载体构建的基本步骤

载体构建流程

菌落PCR
此步以适应现代分子生物学实验室批量工作的高效性，通常只需挑半个菌落直接作为模板进行常规PCR就能初步检测阳性克隆。初步检菌的阳性克隆接种提质粒，供后续酶切分析以及测序检测。

酶切检测阳性克隆

将菌检的阳性克隆所得质粒进行酶切分析，获得预期条带的即为阳性克隆。要进一步确认是否有因PCR所带来的点突变，插入，缺失等改变目的基因的序列，还需要对阳性克隆进行测序。选用的酶通常为设计引物的两个酶，因为它能完整切下ORF和载体骨架，可以通过条带大小以判断阳性克隆。
挑取阳性克隆去测序

测序是构建载体的最后一个关键的环节，只有测序正确的阳性克隆才算成功构建载体。 ORF序列不允许出现插入、缺失、改变氨基酸的点突变，至于密码子简并突变以及相似氨基酸间的突变要视客户要求或是否影响所研究蛋白的表达、结构、功能。不符合要求的测序文件需要重克隆或对其进行修补。
转化
基本步骤：（1）将100μl感受态细胞于冰上解冻。（2）取5μl连接产物加入到感受态细胞中，轻轻旋转几次以混匀内容物。在冰上放置30分钟。（3）将管放入预加温到42℃的水浴中，热激90秒。快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1~2分钟。（4）每管中加700μl LB培养基，37℃振荡培养1小时，进行复苏。（5）室温4,000rpm离心5分钟，弃去上清后，用剩余100μl 培养基重悬细胞并涂布到含抗性的LB琼脂平板表面。注意：细胞用量应根据连接效率和感受态细胞的效率进行调整。（6）将平板置于室温直至液体被吸收。（7）倒置平皿，于37℃培养，12~16小时后可出现菌落。
回收前
回收后
酶切载体带酶切目的条带
连接

载体构建流程

载体构建SOP流程:GenBank查询目的基因序列→根据ORF序列利用引物设计软件设计引物→表达目的基因的组织或细胞总RNA提取→RT-PCR获取目的基因→酶切目的基因和载体→分别纯化酶切的目的基因和载体并建立连接反应→转化→初步筛选阳性克隆→阳性克隆测序→测序正确的质粒保种并重提质粒I.获取目的基因/序列片段一.获取序列信息通过GENBANK数据和生物信息的方法设计目的基因或目的片段引物（shRNA、miRNA）。

PCR引物的设计原则：①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。

②产物不能形成二级结构。

③引物长度一般在15~30碱基之间。

④ G+C含量在40%~60%之间。

⑤碱基要随机分布。

-⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。

⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。

⑧引物5′端可以修饰。

⑨引物3′端不可修饰。

⑩避免在引物的3’端使用碱基A。

在实际设计引物中由于ORF两末端序列本身的限制，不能完全按照上述理想的设计原则，但也切记引物不能过长或过短。

过长的引物不容易打开其二级结构，与模板结合缓慢，也容易形成引物二聚体，通常不超过35bp(不包括酶切位点和保护碱基)。

过短的引物特异性差，扩出其它不相关片段，最终很难得到目的片段，通常不短于18bp(不包括酶切位点和保护碱基)。

要将目的基因定向克隆至相应载体，需要在上下游引物两端设计不同的酶切位点，由于酶切位点位于线性末端时酶对其识别切割能力大大降低，需依据NEB目录添加相应保护碱基，酶切时可相应增加时间。

二.制备模板1.分离高质量RNA：成功的cDNA合成来自高质量的RNA。

高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂，如EDTA或SDS。

RNA的质量决定了能够转录到cDNA上的序列信息量的最大值。

现在实验室通常使用Trizol试剂法提取总RNA，可以从多种组织和细胞中提取高质量的非降解RNA。

Trizol试剂法可以从最少100个细胞或1mg组织中提取RNA。

载体构建的基本步骤

载体构建
一、原理
依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。

二、操作步骤
5、载体与目的基因连接
如果电泳检测酶切成功的话，则仔细将所需的片段切割下来，将胶体回收（依照胶回收试剂盒说明书操作）；之后将回收的片段和载体连接。

置于温箱，12-16℃，保温8-16h
6、转化（连接产物转化到感受态细胞中）
依照转化具体操作步骤做感受态，将上述连接产物进行转化实验，涂板培养，37℃，
12-16h。

7、单克隆检测
（1）挑单克隆
先将AMP从冰箱中取出，待融化后，在3ml装有LB液体培养基的试管中加入3μL的
AMP，用枪头混匀；取1.5mlEP管5支（依情况可以多挑几管），给每支管中加500μL上述培养液，然后用接种。

载体构建基本步骤

载体构建基本步骤
载体构建基本步骤
1.选定目的基因，设计特异性引物，利用高保真酶进行PCR扩增
2.对扩增结果进行琼脂糖凝胶电泳检测（1%）,若检测结果正确，测
序结果之后进行胶回收目的片段
3.通过平末端连接将目的基因连接到克隆载体（PMD-18T）
4.转化DH5α，根据载体抗性涂板37度过夜培养
5.挑取阳性克隆进行PCR验证，PCR验证后挑取阳性克隆进行大摇并
提取质粒、双酶切，同时取500微升菌液送测序
6.测序结果正确后对提取的质粒进行双酶切回收目的片段
7.对表达载体用同样的限制性内切酶双酶切之后回收大片段
8.将目的片段与表达载体的大片段用T4DNA连接酶连接后转化DH5
α，涂板37度过夜
9.挑取阳性克隆大摇酶切验证，若结果正确，则载体构建完毕。

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本文部分内容来自网络整理，本司不为其真实性负责，如有异议或侵权请及时联系，本司将立即删除！== 本文为word格式，下载后可方便编辑和修改！ ==构建载体步骤篇一：载体构建的基本步骤1、摇菌（制作感受态细胞备用）取装有液体培养基的3ml试管两支（依情况而定），每管加40-100μl菌种，过夜摇。

2、提质粒（也就是载体）依照提质粒试剂盒中的说明书操作（根据情况最后一步洗脱时可以多洗1-2次）。

3、酶切（双酶切产生粘性末端）反应所需试剂体积（单位：ul）质粒10所需内切酶反应缓冲液 2所需限制性内切核酸酶 1H2O 7将加好的EP管置于37℃保温1-2h。

（依照提酶切的具体步骤操作；为了达到最佳酶切的效果，最好根据所选用的酶确定所需要的反应温度）4、电泳检测将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测酶切是否成功。

回收胶：琼脂糖与缓冲液一比一制胶，经过切胶回收目的产物，也有目的产物纯化的功能；检测胶：琼脂糖与缓冲液一比二制胶，为了检测目的条带与预期是否相符。

切胶回收与产物纯化是差不多的过程，所达到的目的是一样的：切胶回收也是一种纯化过程，它能去除非目的片段，然后用回收试剂盒进行纯化，能将很不纯的DNA溶液纯化；产物纯化是将较纯的DNA溶液进一步除去多余的杂质，用纯化试剂盒，你会发现纯化试剂盒和回收试剂盒的步骤几乎一样。

5、载体与目的基因连接如果电泳检测酶切成功的话，则仔细将所需的片段切割下来，将胶体回收（依照胶回收试剂盒说明书操作）；之后将回收的片段和载体连接。

置于温箱，12-16℃，保温8-16h6、转化（连接产物转化到感受态细胞中）依照转化具体操作步骤做感受态，将上述连接产物进行转化实验，涂板培养，37℃， 12-16h。

7、单克隆检测（1）挑单克隆先将AMP从冰箱中取出，待融化后，在3ml装有LB液体培养基的试管中加入3μL的 AMP，用枪头混匀；取1.5 mlEP管5支（依情况可以多挑几管），给每支管中加500μL上述培养液，然后用接种环（或黄枪头）挑单克隆，挑完后用枪吹打；之后，将挑好的菌摇4-5小时，至混浊即可。

载体构建技术基本流程

载体构建技术基本流程
载体构建的基本流程：
1.载体质粒的选择；
2.引物设计；
3.PCR扩增；
4.载体和⽬标⽚段的限制性酶切；
5.连接转化；
6.挑取克隆提质粒验证。

重要的是，我们要为⼤家提供了⼀个载体构建流程模板，构建载体时希望⼤家可以创建⼀个word⽂档，按照我们提供的模板，将载体构建过程记录下来，便于后续优化。

后续⽂章中我们将举例告诉⼤家如何使⽤这个模板。

P.S. 构建表达载体时可以先连接T载体，可把步骤（12）酶切⽚段换成连接T载体后再对T载体进⾏酶切。

连接T载体会多花⼀天时间，但是可以使载体构建流程更顺利。

连接T载体与连接⽬的载体⽅法⼗分类似，本次举例不再涉及。

如果想要通过连接T载体过渡，可以⽹上搜索T载体相关产品说明书，了解T载体和连接T载体的⽅法。

引物设计的内容我们将放在接下来的⼀篇推送⾥，正在构建载体的⼤家，先尝试使⽤我们的载体构建流程模板吧。

载体构建的基本步骤

载体构建的基本步骤Company Document number：WUUT-WUUY-WBBGB-BWYTT-1982GT载体构建一、原理依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。

二、操作步骤1、摇菌（制作感受态细胞备用）取装有液体培养基的3ml试管两支（依情况而定），每管加40-100μl菌种，过夜摇。

2、提质粒（也就是载体）依照提质粒试剂盒中的说明书操作（根据情况最后一步洗脱时可以多洗1-2次）。

3、酶切（双酶切产生粘性末端）反应所需试剂体积（单位：ul）质粒 10所需内切酶反应缓冲液 2所需限制性内切核酸酶 1H2O 7将加好的EP管置于37℃保温1-2h。

（依照提酶切的具体步骤操作；为了达到最佳酶切的效果，最好根据所选用的酶确定所需要的反应温度）4、电泳检测将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测酶切是否成功。

回收胶：琼脂糖与缓冲液一比一制胶，经过切胶回收目的产物，也有目的产物纯化的功能；检测胶：琼脂糖与缓冲液一比二制胶，为了检测目的条带与预期是否相符。

切胶回收与产物纯化是差不多的过程，所达到的目的是一样的：切胶回收也是一种纯化过程，它能去除非目的片段，然后用回收试剂盒进行纯化，能将很不纯的DNA溶液纯化；产物纯化是将较纯的DNA溶液进一步除去多余的杂质，用纯化试剂盒，你会发现纯化试剂盒和回收试剂盒的步骤几乎一样。

5、载体与目的基因连接如果电泳检测酶切成功的话，则仔细将所需的片段切割下来，将胶体回收（依照胶回收试剂盒说明书操作）；之后将回收的片段和载体连接。

置于温箱，12-16℃，保温8-16h6、转化（连接产物转化到感受态细胞中）依照转化具体操作步骤做感受态，将上述连接产物进行转化实验，涂板培养，37℃，12-16h。

7、单克隆检测（1）挑单克隆先将AMP从冰箱中取出，待融化后，在3ml装有LB液体培养基的试管中加入3μL的AMP，用枪头混匀；取 mlEP管5支（依情况可以多挑几管），给每支管中加500μL上述培养液，然后用接种环（或黄枪头）挑单克隆，挑完后用枪吹打；之后，将挑好的菌摇4-5小时，至混浊即可。

载体构建的基本步骤

载体构建的基本步骤载体构建是分子生物学研究中不可或缺的过程，它涉及到将目标基因或蛋白质序列移植到不同的载体中，以便扩大其表达量、纯化和研究。

本文将介绍载体构建的基本步骤，包括质粒的选择、PCR扩增、连接和转化等过程。

质粒的选择质粒是最常用的载体类型之一，具有很多优点，如易于扩增、转化和操纵等。

在选择质粒时，需要考虑以下几个方面：1. 质粒大小和拷贝数质粒的大小和拷贝数会影响其扩增和表达，选择适当大小和拷贝数的质粒可以提高表达效率。

2. 基因水平选择标记质粒中常含有基因水平选择标记，如抗生素耐药基因等。

在构建载体时需要选择合适的标记，以便快速筛选到表达了目标基因的细胞。

3. 表达宿主质粒可以在不同的宿主中表达，选择合适的表达宿主可以提高表达效率和纯度。

常见的表达宿主包括大肠杆菌、酵母等。

PCR扩增PCR扩增是将目标序列扩增为质粒中适当长度的过程。

在进行PCR扩增之前，需要准备以下试剂和设备：•Taq DNA聚合酶•原始模板DNA•引物•正向引物和反向引物•dNTP混合物•PCR缓冲溶液在PCR扩增中，需要设置合适的反应体系和程序。

常见的PCR反应条件为：•94℃，5 min：初始变性•94℃，30 s：变性•50-60℃，30 s：退火•72℃，1 min/kb：延伸•72℃，7 min：最终延伸连接连接是将PCR扩增产物与质粒DNA连接的过程。

连接反应需要用到T4 DNA连接酶和DNA PCR产品凝胶提取试剂盒等试剂，具体操作步骤如下：1.将PCR扩增产物切割至合适长度。

2.提取PCR产物，并使用DNA PCR产品凝胶提取试剂盒纯化。

3.连接酶在37℃下反应数小时。

4.连接反应后，在大肠杆菌中进行转化。

转化转化是将连接成功的PCR产物转化为大肠杆菌的过程。

转化需要用到大肠杆菌、新鲜的LB培养基和适当的抗生素等试剂。

常见的转化条件为：80-90秒高温热冲击，加入细胞后在37℃，250rpm振荡培养1小时后添加适宜浓度的抗生素进行筛选。

构建克隆载体步骤

构建克隆载体步骤构建克隆载体主要有以下步骤：一、基本动作要领1. 目的基因的获取- 首先，如果是从基因组DNA中获取目的基因，咱们就得先提取基因组DNA。

就像摘果子得先找到果树一样，这里提取基因组DNA的方法有很多，像酚- 氯仿抽提法就比较经典。

提取的时候，一定要保证样本的新鲜度。

我之前就做错过，用了放置很久的样本，结果提取出来的DNA 质量特别差。

如果是从mRNA经反转录得到cDNA再获取目的基因的话，就要注意mRNA的质量了。

要使用质量好的逆转录酶，这就好比建房子得用好的砖头，mRNA就是建基因这座“房子”的砖头。

2. 载体的选择- 载体就像是一辆“车”，用来搭载我们的目的基因。

常见的载体有质粒、噬菌体、病毒等。

如果是简单的在细菌里克隆，一般就选质粒载体。

要根据自己的实验需求来选，比如要有合适的筛选标记，像抗药性基因之类的，这样才能方便后续筛选出带有重组载体的细胞。

3. 目的基因和载体的酶切- 这是很关键的一步，要选择合适的限制性内切酶。

就像开锁得用对钥匙一样，酶切位点必须是载体和目的基因上都有的，而且要在合适的反应体系里进行。

酶切反应的缓冲液、温度、反应时间都得严格控制。

我试过好多次，温度稍微不对，酶切就不完全。

反应体系里的底物浓度也要合适，别加太多或者太少的DNA，就像做菜加盐一样，得适量。

- 给大家简单画个示意图来理解一下。

就好比长条形的目的基因和环状的载体，用内切酶在特定的位置“咔嚓”一刀，这样就产生了可以连接的黏性末端或者平末端。

二、个人小技巧1. 在酶切之前，可以先做个小的预实验。

就像试水温一样，看看用什么浓度的酶、多长的反应时间是最合适的。

对了这里可以把目的基因和载体分别做预酶切，这样如果有问题就可以很快定位是哪一个的问题。

2. 在选择内切酶的时候，尽量选择产生不同黏性末端的酶，这样在连接的时候特异性会更好。

这就好比把两个不同形状的拼图碎片拼在一起，不容易拼错。

三、容易忽视的细节1. 酶切完后一定要进行凝胶电泳来检验酶切产物是否正确。

原核表达载体构建步骤

原核表达载体构建步骤一、前期准备1. 首先呢，咱们得把要用的材料都找齐喽。

像目的基因啦，原核表达载体还有各种酶，比如说限制性内切酶之类的。

这一步看起来简单，可千万别小瞧它哦！要是少了啥，后面就麻烦了。

我就有次忘记检查有没有足够的载体，结果做到一半才发现，那叫一个懊恼啊！2. 对了，关于目的基因，你得确定它的序列是正确的。

这一点真的很重要，真的！我通常会再检查一次，毕竟如果基因序列错了，后面做的可能都是白搭。

你是不是也担心这个问题呢？二、载体和目的基因的处理1. 接下来就要处理原核表达载体和目的基因了。

先用限制性内切酶去切割载体和目的基因。

这个过程得小心点儿哦！酶切的条件要设置好，像温度呀、反应时间啥的。

我一般会按照说明书上的推荐值来设置，不过有时候也会根据实际情况微调一下。

这一步其实还蛮关键的，如果酶切不完全，后面连接的时候就容易出岔子。

2. 酶切完之后呢，要对产物进行纯化。

这个纯化的步骤你可以根据自己实验室现有的设备和试剂来选择合适的方法。

我觉得只要能把想要的东西纯出来就行啦，不用太纠结具体用哪种方法。

三、连接反应2. 在这个连接反应进行的时候，要注意反应的环境。

温度要保持稳定，最好放在专门的恒温设备里。

不然的话，连接反应可能就不能很好地进行啦。

这一点大家一定要注意哦！四、转化1. 连接产物弄好之后，就可以进行转化了。

把连接产物导入到感受态细胞里面。

这个感受态细胞的制备也是个重要的事儿。

不过如果你不想自己制备的话，也可以买现成的。

导入的时候呢，要按照操作规程来，可不能马虎。

我记得我刚开始做的时候，就因为没严格按照步骤来，转化效率特别低，那个时候真是欲哭无泪啊。

2. 转化完了之后，要把细胞放到合适的培养基里面培养。

这个培养基的选择也要看你的细胞类型和实验需求哦。

在培养的过程中，要注意观察细胞的生长状态。

如果发现有什么异常，就得想想是不是前面哪个步骤出问题了。

五、筛选阳性克隆1. 等细胞长起来之后，就要开始筛选阳性克隆了。

载体构建流程

载体构建流程载体构建SOP流程:GenBank查询⽬的基因序列→根据ORF序列利⽤引物设计软件设计引物→表达⽬的基因的组织或细胞总RNA提取→RT-PCR获取⽬的基因→酶切⽬的基因和载体→分别纯化酶切的⽬的基因和载体并建⽴连接反应→转化→初步筛选阳性克隆→阳性克隆测序→测序正确的质粒保种并重提质粒I.获取⽬的基因/序列⽚段⼀.获取序列信息通过GENBANK数据和⽣物信息的⽅法设计⽬的基因或⽬的⽚段引物（shRNA、miRNA）。

PCR引物的设计原则：①引物应⽤核酸系列保守区内设计并具有特异性。

②产物不能形成⼆级结构。

③引物长度⼀般在15~30碱基之间。

④G+C含量在40%~60%之间。

⑤碱基要随机分布。

⑥引物⾃⾝不能有连续4个碱基的互补。

⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。

⑧引物5′端可以修饰。

⑨引物3′端不可修饰。

⑩避免在引物的3’端使⽤碱基A。

在实际设计引物中由于ORF两末端序列本⾝的限制，不能完全按照上述理想的设计原则，但也切记引物不能过长或过短。

过长的引物不容易打开其⼆级结构，与模板结合缓慢，也容易形成引物⼆聚体，通常不超过35bp(不包括酶切位点和保护碱基)。

过短的引物特异性差，扩出其它不相关⽚段，最终很难得到⽬的⽚段，通常不短于18bp(不包括酶切位点和保护碱基)。

要将⽬的基因定向克隆⾄相应载体，需要在上下游引物两端设计不同的酶切位点，由于酶切位点位于线性末端时酶对其识别切割能⼒⼤⼤降低，需依据NEB⽬录添加相应保护碱基，酶切时可相应增加时间。

⼆.制备模板1.分离⾼质量RNA：成功的cDNA合成来⾃⾼质量的RNA。

⾼质量的RNA⾄少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂，如EDTA或SDS。

RNA的质量决定了能够转录到cDNA上的序列信息量的最⼤值。

现在实验室通常使⽤Trizol试剂法提取总RNA，可以从多种组织和细胞中提取⾼质量的⾮降解RNA。

Trizol试剂法可以从最少100个细胞或1mg组织中提取RNA。

载体构建步骤

一．载体酶切线性化（TOYOBO EcoR I）1.载体pCDNA浓度0.8 ug/ul2.酶切体系（总50ul体系）pCDNA 3ul10*H Buffer 5ulddH2O 41ulEcoR I 1ul（8U/ul）3.反应条件37°C 1h 至多2h*已经试过37°C过夜，本以为会酶切充分，但是不想把条带全切成小片段了，而且电泳后是一条宽宽的泳谱*另外，多次酶切证实，所加的酶量过多在酶切一小时的情况下仍然会出现酶切过度的情况，尽可能按照说明书上的量和时间做二．取2ul稀释成5ul于1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定有无条带及大小用大凝胶回收pcDNA（按2.5：1加入SYBR Green）电泳30min准备两支EPPendorf管，调60°C水浴锅切胶称重（1.5ml EPPendorf管重约0.82g）三．OMEGA gel purification kit回收pcDNA1.平衡柱子加200ulBuffer GPS到DNA收集柱中，静置4min，12000xg*2min，加700ulDEPC处理H2O，12000xg*2min2.溶胶按1ml/kg的比例加Binding Buffer到凝胶中3.60°C水浴7mins，迅速转移至DNA收集柱中（至多700ul，超过的再转移一次），10000xg*1min，弃收集管中的液体4.加300ulBinding Buffer，10000xg*1min，弃收集管中的液体5.加700ulwash Buffer，10000xg*1min，弃收集管中的液体6.加350ulwash Buffer，10000xg*1min，弃收集管中的液体7.最大转速（>13000rpm）空转2min，弃收集管8.转移收集柱至1.5mlEPPendorf管，打开盖子静置2min9.加30ulElution Buffer静置2min，最大转速1.5min，弃收集柱10.取2ul稀释成5ul点胶*所加Elution Buffer的量是根据所纯化的产物的量来判断的，如果回收产物较多可以增加其量至50ul*纯化的理论效率为70%，如果先加一次Elution Buffer 20ul，静置2min，1000xg*1min,然后再加一次Elution Buffer20ul，静置离心。

载体构建的基本流程

载体构建的基本流程载体构建的基本流程主要包括设计方案确定、材料准备、工艺加工和性能测试四个基本环节。

首先，设计方案确定是载体构建的第一步，也是最为关键的一步。

在这个阶段，我们需要明确载体的功能要求、外形尺寸、结构布局等设计参数，然后进行方案设计和优化，最终确定最佳的设计方案。

设计方案的确定需要充分考虑载体的使用环境、工作条件、使用寿命等因素，确保设计方案的科学合理性和可行性。

接下来是材料准备环节，这一步是实现设计方案的关键环节。

根据设计方案确定的材料要求，我们需要选择合适的材料，并进行采购和准备工作。

在材料选择方面，需要考虑材料的力学性能、耐磨性、耐腐蚀性、导热性、导电性等多个方面的要求，确保选择的材料符合设计要求。

在材料准备工作中，还需要对材料进行切割、成型、加工等工艺处理，以满足设计方案的要求。

随后是工艺加工环节，这一步是将设计方案和准备好的材料转化为具体载体的关键环节。

在这个阶段，我们需要进行组装、焊接、切割、打磨、涂装等一系列工艺加工工序，将材料加工成符合设计要求的零部件，并进行组装装配，最终形成完整的载体。

工艺加工环节需要严格按照设计要求和工艺规程进行操作，确保加工质量和工艺精度。

最后是性能测试环节，这一步是验证载体构建结果的关键环节。

在这个阶段，我们需要对构建好的载体进行功能测试、性能测试、可靠性测试等一系列测试工作，确保构建的载体能够满足设计要求和使用要求。

在测试过程中，需要对载体的各项性能指标进行全面检测和评估，发现问题及时进行调整和改进，最终确保构建的载体达到预期的使用效果。

总的来说，载体构建的基本流程包括设计方案确定、材料准备、工艺加工和性能测试四个基本环节。

在实际的载体构建过程中，需要严格按照这个基本流程进行操作，确保构建的载体能够满足设计要求和使用要求。

同时，也需要不断改进和优化载体构建的技术方法和工艺流程，提高构建质量和效率，推动载体构建技术的发展和应用。

rnai载体构建的基本流程

rnai载体构建的基本流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。

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载体构建的基本步骤

4、电泳检测
将酶切产品举止琼脂糖凝胶电泳，检测酶切是可乐成.
回支胶：琼脂糖与慢冲液一比一造胶，通过切胶回支手段产品，也有手段产品杂化的功能；
检测胶：琼脂糖与慢冲液一比二造胶，为了检测手段条戴与预期是可相符.
切胶回支与产品杂化是好已几的历程，所达到的手段是一般的：切胶回支也是一种杂化历程，它能去除非手段片段，而后用回支试剂盒举止杂化，能将很没有杂的DNA溶液杂化；产品杂化是将较杂的DNA溶液进一步与消多余的杂量，用杂化试剂盒，您会创造杂化试剂盒战回支试剂盒的步调险些一般.
5、载体与手段基果连交
如果电泳检测酶切乐成的话，则小心将所需的片段切割下去，将胶体回支（依照胶回支试剂盒证明书籍支配）；之后将回支的片段战载体连交.置于温箱，12-16℃，保温8-16h
6、转移（连交产品转移到体验态细胞中）
依照转移简直支配步调干体验态，将上述连交产品举止转移真验，涂板培植，37℃，
（2）单克隆检测
以每管摇好的菌液为模板，以本有的引物举止PCR，而后将PCR产品跑电泳，瞅察电泳图像中那几管的条戴粗确，将粗确条戴相对于应管的菌液再抽与100μL，加到3ml（有LB液体培植液，AMP+）试管中，过夜摇；第二天沉摇，将摇好的菌与1ml于1.5mlEP管中支测序，并保种.
注：①挑单克隆时，一定要挑简单圆润的菌降，有卫星斑的没有挑.
载体建立之阳早格格创做
一、本理
依好于节造性核酸内切酶，DNA连交酶战其余建饰酶的效率，分别对于手段基果战载体DNA举止适合切割战建饰后，将二者连交正在所有，再导进宿主细胞，真止手段基果正在宿主细胞内的粗确表白.
二、支配步调
1、摇菌（创造体验态细胞备用）
与拆有液体培植基的3ml试管二支（依情况而定），每管加40-100μl菌种，过夜摇.

载体构建程序

载体构建一般程序1、提取拟南芥叶片DNA2、设计引物3、获得目的基因片段4、特定的限制性内切酶酶切5、基因片段连接入质粒6、连接产物转化进感受态细胞中7、摇菌，PCR检测插入基因8、测序各步的具体内容：1、提取拟南芥叶片DNA：Mini-scale genomic DNA extraction from Arabidopsisleaves，野生型拟南芥的叶片的DNA。

2、设计引物：对于用于普通的PCR的基因的引物设计，要符合以下几个条件：（1）引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。

（2）产物不能形成二级结构。

（3）引物长度一般在15~30碱基之间。

（4）G+C含量在40%~60%之间。

（5）碱基要随机分布。

（6）引物自身不能有连续4个碱基的互补。

（7）引物之间不能有连续4个碱基的互补。

（8）引物5′端可以修饰。

（9）引物3′端不可修饰。

（10）引物3′端要避开密码子的第3位。

如果要用于酶切的基因，除了满足以上的条件外，首先需选择合适的限制性内切酶，需要满足：（1）所要连接的质粒上有该酶切单克隆位点；（2）目的基因中没有该酶切位点；（3）在基因本身的引物5’端加上所选酶切位点识别碱基序列；（4）根据情况在引物5’端或3’端加上保护碱基，一般只在5’端加保护碱基就行了。

3、获得目的基因：使用高保真酶Prime STAR HS DNA Polymerase,以提取的WTDNA为模板做PCR，获得所需目的基因片段。

反应体系：5*prime STAR Buffer (Mg2+ plus) 10uldNTP Mixture (各2.5mM) 4ul引物1（10uM）1ul引物2（10uM）1ul模板DNA（WT）2ulPrime STAR HS DNA Polymerase（2.5u/ul）0.5ul灭菌水up to 50ul (31.5ul)反应程序：94℃4min;98℃20s;55℃30s;35 cycles72℃70s;72℃10min;12℃-----PCR反应结束后取所有反应液进行琼脂糖凝胶电泳，之后进行胶回收。

载体构建操作流程

载体构建操作流程载体构建操作流程一、载体准备1、质粒准备电泳检测载体质量好的质粒为三条带，分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）；也有观点认为是质粒两条链没有断裂的超螺旋结构，开环DNA和线性DNA。

超螺旋结构应至少占到90%。

测定质粒浓度用核酸定量仪测定质粒的浓度，A230、A260和A280值。

2、质粒双酶切根据需要的酶切位点，选择对应的酶，查找适合的Buffer，进行单酶切。

以TaKaRa的限制酶为例，双酶切的体系如下：试剂体积质粒<1 μgEnzyme I 1μLEnzyme II 1μL10×X Buffer 2μL灭菌水to 20μL总体积20μL将上述体系置于37℃（不同酶可能存在差异）水浴锅中酶切。

根据酶切效率不同确定酶切时间，可以去除2 μl进行电泳检测。

3、回收质粒凝胶回收参照TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0试剂盒说明书。

1)称量胶块重量，计算胶块体积。

计算胶块体积时，以1mg=1μl进行计向胶块中加入胶块融化液Buffer GM，我们一般用1%的琼脂糖凝胶电泳，所以一般加入3个凝胶体积量。

2)均匀混合后室温15-25℃融化胶块。

此时应间断振荡混合，使胶块充分融化（约5～10分钟）。

3)将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。

将上述操作的溶液转移至Spin Column 中，12,000 rpm离心1分钟，弃滤液。

滤液再加入Spin Column中离心一次，可以提高DNA的回收率。

4)将700μl的Buffer WB加入Spin Column中，室温12,000 rpm离心30秒钟，弃滤液。

5)重复操作步骤。

6)将Spin Column安置于Collection Tube上，室温12,000 rpm 离心1分钟。

7)将Spin Column安置于新的1.5ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入30μl的灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置1分钟。

载体构建的基本步骤

载体构建的基本步骤集团文件发布号：（9816-UATWW-MWUB-WUNN-INNUL-DQQTY-载体构建一、原理依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。

二、操作步骤1、摇菌（制作感受态细胞备用）取装有液体培养基的3ml试管两支（依情况而定），每管加40-100μl菌种，过夜摇。

2、提质粒（也就是载体）依照提质粒试剂盒中的说明书操作（根据情况最后一步洗脱时可以多洗1-2次）。

3、酶切（双酶切产生粘性末端）反应所需试剂体积（单位：ul）质粒 10所需内切酶反应缓冲液 2所需限制性内切核酸酶 1O 7H2将加好的EP管置于37℃保温1-2h。

（依照提酶切的具体步骤操作；为了达到最佳酶切的效果，最好根据所选用的酶确定所需要的反应温度）4、电泳检测将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测酶切是否成功。

回收胶：琼脂糖与缓冲液一比一制胶，经过切胶回收目的产物，也有目的产物纯化的功能；检测胶：琼脂糖与缓冲液一比二制胶，为了检测目的条带与预期是否相符。

切胶回收与产物纯化是差不多的过程，所达到的目的是一样的：切胶回收也是一种纯化过程，它能去除非目的片段，然后用回收试剂盒进行纯化，能将很不纯的DNA溶液纯化；产物纯化是将较纯的DNA溶液进一步除去多余的杂质，用纯化试剂盒，你会发现纯化试剂盒和回收试剂盒的步骤几乎一样。

5、载体与目的基因连接如果电泳检测酶切成功的话，则仔细将所需的片段切割下来，将胶体回收（依照胶回收试剂盒说明书操作）；之后将回收的片段和载体连接。

置于温箱，12-16℃，保温8-16h6、转化（连接产物转化到感受态细胞中）依照转化具体操作步骤做感受态，将上述连接产物进行转化实验，涂板培养，37℃，12-16h。

7、单克隆检测（1）挑单克隆先将AMP从冰箱中取出，待融化后，在3ml装有LB液体培养基的试管中加入3μL的AMP，用枪头混匀；取1.5 mlEP管5支（依情况可以多挑几管），给每支管中加500μL上述培养液，然后用接种环（或黄枪头）挑单克隆，挑完后用枪吹打；之后，将挑好的菌摇4-5小时，至混浊即可。

载体构建——精选推荐

载体构建载体构建分为以下步骤：1.载体的选择和引物设计以扩增⽬标基因2.⽬标⽚段的PCR扩增3.载体和⽬标⽚段的限制性酶切4.连接转化5.挑取克隆提质粒6.单克隆的验证及送样测序。

载体的选择实验室常⽤的载体有pUC19（扩繁⽬标⽚段），pet28a（原核表达载体Kna+），pGEX-4T-1(原核表达载体Amp+)，pCI-NEO(真核表达载体Amp+)，pCDNA3.1(真核表达载体Amp+)，pLKO.1(shRNA构建Amp+)。

根据所要构建的质粒⽬的的差异以及载体和⽬标⽚段的酶切位点分析结果来选择载体。

举例如下：实验⽬的是将MYC基因插⼊到载体中，转染进细胞中表达。

应选⽤真核表达载体pCI-NEO 或pCDNA3.1。

引物设计引物设计的⽬的是将⽬标⽚段扩增出来以便与载体连接，所以在引物的两端应⼈为加上酶切位点，酶切位点前加上保护碱基。

在选择酶切位点是应注意，选择的应该是⽬的基因⽚段中没有⽽载体上有的限制性内切酶，防⽌⽬标⽚段被切不完整，也便于和载体连接。

载体构建之后我们的⽬的是要表达，所以应该加⼊标签以便western blot检测蛋⽩是否表达。

常⽤的标签有Flag标签、6XHis 标签、HA标签和Myc标签。

Flag标签：D Y K D D D D KGAT TAC AAG GAT GAC GAC GAT AAG6XHis标签：H H H H H HCAC CAC CAC CAC CAC CACHA标签：Y P Y D V P D Y ATAC CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC GCTMyc标签：E Q K L I S E E D L这些标签被表达成氨基酸后，特定的氨基酸序列会与相应抗体结合，在western blot时可被检测。

因此，在设计引物时，这些核酸序列应位于起始密码⼦ATG之后。

翻译是从mRNA的5‘端开始，⽽蛋⽩质合成是从N端到C端，所以若要把标签加在N端，标签所对应的核苷酸序列应位于ATG 之后，若是加在C端，则应该将标签所对应的核苷酸序列置于终⽌密码⼦TAA之前。