构建表达载体的实验流程及其注意事项201412
表达载体的构建
中国海洋大学 科学馆319 （4）设原始质粒为对照，意为检测整个操作过程中是否有误。
谢 谢
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1. 尽可能除去无关的DNA序列 从而增加载体容量。 2. 选择表达载体时，要根据所表达蛋白的最终应用考虑。如为方 便纯化，可选择融合表达；如为获得天然蛋白，可选择非融合 表达，融合表达时在选择外源DNA同载体分子连接反应时，对 转录和转译过程中密码结构的阅读不能发生干扰。 3. 选择的酶切位点在靶基因上没有相应的酶切序列，否则在构建 重组子进行酶切时会把靶基因给切开。 4. 在惠赠或交换的质粒中确定MCS的正确性，否则会造成错读密 码子
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二 构建表达载体的基本步骤
引物设计
目的基因(CDS区）的克隆
目的基因进行酶切
质粒进行酶切线性化，电泳，胶回收纯化
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模板与线性化质粒连接
转化到大肠杆菌DH5α
鉴 定（PCR,测序,酶切）
将表达载体导入表达菌株
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三 载体构建具体范例：
大菱鲆GHR基因构建入pEGFP载体中
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1. GHR从大菱鲆cDNA模板中扩增
5‘非翻译区
CDS区 内引物
3‘非翻译区
初次PCR引物设计（外引物）
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2. 分析酶切GHR基因酶切位点
将GHR基因mRNA序列的CDS区（蛋白编码区）导入
DNAMAN 软件中，进行酶切位点分析：
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3. 引物的设计
表达载体的构建方法及步骤
表达载体的构建方法及步骤一、载体的选择及如何阅读质粒图谱目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA 是一种新的非病毒转基因载体。
一个合格质粒的组成要素：（1）复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。
原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。
而真核生物DNA 分子有多个复制起始位点。
（2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+（3）多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段（4）P/E 启动子/增强子（5）Terms 终止信号（6）加poly（A）信号可以起到稳定mRNA 作用选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。
如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。
载体选择主要考虑下述3点：【1】构建DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。
【2】.载体的类型：（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。
如<10kb 选质粒。
（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。
（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。
【3】载体MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。
综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求：（1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体）；（2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。
（3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；（4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（试一试）。
（5）满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。
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本文部分内容来自网络整理，本司不为其真实性负责，如有异议或侵权请及时联系，本司将立即删除！== 本文为word格式，下载后可方便编辑和修改！ ==构建载体步骤篇一：载体构建的基本步骤1、摇菌（制作感受态细胞备用）取装有液体培养基的3ml试管两支（依情况而定），每管加40-100μl菌种，过夜摇。
2、提质粒（也就是载体）依照提质粒试剂盒中的说明书操作（根据情况最后一步洗脱时可以多洗1-2次）。
3、酶切（双酶切产生粘性末端）反应所需试剂体积（单位：ul）质粒10所需内切酶反应缓冲液 2所需限制性内切核酸酶 1H2O 7将加好的EP管置于37℃保温1-2h。
（依照提酶切的具体步骤操作；为了达到最佳酶切的效果，最好根据所选用的酶确定所需要的反应温度）4、电泳检测将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测酶切是否成功。
回收胶：琼脂糖与缓冲液一比一制胶，经过切胶回收目的产物，也有目的产物纯化的功能；检测胶：琼脂糖与缓冲液一比二制胶，为了检测目的条带与预期是否相符。
切胶回收与产物纯化是差不多的过程，所达到的目的是一样的：切胶回收也是一种纯化过程，它能去除非目的片段，然后用回收试剂盒进行纯化，能将很不纯的DNA溶液纯化；产物纯化是将较纯的DNA溶液进一步除去多余的杂质，用纯化试剂盒，你会发现纯化试剂盒和回收试剂盒的步骤几乎一样。
5、载体与目的基因连接如果电泳检测酶切成功的话，则仔细将所需的片段切割下来，将胶体回收（依照胶回收试剂盒说明书操作）；之后将回收的片段和载体连接。
置于温箱，12-16℃，保温8-16h6、转化（连接产物转化到感受态细胞中）依照转化具体操作步骤做感受态，将上述连接产物进行转化实验，涂板培养，37℃， 12-16h。
7、单克隆检测（1）挑单克隆先将AMP从冰箱中取出，待融化后，在3ml装有LB液体培养基的试管中加入3μL的 AMP，用枪头混匀；取1.5 mlEP管5支（依情况可以多挑几管），给每支管中加500μL上述培养液，然后用接种环（或黄枪头）挑单克隆，挑完后用枪吹打；之后，将挑好的菌摇4-5小时，至混浊即可。
表达载体的构建注意事项
表达载体的构建注意事项构建载体是一项重要的任务，它决定了信息传递的质量和效果。
在进行载体构建时，我们需要注意以下几点：1. 独特性：确保文章内容的独一性，避免内容重复出现。
这样可以让读者获得新鲜感，并更好地吸引他们的注意力。
2. 结构合理：为了增强阅读流畅性，我们需要合理安排文章的结构。
可以使用适当的标题来划分段落，使内容更加清晰明了。
3. 避免网络地址：在文章中不得插入任何网络地址，以确保文章的纯文本性质。
这样可以避免读者在阅读过程中被打断或分心。
4. 避免数学公式和计算公式：文章中不应包含数学公式或计算公式。
这些公式对于非专业读者来说可能会造成困扰，降低文章的可读性。
5. 避免使用图片链接：不得使用、插入任何形式的图片链接。
这样可以避免读者在阅读过程中需要打开链接或依赖图像来理解文章的内容。
6. 避免依赖图像的语句：避免使用依赖图像的语句，如“如图所示”等字眼。
这样可以避免读者对文章内容的误解或困惑。
7. 避免重复问题：不得在文章中反复提出同一个问题。
这样可以避免读者产生厌烦或对文章内容产生疑惑。
8. 简洁自然：文章应该尽量简洁自然，避免过多的自我介绍。
这样可以让读者更加专注于文章的主题和内容。
9. 流畅表达：文章应刻画明确，句式流畅，并使用丰富多样的词汇来表达。
这样可以增加文章的可读性和吸引力。
10. 中文描述：请尽可能使用准确的中文进行描述，避免使用拗口或错误的词汇和表达方式。
11. 准确无误：确保文章内容的准确无误，严肃认真。
避免使用歧义或误导的信息，以免给读者带来困惑或误解。
通过以上注意事项，我们可以以人类的视角来构建载体，使文章富有情感，并使读者感到仿佛是真人在叙述。
同时，我们也要确保文章的自然度和流畅度，避免让读者感觉像机器生成的内容。
这样可以提高文章的质量和吸引力，让读者更加愿意阅读和理解。
表达载体的构建方法及步骤
表达载体的构建方法及步骤一、载体的选择及如何阅读质粒图谱目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒 DNA 是一种新的非病毒转基因载体。
一个合格质粒的组成要素：（1）复制起始位点 Ori 即控制复制起始的位点。
原核生物 DNA 分子中只有一个复制起始点。
而真核生物 DNA 分子有多个复制起始位点。
（2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如 Amp+ ,Kan+（3）多克隆位点 MCS 克隆携带外源基因片段（4） P/E 启动子/增强子（5）Terms 终止信号（6）加 poly（A）信号可以起到稳定 mRNA 作用选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。
如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。
载体选择主要考虑下述3点：【1】构建 DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。
【2】.载体的类型：（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。
如<10kb 选质粒。
（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，哺乳类细胞表达载体。
（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。
【3】载体 MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。
综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求：（1）选分子量小的质粒，即小载体（1－）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体）；（2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般 10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。
（3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；（4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位 Ampr（试一试）。
（5）满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。
基因表达载体的构建操作流程
基因表达载体的构建操作流程一、了解基因表达载体。
基因表达载体就像是一个小货车，它要把我们感兴趣的基因（就好比是货物）运到细胞这个大工厂里，然后让基因在里面表达出我们想要的东西。
这个载体得有一些特定的部件。
比如说启动子，这就像是货车的发动机，启动整个表达过程。
还有终止子呢，就像是刹车，告诉基因什么时候停止表达。
另外，标记基因也很重要，它就像是货车上的独特标志，方便我们在细胞里找到这个载体是不是成功进去工作了。
二、获取目的基因。
那我们怎么得到想要的目的基因呢？这里有好多办法。
有一种是从基因文库里面找，基因文库就像是一个超级大的基因超市，里面各种各样的基因都有。
我们可以像在超市里找东西一样，用一些特殊的方法把我们要的基因挑出来。
还有一种方法是通过反转录法，如果我们知道这个基因表达出来的RNA长啥样，就能通过反转录把它变成DNA，也就是我们要的目的基因啦。
另外，化学合成法也能用，不过这个比较适合那些比较小的基因片段哦。
三、构建基因表达载体。
当我们有了目的基因，就要开始构建载体啦。
这就像是给我们的货物装到货车上的过程。
我们要把目的基因和载体用同一种限制性核酸内切酶来处理，这种酶就像是一把特殊的剪刀，它能在特定的位置把基因和载体都剪开，而且剪出来的口子是可以互相配对的。
然后呢，再用DNA连接酶把目的基因和载体连接起来，这个酶就像是胶水，把它们粘得牢牢的。
这样，我们的基因表达载体就初步构建好啦。
四、导入受体细胞。
构建好的载体得送到受体细胞里去才能发挥作用。
根据受体细胞的不同，导入的方法也不一样呢。
如果是细菌这样的细胞，我们可以用转化的方法，就像是偷偷地把东西送进去一样。
要是植物细胞的话，农杆菌转化法就比较常用啦，农杆菌就像是一个小邮差，把我们的载体送到植物细胞里面。
动物细胞的话，显微注射法是一种选择，就像是用一个超级小的注射器把载体注射到细胞里。
五、检测与鉴定。
载体送进去了，我们得看看它有没有成功呀。
首先就是检测目的基因是不是真的到了受体细胞里面。
表达载体的构建方法及步骤
表达载体的构建方法及步骤一、载体的选择及如何阅读质粒图谱目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA 是一种新的非病毒转基因载体。
一个合格质粒的组成要素：（1）复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。
原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。
而真核生物DNA 分子有多个复制起始位点。
（2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+（3）多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段（4）P/E 启动子/增强子（5）Terms 终止信号（6）加poly（A）信号可以起到稳定mRNA 作用选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。
如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。
载体选择主要考虑下述3点：【1】构建DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。
【2】.载体的类型：（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。
如<10kb 选质粒。
（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。
（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。
【3】载体MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于，不能产生阅读框架错位。
综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求：（1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体）；（2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。
（3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；（4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（试一试）。
（5）满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。
原核表达载体构建步骤
原核表达载体构建步骤一、前期准备1. 首先呢，咱们得把要用的材料都找齐喽。
像目的基因啦，原核表达载体还有各种酶，比如说限制性内切酶之类的。
这一步看起来简单，可千万别小瞧它哦！要是少了啥，后面就麻烦了。
我就有次忘记检查有没有足够的载体，结果做到一半才发现，那叫一个懊恼啊！2. 对了，关于目的基因，你得确定它的序列是正确的。
这一点真的很重要，真的！我通常会再检查一次，毕竟如果基因序列错了，后面做的可能都是白搭。
你是不是也担心这个问题呢？二、载体和目的基因的处理1. 接下来就要处理原核表达载体和目的基因了。
先用限制性内切酶去切割载体和目的基因。
这个过程得小心点儿哦！酶切的条件要设置好，像温度呀、反应时间啥的。
我一般会按照说明书上的推荐值来设置，不过有时候也会根据实际情况微调一下。
这一步其实还蛮关键的，如果酶切不完全，后面连接的时候就容易出岔子。
2. 酶切完之后呢，要对产物进行纯化。
这个纯化的步骤你可以根据自己实验室现有的设备和试剂来选择合适的方法。
我觉得只要能把想要的东西纯出来就行啦，不用太纠结具体用哪种方法。
三、连接反应2. 在这个连接反应进行的时候，要注意反应的环境。
温度要保持稳定，最好放在专门的恒温设备里。
不然的话，连接反应可能就不能很好地进行啦。
这一点大家一定要注意哦！四、转化1. 连接产物弄好之后，就可以进行转化了。
把连接产物导入到感受态细胞里面。
这个感受态细胞的制备也是个重要的事儿。
不过如果你不想自己制备的话，也可以买现成的。
导入的时候呢，要按照操作规程来，可不能马虎。
我记得我刚开始做的时候，就因为没严格按照步骤来，转化效率特别低，那个时候真是欲哭无泪啊。
2. 转化完了之后，要把细胞放到合适的培养基里面培养。
这个培养基的选择也要看你的细胞类型和实验需求哦。
在培养的过程中，要注意观察细胞的生长状态。
如果发现有什么异常，就得想想是不是前面哪个步骤出问题了。
五、筛选阳性克隆1. 等细胞长起来之后，就要开始筛选阳性克隆了。
目的蛋白表达载体的构建
目的蛋白表达载体的构建
目的蛋白表达载体的构建一般分为以下几个步骤：
1. 选择合适的载体：根据需要表达的蛋白的种类、大小、糖基化等特征，选取适合的表达载体。
2. 构建重组质粒：将目的基因克隆进表达载体，常见的方法包括限制性内切酶切割、PCR扩增、基因合成等。
3. 序列验证：通过测序验证所构建重组质粒中的目的基因是否正确克隆。
4. 细胞转染：将构建好的重组质粒转染到表达宿主细胞中，如CHO、HEK293等。
5. 筛选高表达细胞株：通过荧光筛选、Western blotting等方法，筛选出表达目的蛋白较高的细胞株。
6. 大规模培养：选取高表达细胞株进行大规模培养，获得大量目的蛋白。
以上是目的蛋白表达载体构建的一般步骤，具体操作需要根据不同的实验需求进行优化。
构建表达载体的一般流程
构建表达载体的一般流程
构建表达载体的一般流程如下：
1. 选择合适的载体：根据需要表达的基因或蛋白质，选择一个合适的表达载体。
常用的载体有质粒、病毒、合成RNA等。
2. 插入目标基因：将需要表达的基因插入到载体的多克隆位点中。
可以通过PCR 扩增目标基因并使用限制性内切酶切割载体和基因，然后进行连接。
3. 连接启动子和终止子：为确保基因在宿主细胞中能够正常表达，需要在基因的上游添加启动子和在基因的下游添加终止子。
这些序列将调控基因的表达方式和水平。
4. 检验构建质量：通过限制性内切酶切割、PCR扩增或测序等方法，验证所构建的载体和目标基因的正确性和完整性。
5. 转化宿主细胞：将构建好的表达载体导入到宿主细胞中。
常用的转化方法有电穿孔、热激冲击和化学转化等。
6. 筛选和鉴定：通过特定的筛选方法或选择标记，在转化的宿主细胞中筛选和鉴定表达目标基因的阳性克隆。
7. 表达优化：根据需要，可以通过调节培养条件、添加诱导剂或使用特定的宿主菌株等方法，优化目标基因的表达水平和质量。
8. 收获表达产物：经过一段时间的培养后，收获表达的基因产物，如蛋白质，进行后续的纯化、鉴定和应用等。
需要注意的是，具体的构建流程和方法可能会因实验的目的和要求而有所不同。
在实施过程中，需要对不同步骤和条件进行优化和调整，以确保表达载体的构建和表达目标基因的成功。
功能基因表达载体的构建
天津师范大学化学与生命科学学院分子生物学期末实验报告实验名称：功能基因表达载体的构建11级水生生物李雪静 1110170036 2010-1-20一、实验目的：构建功能基因kazal的表达载体。
二、实验流程：基因克隆——→小片段（kazal）制备、大片段制备——→kazal基因与目标载体连接——→蛋白质的诱导表达三、实验过程（一）2012年6月6日上午：PCR扩增目的基因A1.1 实验原理：PCR（polymerase chain reaction）技术是Kary Mullis 在1985年建立起来的在细胞体外合成DNA的一种方法。
依DNA半保留复制原理，利用DNA聚合酶依赖于DNA模板的特性，在附加的两个引物与模板杂交之后，按碱基配对原则经酶促反应合成DNA片段，包括模板变性、引物退火及用DNA聚合酶延伸两个引物之间DNA的一定次数的重复循环，使包括在两个引物5′端限定的特异性片段形成指数式积累。
整个过程操作简单，可在短时间内在小管中获得大量的特异的DNA拷贝，这一特点使PCR技术很快被应用到了分子生物学研究的广大领域。
扩增DNA的特异性主要取决于引物和模板相结合的特异性，每个循环的反应分为3步：（1）模板变性（template denaturation）：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，形成游离于溶液中的单链DNA。
（2）退火（annealing）：温度突然降低，反应体系中的引物能准确地配对于被扩增区域的两个侧翼。
这是因为模板分子结构比引物的结构复杂得多，而且引物的拷贝数远高于模板DNA的拷贝数，因此引物与模板DNA形成复合物的概率要大大高于模板DNA两条单链的重新结合。
（3）延伸（extension）：在DNA聚合酶、4种脱氧核糖核苷三磷酸及Mg2+ 存在的条件下，DNA聚合酶催化以引物为起始点的5′--3′DNA链延伸反应。
n个循环后，一个模板得到的扩增拷贝为2n-1。
1.2 实验步骤：以菌液为模版，进行PCR反应，扩增目标基因。
基因表达载体构建实验方法
基因表达载体构建实验方法基因表达载体构建实验目的较为官方的解释为：使目的基因能在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。
通过这种手段，我们就可以将众多的目的基因进行异源性的表达，因此能够快速并且大量的富集到对应的目的蛋白；此外，我们还能够以农杆菌为目的基因的载体，通过植物侵染的方式，将目的基因转入到植物中，从而形成特殊的遗传材料，进行特定的课题研究。
基因表达载体构建实验原理通俗点来理解，就是我们将一个感兴趣的基因，通过一种手段将其放到一个表达载体上，这个表达载体一般为细菌细胞内特有的一种环状双链DNA分子，称为质粒。
将目标基因连接到质粒上之后，得到的就是一个人为拼接后的重组质粒，我们称之为表达载体。
接下来我们就可以通过转化的方法，将这个重组质粒转化到感受态细菌中，例如trans5α，DH5α，DB3101等等菌株中。
将转化成功的细菌克隆进行培养繁殖，得到的菌液就可以进行长时间冷冻保存了。
待需要使用时，只需要将菌种从-80℃取出，进行复苏并培养，然后进行质粒提取，就可以再次拿到大量的目的基因表达载体，供后续实验使用。
基因表达载体构建实验步骤设计引物，PCR扩增目的基因片段，切胶回收目的基因加A，体系：10 X easy buffer 1uldATP 0.8 ulTaq 酶 0.1ul回收产物 8ul72℃ 40minXcmI 酶切 En-ccdB （50ul）En-ccdB 质粒（200ng/ul） 50ul (1ug)10X NE buffer 50ulH2O 38ulXcmI 酶 2ul 10U37℃ 1h , 65℃ 20min热失活，跑胶回收（约2600bp）加A后的产物与酶切的pEntry-T 连接摩尔比1:1~5:1（10ul体系）加A的回收产物 ul酶切后的En-T ul5XT4 buffer 1ulT4 ligase 0.5 ulH2O 补齐22℃ 1h转化DH5α,涂LB固体培养基（kana），筛选阳性克隆后进行测序验证碱基序列。
表达载体的构建方法及步骤
表达载体的构建方法及步骤一、载体的选择及如何阅读质粒图谱目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA 是一种新的非病毒转基因载体。
一个合格质粒的组成要素：（1）复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。
原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。
而真核生物DNA 分子有多个复制起始位点。
（2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+（3）多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段（4）P/E 启动子/增强子（5）Terms 终止信号（6）加poly（A）信号可以起到稳定mRNA 作用选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。
如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。
载体选择主要考虑下述3点：【1】构建DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。
【2】.载体的类型：（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。
如<10kb 选质粒。
（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。
（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。
【3】载体MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。
综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求：（1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体）；（2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。
（3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；（4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（试一试）。
（5）满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。
载体构建流程 ppt课件
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挑取阳性克隆去测序
测序是构建载体的最后一个关键的环节，只有测 序正确的阳性克隆才算成功构建载体。
ORF序列不允许出现插入、缺失、改变氨基酸的 点突变，至于密码子简并突变以及相似氨基酸间 的突变要视客户要求或是否影响所研究蛋白的表 达、结构、功能。
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转化
基本步骤： （1）将100μl感受态细胞于冰上解冻。 （2）取5μl连接产物加入到感受态细胞中，轻轻旋转几次以
混匀内容物。 在冰上放置30分钟。 （3）将管放入预加温到42℃的水浴中，热激90秒。快速将
管转移到冰浴中，使细胞冷却1~2分钟。 （4）每管中加700μl LB培养基，37℃振荡培养1小时，进行
此步以适应现代分子生物学实验室批量工作 的高效性，通常只需挑半个菌落直接作为模 板进行常规PCR就能初步检测阳性克隆。
初步检菌的阳性克隆接种提质粒，供后续酶 切分析以及测序检测。
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酶切检测阳性克隆
将菌检的阳性克隆所得质粒进行酶切分析，获得预期 条带的即为阳性克隆。
要进一步确认是否有因PCR所带来的点突变，插入， 缺失等改变目的基因的序列，还需要对阳性克隆进行 测序。
什么条带都没有，其原因可能是少加东西，酶已经失活了，或退火温 度太高等。解决方法：检查是否少加东西了，换一下酶，降低退火温 度或做个梯度，摸一下条件。
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PCR产物纯化
倘若直接对PCR产物进行酶切，体系的杂 蛋白、离子等会造成酶切困难或星活性， 残余的聚合酶也会填平粘性末端，造成克 隆失败。
表达载体构建
表达载体构建1. 背景介绍表达载体是在分子生物学领域中广泛使用的工具，用于将目标基因导入宿主细胞中并使其表达。
构建高效的表达载体对于基因功能研究和基因工程应用具有重要意义。
本文将介绍表达载体的构建方法及其在基因表达中的应用。
2. 表达载体的构建方法构建表达载体的一般步骤包括选择合适的载体骨架、选择适当的启动子和终止子、插入目标基因序列以及进行转染或转化等操作。
下面将详细介绍表达载体的构建方法。
2.1 选择合适的载体骨架常用的载体骨架包括质粒和病毒载体。
质粒是可以在细菌中复制的DNA分子，通常由起始位点、选择标记和多个限制酶切位点组成。
病毒载体包括腺病毒、慢病毒等，具有高效转染特性。
选择适合自己研究的载体骨架是表达载体构建的第一步。
2.2 选择适当的启动子和终止子启动子是基因表达的起始信号，终止子是基因表达的终止信号。
启动子的选择应根据目标基因的表达需求和宿主细胞的特性进行。
常用的启动子包括强启动子（如CMV启动子）、组织特异性启动子等。
终止子则可以选择常规的转录终止信号。
2.3 插入目标基因序列选择合适的酶切位点，在载体DNA上进行限制性内切酶切割，并将目标基因序列与载体连接。
连接的方法可以是经典的限制性酶切连接、PCR扩增连接、Ligase连接等。
连接完成后，应进行酶切鉴定和测序验证，确保目标基因序列插入准确。
2.4 进行转染或转化将构建好的表达载体导入宿主细胞中，实现基因表达。
转染方法包括化学转染、电穿孔转染、病毒介导转染等，转化方法包括细菌的电转化、植物的农杆菌介导转化等。
3. 表达载体的应用表达载体广泛应用于基因功能研究和基因工程应用，具有重要的实验意义和应用前景。
3.1 基因功能研究通过表达载体，可以实现外源基因的高效表达，进而研究基因的功能、调控机制等。
比如可以通过表达载体将目标基因在细胞中过度表达或进行基因敲除等，来研究该基因在细胞或生物体中的功能。
3.2 基因治疗表达载体在基因治疗中具有重要的应用价值。
基因表达载体的构建步骤
基因表达载体的构建步骤
基因表达载体的构建步骤：
①目的基因获取首先需从cDNA文库基因组DNA中PCR扩增出所需片段或通过化学合成方法得到纯净的目的基因；
②载体骨架选择根据后续实验需求如原核表达真核细胞表达植物动物体内表达等挑选合适质粒作为载体骨架；
③双酶切处理使用限制性内切酶对载体DNA进行特异性切割产生与目的基因相同的粘性末端或平末端便于连接；
④凝胶电泳检测将酶切产物加入琼脂糖凝胶中通过电泳分离出预期大小片段并用EB染色紫外灯照射观察；
⑤回收纯化利用商业化试剂盒或自制酚氯仿异丙醇沉淀法回收去除杂蛋白小分子RNA等杂质获得高纯度DNA；
⑥DNA连接取等摩尔浓度的目的基因与载体在T4DNA连接酶缓冲液中孵育过夜使两者以磷酸二酯键相连；
⑦大肠杆菌转化将连接产物热击转入感受态细胞中涂布含相应抗生素的选择平板37度培养箱过夜长出克隆；
⑧阳性克隆筛选挑取单菌落PCR鉴定插入片段大小测序比对确认无误后扩大培养提取质粒保存备用；
⑨启动子匹配根据目的基因表达调控需要从启动子文库中选出与宿主细胞相容性好诱导性强的启动子片段；
⑩多顺反子构建有时为了实现联合表达还需将多个基因串联起来形成多顺反子结构其间用IRES元件连接；
⑪终止子添加在多顺反子3'端加上终止子序列帮助RNA聚合酶识别转录终止位点防止下游基因串扰；
⑫安全评估构建好完整表达载体后还需对其遗传稳定性毒性免疫原性进行评估确保对人体环境友好无害。
构建载体的实验流程
构建载体的实验流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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表达载体的构建
3 μL
3 μL 1 μL 1 μL
二 实验步骤
1、将鉴定为阳性的重组质粒pGEMT-NP、pGEMT-P、 pGEMT-M、pGEMT-F和pGEMT-HN与原核表达载体pET32a分别用相应的限制性内切酶进行双酶切。以 pGEMT-NP为例，双酶切体系（30μL体系）如下：
ddH2O 10×buffer H pGEMT-NP EcoRI Sal I 21 μL 3 μL 4 μL 1 μL 1 μL ddH2O 10×buffer H pET-32a EcoRI Sal I 22 μL
HN基因两端带有的酶切位点为SalI和XhoI，通用buffer为10×buffer H
EcoR Ⅰ
Sal Ⅰ
Xhol Ⅰ
Hind Ⅲ
第一组
目的基因酶切体系
ddH2O 10×buffer H pGEMT-NP EcoRI Sal I 21 μL 3 μL μL
3 μL 1 μL 1 μL
2、双酶切反应条件：37 ℃ 3 h。进行1％琼脂糖凝 胶电泳鉴定，然后在紫外灯下切取目的条带，用凝 胶回收试剂盒回收目的片段和原核表达载体片段。 3、目的基因片段与原核表达载体pET-32a的连接， 连接体系为10μL：
ddH2O 10×T4 Buffer 目的基因片段 载体片段 T4 DNA Ligase 2 μL 1 μL 5 μL 1 μL 1 μL 4℃连接过夜
谢谢！
Thanks!
ddH2O 10×buffer M pET-32a EcoRI HindⅢ
第三组
ddH2O 10×buffer H pGEMT-M EcoRI Sal I
21 μL 3 μL 4 μL 1 μL
1 μL
构建基因表达载体的步骤
构建基因表达载体的步骤基因表达载体是用来将外源基因转录和翻译为蛋白质的重要工具。
构建一个高效的基因表达载体是基因工程的重要一步。
下面将介绍构建基因表达载体的步骤。
第一步：选择合适的表达载体在构建基因表达载体之前，需要选择适合自己研究对象的表达载体。
一般来说，常用的表达载体有质粒、病毒载体和细胞质表达系统等。
对于不同的表达载体，其表达效率和表达特点也有所不同，需要根据自己的实验需要进行选择。
第二步：选择合适的启动子和信号序列在表达载体中，启动子和信号序列是控制基因表达的关键元素。
启动子是转录起始位点上游的DNA序列，可以控制基因的转录水平；信号序列则可以控制基因的翻译和定位。
因此，在构建基因表达载体之前，需要选择适合自己实验需要的启动子和信号序列。
第三步：克隆外源基因在构建基因表达载体时，需要将外源基因克隆到载体中。
一般来说，可以使用PCR扩增方法或限制性内切酶切割方法将外源基因克隆到载体中。
此外，还需要选择合适的克隆位点，以便快速筛选出正确的克隆子。
第四步：构建表达载体在将外源基因克隆到载体中后，需要构建表达载体。
具体操作包括将启动子和信号序列插入到载体中，以实现对基因表达的控制。
此外，还需要进行质粒线性化和酶切等操作，以实现转染或转化细胞。
第五步：筛选表达载体在构建表达载体后，需要进行筛选，以确定正确的表达载体。
此时可以通过限制性内切酶酶切、PCR扩增和测序等方法进行筛选，以确保表达载体的正确性。
第六步：转染或转化细胞在确定正确的表达载体后，需要将其转染或转化到细胞中。
转染方法包括热激转染、电穿孔转染和基因炮转染等；转化方法则包括化学转化和电转化等。
根据自己的实验需要选择合适的转染或转化方法。
第七步：检测基因表达在转染或转化细胞后，需要检测外源基因的表达情况。
检测方法包括Western blotting、RT-PCR和荧光显微镜等。
根据自己的实验需要选择合适的检测方法。
总结构建基因表达载体是基因工程研究的重要一步。
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Sma I CCCGGG GGGCCC
注意： 1、不同公司的酶，其缓冲液有时是不同的； 2、同一公司的酶，使用相同的缓冲液或不同的缓冲液而 不显著影响酶活性时，可同时做双酶切。 3、一种酶可能有几种缓冲液。
14
怎样使用公司目录
酶的质量标准
不同酶的反应缓冲液及活性 双酶切 酶切后具有共同的粘性末端
酶活单位：酶量，时间
把目的基因置于以适当的载体，转化细菌后，筛选所需 的细菌克隆。摇菌后可得到大量含目的基因的表达载体 注意事项：
-- 选择合适的载体 -- 载体具有适合的酶切点 -- 适合地连接反应 -- 选择适合扩增质粒的菌株 -- 筛选、验证目的克隆 -- 转化对照
1
分子克隆实验若纸上谈兵，似乎轻而易举；但要付诸实践， 却又举步维艰，谈何容易。大多数实验都是步骤繁多，若 一着不慎，即会陷入困境。
16
内切酶buffer
盐离子 低--中--高 通用
promega TaKaRa
NEB
A—B—C—D L—M—H
1—2—3—4
…… K
……
1、双酶切时注意buffer的选择； 2、酶在非最优buffer中的活性会降低，应调整酶量和反应时间。
17
一）酶切不开或酶切不完全 ？？
1、质粒不纯：
杂蛋白（A260/A280＜1.8 ）；抑制剂（酚、盐、乙醇 ）
15
核酸酶操作注意事项
通常，不同公司出产的内切酶，它的菌株来源、制备工艺、纯 度及活力、酶切活性的优化等都可能存在不同，试剂公司会对自 己的内切酶进行比较全面的分析。因此，说明书及目录中的技术 资料是最具有针对性的资料。 注意事项： a. 内切酶如无特殊要求，应该保存在-20~-30度。 温度过低：酶会冻结，反复冻融，降低酶活 温度过高： b. 酶在使用时应置于冰盒中取酶。 不可用手捏管底部 移液器吸取时，酶管不可离开冰面。 c. 酶使用完后应尽快旋紧盖子。 d. 吸取酶时的tips，最好是长些。
10
一、克隆位点的选择
1、首先要对目标基因进行酶切位点扫描分析，列出其所含酶切位点清单。 2、然后对照质粒多克隆位点，所选择的克隆位点必须是目标基因所不含的 酶切位点。
二、保护碱基数（直接酶切PCR产物）
1、在设计PCR引物时，引入酶切位点后，常常要加入保护碱基。
2、 一般情况下，普通的内切酶只加入两个保护碱基，其内切反应就可以正 常进行；
验证每步产物，设置对照以检查每一反 应的效率，都是可取的良策。而要对上述问题应对自 如，又必须透彻理解每一步实验流程所涉 及的实验原理。
——第一版前言（p11） 《分子克隆实验指南》 第二版 ，1996，科学出版社
2
汇报内容
1 2 3 4 5 6 表达载体的分类 目的基因的获得 酶切 片段回收 连接 质粒的检测
3
如何阅读质粒图谱
1、质粒类型和大小（真核/原核/穿梭质粒） 2、复制起点（ori）
3、筛选标记（抗生素标记）
4、多克隆位点（MCS）
5、外源DNA片段的插入（位置、大小、酶切位点）
6、表达系统元件
（启动子—核糖体结合位点/内含子—克隆位点—转录终止信号）
4
5
6
常用抗生素抗性基因
1、杀菌机理： 四环素（tet): 四环素与核糖体30S亚基结合，抑制核糖体的转位。
二、农杆菌转化
1、农杆菌载体，含有左右边界； 2、 可以转化大的目的基因。
8
候选基因功能分析
一、超表达载体
1、CaMV 35S启动子；
2、玉米Ubi启动子； 3、其它。
二、RNAi载体
1、含有intron，转录后形成发卡，沉默效率高； 2、 多用其本身启动子。
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汇报内容
1 2 3 4 5 6 载体的分类 目的基因的获得 酶切 片段回收 连接 质粒的检测
三、人工化学合成
最后的选择。公司会将合成片段连入克隆载体。需测序验证。
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汇报内容
1 2 3 4 5 6 表达载体的分类 目的基因的获得 酶切 片段回收 连接 质粒的检测
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基因工程所用的酶
限制性内切酶 从商品目录上得到有关信息 EcoR I Pst I GAATTC CTGCAG CTTAAG GACGTC 5’p G 3’OH 5’p CTGCA 3’OH 3’OH CTTAA 5’p 3’OH G 5’p
2、酶失活：
有过期时间（能有效酶切，双酶切
4、保护碱基：
5、甲基化：
甲基化缺陷的菌株
卡那霉素（kan)：可与核糖体结合，抑制蛋白的合成。
卡那霉素可被氨基糖苷磷酸转移酶(APH-II)灭活。
2、溶液配制：
一般配成50或100mg/mL，抽滤，-20℃保存备用。
7
遗传转化所用载体（1）
一、基因枪转化
1、对载体类型无选择；
2、载体不宜过大，目的基因不宜过大。 3、可以转化 “启动子-目的基因-终止子” 片段。
酶的浓度：10 units/uL; 20 uints/uL等 保存条件: -20～-30 ℃
切割位点：有无其他活性 酶切体系: buffer及与其它酶双切的buffer等 所用底物： DNA量，切后再连接的程度 反应温度：一般为37℃,但许多酶对温度有特殊要求 甲 基 化： 星 活 性: 所加酶量过多 保护碱基:
Tet 抗性基因编码一个399的膜结合蛋白，可阻止四环素进入细胞。
氨苄青霉素（amp)：氨苄青霉素可与细菌膜上一些与细胞壁合成有关的酶结合
并抑制其活性。Amp基因可降解氨苄青霉素。
氯霉素（Cm或cat)：氯霉素与核糖体50S亚基结合并抑制蛋白质的合成。
Cat 基因编码一个四聚体细胞蛋白，催化氯霉素羟乙酰氧衍生物的形成。
有些则加3个以上，NdeI就属这类，需加入至少6个保护碱基，常用的 HindIII也要三个。
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目的基因获得
一、从已有载体上截取
所选择的克隆位点必须是目标基因所不含的酶切位点
二、PCR法
1、 无内含子，可用基因组DNA为模板，有内含子则用cDNA。 2、若PCR难度很大，宜将PCR产物连到克隆载体上，测序后，再酶切 连接到表达载体上。不推荐直接酶切PCR产物。 3、在加loading buffer前，可取出几微升，作为二扩模板。 4、设退火温度梯度，多做几管。回收时损失大半。 5、尽管PCR产物只有一条特异带，电泳挖取目标带也是必要的。