。
1.1斜面传代保藏法
贴标签：菌种 菌株 接种日期 接种：对数生长期后期 成熟的孢子 培养： 细菌—37℃，18~24h
收藏：面塞外包牛皮纸或用无菌橡皮塞，把菌种管直立 放置于4 ℃冰箱中。
放线菌、霉菌及产芽孢细菌一般可保2年，酵母菌及不 产芽孢细菌可保1年。
2 甘油保藏法
保护剂： 40%左右的甘油 机理：适当浓度甘油中，少量甘油分子进入细胞，
使菌种细胞在冷冻过程中缓解了其由于强烈脱水 及胞内形成冰晶而引起的破坏。 保藏温度：-20 ℃左右或-70 ℃ 特点:操作简单，保藏期长，保存期间取样测试方 便，在基因工程中常用于保存含质粒的菌株，一 般可保3~5年。
1.3石蜡油封法
石蜡油灭菌：将石蜡油装入三角瓶中，装量不超过总体 积的1/3，塞上面塞，外包牛皮纸，加压蒸汽灭菌（121 ℃ ，30min），连续灭菌2次。然后在40 ℃温箱中放置2 周或置105~110 ℃烘箱中烘2h，除去石蜡油中的水分。
培养
加石蜡油：以无菌吸管吸石蜡油加至菌种管中，加入量 以高出斜面顶端或直立柱培养基表面约1cm为宜。
该法可同时用于细菌、放线菌、丝状真菌、 （除少数不产孢子或只产生丝状体真菌外）、 酵母菌及病毒的保藏。
该方法保藏菌种范围广、保藏时间长（一般可 达10~20年），存活率高，是目前最有效的菌 种保藏方法之一。
4冷冻真空干燥保藏法
安瓿管
5液氮超低温保藏法
菌种保藏的基本原理
菌种保藏的基本原理
菌种保藏的基本原理是利用各种方法将菌种冻结或冷冻保存，以阻止其细胞代谢的进行，从而延长菌种的寿命。
其目的是使菌种的活性和遗传特性得以保持，以便将来进行研究或应用。
一种常见的菌种保藏方法是冷冻保藏。
在这种方法中，菌株首先在无菌条件下进行预培养，然后将菌株悬浮液加入含有保护剂的冻存液中。
通常使用的保护剂包括甘油、二甲亚砜或液氮。
将菌株冷冻在超低温下，通常为-80℃或液氮的温度。
这样可
防止冷冻液中的水结晶损伤菌株细胞。
在需要恢复或使用菌株时，可以通过快速解冻并转移到适当的培养基中，使其恢复生长。
另一种常用的菌种保藏方法是冻干保藏。
这种方法通过将菌株培养在适当的培养基上，然后将细菌培养物冷冻，最后在真空条件下脱水。
这样可以去除菌株中的水分，并减缓细胞代谢的进行。
冻干菌株能够在常温下长期保存，并在需要时通过将其溶解并接种到合适的培养基中进行复苏和生长。
此外，还有一些其他的方法可以用于菌种保藏，如胶体保藏、冷冻干燥、冷冻液氮保藏等。
这些方法都旨在延长菌株的寿命，以便将来的研究或应用。
常见微生物的菌种保藏及原理
（ห้องสมุดไป่ตู้）、菌种保藏的目的
微生物在使用和传代过程中容易发生污染、变异甚 至死亡,因而常常造成菌种的衰退,并有可能使优良菌 种丢失.菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持其原 有性状和活力的稳定,确保菌种不死亡、不变异、不 被污染,以达到便于研究、交换和使用等诸方面的需 要.
（二）、菌种保藏的原理
（三）、菌种保藏的方法
1、斜面低温保藏法 2、石蜡油封藏法 3、砂土管保藏法 4、麸皮保藏法 5、冷冻真空干燥保藏法 6、液氮超低温保藏法
1、斜面低温保藏法
将菌种接种在适宜的斜面培养基上,待菌种生长完全后,臵于4℃ 左右的冰箱中保藏,每隔一定时间（保藏期）再转接至新的斜面 培养基上,生长后继续保藏,如此连续不断.此法广泛适用于细菌、 放线菌、酵母菌和霉菌等大多数微生物菌种的短期保藏及不宜 用冷冻干燥保藏的菌种.放线菌、霉菌和有芽孢的细菌一般可保 存6个月左右,无芽孢的细菌可保存1个月左右,酵母菌可保存3个 月左右.如以橡皮塞代替棉塞,再用石蜡封口,臵于4℃冰箱中保藏, 不仅能防止水分挥发、能隔氧,而且能防止棉塞受潮而污染.这 一改进可使菌种的保藏期延长. 该法的优点是简便易行,容易推广,存活率高,故科研和生产上对 经常使用的菌种大多采用这种保藏方法.其缺点是菌株仍有一定 程度的代谢活动能力,保藏期短,传代次数多,菌种较容易发生变 异和被污染.
此法操作简便、高效、保藏期一般可达到15年以上,是目前被公 认的最有效的菌种长期保藏技术之一.除了少数对低温损伤敏感 的微生物外,该法适用于各种微生物菌种的保藏,甚至连藻类、 原生动物、支原体等都能用此法获得有效的保藏.此法的另一大 优点是可使用各种培养形式的微生物进行保藏,无论是孢子或菌 体、液体培养物或固体培养物均可采用该保藏法.其缺点是需购 臵超低温液氮设备,且液氮消耗较多,操作费用较高. 要使用菌种时,从液氮罐中取出安瓿瓶,并迅速放到35～40℃温 水中,使之冰冻熔化,以无菌操作打开安瓿瓶,移接到保藏前使用 的同一种培养基斜面上进行培养.从液氮罐中取出安瓿瓶时速度 要快,一般不超过1min,以防其他安瓿瓶升温而影响保藏质量.并 且取样时一定要戴专用手套以防止意外爆炸和冻伤
常见病原菌的灭菌抑菌保藏原理及方法..PPT39页
31、别人笑我太疯癫，我笑他人看不 穿。(名 言网) 32、我不想听失意者的哭泣，抱怨者 的牢骚 ，这是 羊群中 的瘟疫 ，我不 能被它 传染。 我要尽 量避免 绝望， 辛勤耕 耘，忍 受苦楚 。我一 试再试 ，争取 每天的 成功， 避免以 失败收 常在别 人停滞 不前时 ，我继 续拼搏 。
55、 为 中 华 之 崛起而 读书。 ——周 恩来
谢谢！
51、 天 下 之 事 常成 于困约 ，而败 于奢靡 。——陆 游 52、 生 命 不 等 于是呼 吸，生 命是活 动。——卢 梭
53、 伟 大 的 事 业，需 要决心 ，能力 ，组织 和责任 感。 ——易 卜 生 54、 唯 书 籍 不 朽。——乔 特
33、如果惧怕前面跌宕的山岩，生命 就永远 只能是 死水一 潭。 34、当你眼泪忍不住要流出来的时候 ，睁大 眼睛， 千万别 眨眼!你会看到 世界由 刻变得 清澈明 晰。盐 。注定 要融化 的，也 许是用 眼泪的 方式。
35、不要以为自己成功一次就可以了 ，也不 要以为 过去的 光荣可 以被永 远肯定 。
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效果 灭菌 灭菌Βιβλιοθήκη 用途废弃污物、尸体
接种环，试管口
干烤 热
红外线 煮沸法 湿 高压蒸
干烤箱，热空气
160-170º C 2h 电磁波热效应 100º C ， 5-10 分 钟，沸水
高压蒸气灭菌器 103.4Kpa 121.3º C×15-20 分钟
灭菌
玻璃器皿等耐高温的物
品
灭菌
消毒
医疗器械 饮水和食具 耐高温 耐湿物品
抑菌时间可为 2min、5min、 10min、20min相 同条件下作用时 间越长，杀菌率 越低，所以选择 最长的作用时间 来检测抑菌性能 更具有代表性
杀菌
残留消 中和剂法（化学 毒剂的 中合法） 去除方 法不同
抑菌
稀释法（酸碱平衡 法）
评价标 杀菌率≥90%，产 抑菌率≥50%~90%， 品有杀菌作用。 产品有抑菌作用， 准
4冷冻真空干燥保藏法
安瓿管
5液氮超低温保藏法
• 将菌种保藏在超低温（-196℃~-150 ℃ ） 的液氮中，可降低变异率和长期保持原 种的性状。 • 对于冷冻干燥保藏法或其他干燥保藏有 困难的微生物，如支原体、衣原体及难 以形成孢子的小霉小型藻类或原生动物 都可用本法长期保存，这是当前保藏菌 种最理想的方法。 • 保护剂：20%甘油或10%二甲基亚砜 （DMSO）
抑菌的原理
• 4、高渗：通过盐腌和糖渍等高渗措施来保 护食物，是在民间早就流传的有效防霉腐 方法。 • 5、高酸度：在我国具有悠久历史的泡菜， 就是利用乳酸菌的厌氧发酵使新鲜蔬菜产 生大量乳酸，借这种高酸度而达到抑制杂 菌和防霉腐的目的。
• 6、高纯度：用白酒或黄酒保存食品，在我 国有悠久传统，如醉蟹、醉麸、醉笋和黄 泥螺等产品，都是特色风味食品。 • 7、加防腐剂：有些食品、调味剂、饮料、 果汁或工业器材中，可加入可加入适量的 防腐剂或防霉剂来达到防霉腐的目的，如 丙酸（0.32%）或乙二酸（0.32%）来做面 包等的防腐剂。
常见病原菌的灭菌、抑菌、保藏 原理及方法
消毒灭菌
基本概念 消毒（disinfection）：杀死物体上或环 境中的病原微 生物,并不一定杀死细菌 芽胞或非病原微生物的方法。 灭菌（sterilization）：杀死 物体上所 有微生物的方法(包括芽孢)。
一、消毒灭菌的方法
常用的消毒和灭菌方法可分为： 1）物理方法： 热力灭菌法 辐射杀菌法 滤过除菌法 干燥与低温抑菌法 2）化学方法 3）生物灭菌法
抑菌率≥90%产品有 较强的抑菌作用
菌种保藏基本原则
1、保藏菌种时首先要选择它们的 休眠体，如分生孢子、芽孢等，并 创造一个低温、干燥、缺氧、避光 和缺少营养的环境条件，以利于休 眠体能较长时间维持其休眠状态。 2、对于不产孢子的微生物，也要 使其新陈代谢处于最低水平，又不 会死亡，从而达到长期保藏的目的 。
3 干燥保藏法 • 基本原理：将微生物赖以生存的水 分蒸发掉，使细胞处于休眠和代谢 停滞状态，从而达到较长期保藏的 目的。低温条件下，保藏期可达数 年至十几年之久。 • 砂土管保藏法、明胶片保藏法、硅 胶保藏法、麸皮保藏法
3干燥保藏法
• 砂土管保藏法—产生芽孢的细菌及 形成孢子的霉菌和放线菌。 • 方法：处理砂土 装沙土管 制备菌液 加孢子液 干燥 收藏 恢复培养 • 明胶片保藏法—细菌 • 制备菌悬液 制备菌液 制备蜡纸 加菌 液 干燥 收藏 恢复培养
化学因素
• 1、表面消毒剂：随浓度递增相继出现制菌 和杀菌作用，形成一个连续的作用谱 • 2、磺胺类药物：抗代谢 • 3、抗生素：在低浓度能抑制和干扰他种生 物的生命活动
杀菌
抑菌
含义 作用 时间
消毒剂对微生物的杀灭能 生物制剂抑制妨 力 碍细菌生长繁殖 及活性的能力
杀菌时间可为2min、 5min、10min、20min 相同条件下作用时间 越短，杀菌率越低， 所以选择最短的作用 时间来检测杀菌性能 更具有代表性
3干燥保藏法
• 硅胶保藏法—丝状真菌。 • 方法：制备硅胶 制备菌液 加 菌液 干燥 收藏 恢复培养 • 麸皮保藏法—产孢子的丝状真 菌。 • 制备麸皮培养基 培养菌种 干 燥 收藏 恢复培养
4冷冻真空干燥保藏法
• 该法集中了菌种保藏中低温、缺氧、干燥 和添加保护剂等多种有利条件，是微生物 代谢处于相对静止状态。 • 该法可同时用于细菌、放线菌、丝状真菌、 （除少数不产孢子或只产生丝状体真菌 外）、酵母菌及病毒的保藏。 • 该方法保藏菌种范围广、保藏时间长（一 般可达10~20年），存活率高，是目前最 有效的菌种保藏方法之一。
防腐
• 利用某种理化因素完全抑制霉腐微 生物的生长繁殖，即通过制菌作用 防止食品、生物制品等对象发生霉 腐的措施
化疗
• 指利用具有高度选择毒力，即对病 原菌具高度毒力而对其宿主基本无 毒的化学物质来抑制主体内病原微 生物的生长繁殖，借以达到治疗该 宿主传染病的一种措施
抑菌的方法
• • • • • • • 1、低温 2、缺氧 3、干燥 4、高渗 5、高酸度 6、高醇度 7、加防腐剂
• 杀菌或抑菌，并无绝对界限，常常不易 区分。同一物质，浓度高时可杀菌，而 浓度低时只能抑菌，作用时间长可杀菌 ，作用时间短则只能抑菌。另外，由于 各种微生物性质的不同，同一物质对一 种微生物具有杀菌作用，而对另一种微 生物可能仅有抑菌作用。
抑菌
• 采用化学或物理方法抑制或 妨碍细菌生长繁殖及其活性 的过程。
灭菌
气灭菌
热 法
辐射杀菌法
紫外线（ ultraviolet ray,UV) : 260nm-266nm（最佳杀菌波 长） 杀菌原理：使DNA上相邻的T碱基通过共价 键结合成 二聚 体，干扰DNA复制与 转录，导致细菌死亡 特点： 穿透力弱 适用范围：适于空气和物 体表面消毒
滤过除菌法（filtration） 机理：用物理阻留的方法将液体或空气中的 细菌除去, 以达到除菌目的 器具：滤菌器（filter） 适用物品：不耐高温物品（血清、毒素、抗 生素）以及 空气等的除菌
1.1斜面传代保藏法
• 贴标签：菌种 菌株 接种日期 • 接种：对数生长期后期 成熟的孢子 • 培养： 细菌—37℃，18~24h 酵母—28~30 ℃ ，36~60h 放线菌和丝状真菌—28 ℃ ，4~7d • 收藏：管口面塞用牛皮纸包扎，或用融化 的固体石蜡封棉塞后置4冰箱保存。
1.2半固体穿刺保藏法
2 甘油保藏法 • 方法步骤： • 无菌甘油的制备：80%的甘油在 121℃灭菌20min • 保藏培养物的制备：活化 纯化 性能 检测 制备菌种培养物 • 保藏菌悬液的制备：液体法 菌苔法 -20 ℃保藏 • 快速冷冻；乙醇-干冰 液氮 • 超低温保藏：-70 ℃ 一般细菌、酵母 保存期为3~5年。
1 简易保藏法 • 定期移植时间间隔： • 一般不产芽孢的细菌约2周至1个月； • 放线菌、酵母菌和丝状真菌4~6个月； • 石蜡油封法一般可保藏1年。 • 优缺点：操作简单，可随时观察菌种 生长状况，但较费时费力，因经常移 植传代，微生物物易发生变异。
1 简易保藏法 • • • • • 定期移植时间间隔： 一般不产芽孢的细菌约2周至1个月； 放线菌、酵母菌和丝状真菌4~6个月； 石蜡油封法一般可保藏1年。 优缺点：操作简单，可随时观察菌种 生长状况，但较费时费力，因经常移 植传代，微生物物易发生变异。
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贴标签 穿刺接种：将菌种直刺入直立柱中央 培养：同传代保藏法 收藏：待菌长好后，用浸有石蜡的无 菌软木塞或橡皮塞代替面塞并塞紧， 置4 ℃冰箱中保藏，保藏0.5~1年。
1.3石蜡油封法
• 石蜡油灭菌：将石蜡油装入三角瓶中，装量不超 过总体积的1/3，塞上面塞，外包牛皮纸，加压蒸 汽灭菌（121 ℃ ，30min），连续灭菌2次。然后 在40 ℃温箱中放置2周或置105~110 ℃烘箱中烘2h， 除去石蜡油中的水分。 • 培养 • 加石蜡油：以无菌吸管吸石蜡油加至菌种管中， 加入量以高出斜面顶端或直立柱培养基表面约 1cm为宜。 • 收藏：面塞外包牛皮纸或用无菌橡皮塞，把菌种 管直立放置于4 ℃冰箱中。 • 放线菌、霉菌及产芽孢细菌一般可保2年，酵母菌 及不产芽孢细菌可保1年。
2 甘油保藏法
• 期长，保存期间取样测试方便，在基因工程 中常用于保存含质粒的菌株，一般可保3~5 年。保护剂： 40%左右的甘油 • 机理：适当浓度甘油中，少量甘油分子进入 细胞，使菌种细胞在冷冻过程中缓解了其由 于强烈脱水及胞内形成冰晶而引起的破坏。 • 保藏温度：-20 ℃左右或-70 ℃ • 特点:操作简单，保藏
热力灭菌 原理： 破坏菌体蛋白质与核酸，使其肽链断裂，蛋白 质 变性凝固，核酸解链崩解, 导致细菌死亡。
火焰灼烧
干热灭菌法
烘箱热空气灭菌
高温灭菌
常压 下 湿热灭菌消毒法
LIH法 巴氏消毒 HTST法 煮沸消毒 间歇灭菌 常规加压灭菌
加压
连续加压灭菌法
种类：
常用热力灭菌法
种类 焚烧 干 烧灼
方法 用焚烧炉燃烧 火焰烧灼
低温抑菌法
冷冻真空干燥法： 在低温状态下真空抽去水分
干燥与
用途：保存菌种
（二）化学消毒灭菌法
消毒剂杀菌机理： 1.使菌体蛋白变性和凝固 ： 酚、醇、酸硷、醛 类，重金属盐类（高浓度） 2 .干扰细菌的酶系统（酶失活）： 氧化剂、 重金属盐类（低浓度） 3. 损伤细菌细胞膜 酚类（低浓度）、表面活性 剂
抑菌的原理
• 1、低温：利用4℃以下的各种低温（0， -20，-70，-196℃等）保藏食物等 • 2、缺氧：采用抽真空、冲氮或二氧化碳、 加除氧剂等方法来有效防止食品和粮食等 的霉腐、变质而达到保鲜的目的 • 3、干燥：采用晒干、烘干或红外线干燥等 方法对粮食、食品等进行干燥保藏 • 在密封条件下，也用生石灰，无水氯化钙 干燥
常用菌种保藏方法 1 常用的简易保藏法： 斜面传代保藏法、半固体穿刺保藏法（适 用于细菌和酵母菌）、石蜡油封法 2 甘油保藏法 3 干燥保藏法 4 真空冷冻干燥保藏法 5 液氮超低温保藏法