基因工程基本操作过程(目的基因与运载体结合)

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载体DNA和目的基因DNA的连接,按DNA片
段末端性质不同,可有下述不同的连接方法:
① 粘性末端连接法
② 平端连接法 ③ 同聚物加尾连接法 ④ 人工接头连接法

1. 同一限制酶切位点连接: 由同一限制性核酸内切酶切割的不同DNA片段具有完 全相同的末端。只要酶切割产生单链突出的粘性末端 和酶切位点附近的DNA序列不影响连接 .在连接酶的 作用下即可形成重组DNA分子. 上述方法的缺点:由限制酶产生的具有粘性末端的载 体DNA分子,在连接反应中常发生自我环化作用,并 在连接酶的作用下重新变成稳定的共价闭合环状结构。 解决方法:用细菌的碱性磷酸酶预先处理线性的载体 DNA分子,去除其5‘末端的磷酸基。

依不同的研究目的而定,认真设计最终构建的重组体
分子。需要考虑下列2个方面。 如果研究目的是: (1) 表达有价值的蛋白质,要考虑选用适当的启动子、 增强子等调节序列和终止序列,要将目的基因置于启 动子的转录起始点的下游,并审视‚阅读框‛是否正 确,这些对表达融合蛋白至关重要。 (2) 对某一基因的上游序列进行调控机能分析,则需 考虑选择适当的报告基因,并将可能具有调控机能的 目的基因置于报告基因的上游适当位置。 若调控基因可能有增强子作用,还应在报告基因下游 适当部位插入一个功能基因,由此反映增强子的作用。
外源DNA只能以一个方向定向插入到重组质粒中, 以便目的基因的正确转录和表达。 载体与外源DNA结合处的限制酶切位点仍然保留, 可以随时从重组载体中通过相应的限制性内切酶 切割后分离获得目的基因。 不会自身环化,转化率高,转化后的细菌克隆大 多数携带有目的基因的重组质粒。
一些内切酶如HaeⅢ和HpaⅠ切割产生DNA的 片段没有粘性末端,而是平末端。 具有平末端的 酶切载体只能与平末端的目的基因连接。 T4DNA 连接酶可催化相同或不相同的限制性内切酶切割 的平端间的连接。 平端连接比粘性末端连接要困 难的多,其连接效率很低,约有粘性末端连接的 1%。 适用于限制性内切酶切割产生的平端 适用于粘端补齐或切平形成的平端
目的基因与运载体结合
基因工程(genetic engineering)又称基因
拼接技术和DNA重组技术,是以分子遗传 学为理论基础,以分子生物学和微生物学的 现代方法为手段,将不同来源的基因按预先 设计的蓝图,在体外构建杂种DNA分子, 然后导入活细胞,以改变生物原有的遗传特 性、获得新品种、生产新产品。基因工程技 术为基因的结构和功能的研究提供了有力的 手段。 基因工程要素:包括外源DNA,载体分子, 工具酶和受体细胞等

提高平头末端连接效率的方法包括:
①加大连接酶用量(10倍大于粘性末端的连接) ②加大平头末端底物的浓度,增加分子间碰撞
机会;
③加入10% PEG8ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ00,促进大分子之间的有效
作用;
④加入单价阳离子(NaCl)。
当载体和外源DNA片段两端的酶切位点之
间,不可能 找到恰当的匹配时,解决方法: ⑴人工接头连接法:通过依次加入、连接 合成DNA接 头,再用限制酶切加以解决。 ⑵同聚物加尾连接法:可以利用末端转移 酶分别在 载体酶切位点处和外源DNA片段 的3’端加上相互补 的同聚尾加以解决。 ⑶PCR法:通过PCR(聚合酶链反应)技术扩 增外源DNA 片段,从而加上合适的限制性 内切酶的单一识别序 列,再用限制酶切加 以解决。
2.不同限制酶切位点连接:
由两种不同的限制性核酸内切酶切割的DNA片段、
具有相同类型的粘性末端,彼此称为互补末端也 可以采用粘性末端连接。 外源DNA和载体DNA经过两个限制性内切酶切割 后一侧产生的黏性末端,另一侧产生平未端(可 先生成黏性末端再补平)。
双酶切片段的定向克隆的优点

基因工程在20世纪取得了很大的进展,至少有两
个有力的证明。一是转基因动植物,一是克隆技 术。 转基因动植物由于植入了新的基因,使得动 植物具有了原先没有的全新的性状,这引起了一 场农业革命。如今,转基因技术已经开始广泛应 用,如抗虫西红柿、生长迅速的鲫鱼等。 1997年世界十大科技突破之首是克隆羊的诞 生。这只叫‚多利‛母绵羊是第一只通过无性繁 殖产生的哺乳动物,它完全秉承了给予它细胞核 的那只母羊的遗传基因。‚克隆‛一时间成为人 们注目的焦点。尽管有着伦理和社会方面的忧虑, 但生物技术的巨大进步使人类对未来的想象有了 更广阔的空间。
为了将目的基因重组于载体分子之中,
需要将载体DNA和目的基因分别进行适 当处理,使其可以互相连接,形成新的 重组分子。
载体DNA通常有着许多酶切位点.但是并不是所
有的酶切位点都可用于重组切割,理想的酶切位 点应该符合下列几个条件: 1)位于载体上特定的酶切位点要尽可能少,最好是 单一酶切位点,这样才能保证目的基因和载体DNA 以最高的几率正确组合. 2) 在酶切位点之前要有一个较强的启动子,使 插入的目的基因可在该启动子的指导下高效表达。 3)选择的载体必须在连接后对基因转录和翻译过 程中的编码区读框不改变。
自从 1973 年 Jackson 等人在一次分子生物学学 会上首次提出基因可以人工重组,并能在细菌中复 制。从此以后,基因工程成为一项新兴的研究领域 得到了迅速的发展,无论是基础研究,还是应用研 究均取得了喜人的成果。这是生命科学发展的一次 飞跃,生命科学已经进入了一个定向、快速改造生 物性状的新时代,受到了国内外广泛的重视。 开展基因工程研究几十年来,建立了多种分别 适用于微生物、动植物转基因的载体受体系统,克 隆出了一批有用的目的基因,研制出了数十种昂贵 的基因工程药物,培育出了一批具有特殊性状的转 基因动植物。
人工接头(DNA寡核苷酸连杆)是人工合成
的具有一个或数个特定 限制性内切酶识别和 切割序列的双股平端DNA 短序列。 由平端加 上新的酶切位点,再用限制酶切除产 生粘性 末端,而进行粘端连接。
优点:是进行DNA重组的一种既有效又实用的手
段,兼具有同聚物加尾法和粘性末端连接法的优 点,而且它可以根据实验的不同要求,设计出具 有不同限制酶位点的人工接头。若在体外连接反 应中增加人工接头的浓度,还会大大提高平末端 DNA片段间的连接效率。 缺点:如果待克隆的DNA片段或基因的内部,也 含有与所加的人工接头相同的限制酶切位点,这 样在酶切消化人工接头产生粘性末端的同时,也 会把克隆的外源基因切成不同的片段,从而为后 继的操作造成麻烦。
当载体和外源DNA用同样的限制性内切酶切割时,所形成的
DNA末端就能够彼此相匹配,可以被T4连接酶共价地连接起 来,形成重组体分子。 但是,当靶片段的末端与载体不匹配时, 必须转换其中一个或两个片段的末端形式以便使之连接。这种 末端的转换通常用以下三种方式转换: ① 3’凹端补平:使用大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段部分 补平3’凹端,将不匹配的3‘凹端转换为粘端;或者完全补平, 产生平端DNA分子,可与任何其他平端DNA相连接。 ② 3’突端切除:T4噬菌体DNA聚合酶具有强烈的3’- 5’外 切核酸酶活性,可将3’突端切除。 ③ 平端加上人工合成接头:合成接头是自相互补的两个化学 合成的寡核苷酸的等摩尔混合物,而两个寡聚体可形成带一个 或多个限制性酶切位点的平端双链体。因此在平端DNA加接 头可为其亚克隆操作增加一个或多个限制性酶切位点。
1.提取目的基因
2.目的基因与运载体结合
(基因表达载体的构建)是基因工程的核心。
3.将目的基因导入受体细胞 4.目的基因的检测和表达
切、接、转、增、检
外源DNA片段同载体分子连接的方法, 即DNA分子体外重组技术,主要是依赖于 限制性核酸内切酶和DNA连接酶的作用. 基因重组: 就是利用 限制性内切酶及其他 一些酶类,切割和修饰载体DNA和目的基 因.将两者连接起来,将目的基因插入于可 以自我复制的载体内,再转入受体细胞,以 这种外源性的目的基因在受体细胞内得到扩 增或正确表达。

当今,国际上一项合作性的基因组测序计划的完 成。随着功能性基因不断被开发出,分离及转基因技 术的不断完善,转基因获表达效率不断提高,21 世纪 基因工程研究将会有更大的发展。 人类将因为有了基因工程会使寿命大大延长;生 物的多样性将得到维护并发展……。科学家们纷纷发表 文章称‚基因工程,前景诱人‛,但出现的问题也是 极其复杂的,关系到人类自身的安全,包括我们生存 的环境,种族的延续,甚至伦理道德。所以,在实施 该工程时,必须把好审批关,从严掌握,避免失误。
移酶等协同作用 。
同聚物接尾法实际上是一种人工粘性末端连
接法。
优点:通过DNA加尾,既可以使两个具平末端
的DNA片段进行连接,也可以使具平末端的 DNA片段与粘性末端的DNA片段进行连接。
缺点:只对质粒载体有效;质粒和cDNA上的
同聚物长度难以控制相等,影响克隆效率;用 其转化宿主菌的效率依不同菌株而有较大差异。

谢谢 欢迎批评指正
同聚物加尾连接:利用末端转移酶在载体及外源双
链DNA的3′端各加上一段寡聚核苷酸,制成人工粘 性末端,外源DNA和载体DNA分子要分别加上不同 的寡聚核苷酸。dA(dG)和dT(dC), 然后在DNA连接 酶的作用下, 连接成为重组的DNA。这种方法可适 用于任何来源的DNA片段。
但方法较繁,需要λ核酸外切酶、S1核酶、末端转
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