promegaDNA组织提取试剂盒
分子技术耗材试剂盒种类
分子技术耗材试剂盒种类1. DNA提取试剂盒：DNA提取是分子生物学中的一个重要步骤，用于从细胞或组织中提取纯化DNA。
DNA提取试剂盒包括DNA裂解试剂、蛋白酶K、DNA纯化柱等，常见的品牌有Qiagen、Omega等。
2. RNA提取试剂盒：RNA提取试剂盒用于从细胞或组织中提取纯化RNA。
RNA提取试剂盒包括RNA裂解试剂、DNase、RNA纯化柱等，常见的品牌有Qiagen、Thermo Fisher Scientific等。
3. 反转录试剂盒：反转录试剂盒用于将RNA转录成cDNA，常见的品牌有Thermo Fisher Scientific、Promega等。
4. 荧光定量PCR试剂盒：荧光定量PCR试剂盒用于进行荧光定量PCR（qPCR），可用于分析基因表达水平、检测病原体等。
常见的品牌有Thermo Fisher Scientific、Roche、Bio-Rad等。
5. 真核生物基因组DNA扩增试剂盒：真核生物基因组DNA扩增试剂盒用于扩增真核生物基因组DNA。
常见的品牌有Takara、Thermo Fisher Scientific等。
6. 质粒DNA提取试剂盒：质粒DNA提取试剂盒用于从细菌中提取纯化质粒DNA。
常见的品牌有Omega、Promega等。
7. DNA纯化试剂盒：DNA纯化试剂盒用于从PCR产物或凝胶切片中纯化DNA。
常见的品牌有Omega、Qiagen等。
8. DNA测序试剂盒：DNA测序试剂盒用于进行DNA测序，常见的品牌有Thermo Fisher Scientific、Illumina等。
9. 原位杂交试剂盒：原位杂交试剂盒用于检测基因表达或染色体异常，常见的品牌有Thermo Fisher Scientific、Agilent等。
10. DNA修饰试剂盒：DNA修饰试剂盒用于修饰DNA分子，如甲基化修饰。
常见的品牌有New England Biolabs、Zymo Research等。
PROMEGA逆转录试剂盒说明书
Reverse Transcription System
INSTRUCTIONS FOR USE OF PRODUCT A3500.
1. Description..........................................................................................................1 2. Product Components and Storage Conditions ............................................2 3. Reverse Transcription Protocol.......................................................................2
Printed in USA. Revised 3/09 Part# TB099 Page 1
2.
Product Components and Storage Conditions
Size 100 reactions Cat. # A3500
Product Reverse Transcription System
3.A. Reverse Transcri magnesium concentration may be optimized for any given sequence to achieve better yields. **Final concentration of reaction components: 5mM MgCl2; 1X Reverse Transcription Buffer (10mM Tris-HCl [pH 9.0 at 25°C]; 50mM KCl; 0.1% Triton® X-100); 1mM each dNTP; 1u/μl Recombinant RNasin® Ribonuclease Inhibitor; 15u/μg AMV Reverse Transcriptase (High Conc.); 0.5μg Oligo(dT)15 Primer or Random Primers per microgram RNA; 50ng/μl 1.2kb Kanamycin Positive Control RNA, poly(A)+ mRNA or total RNA.
DNA的提取与保存方法
1．-20度冻存1年是没有问题的，当然越低越好。
但是冻存后，用蛋白酶K法，红细胞不易裂解，必须采用特殊方法裂解。
2．建议裂解红细胞后再冻存于－80度。
因为冻融后红细胞会裂解，而且红细胞会增加蛋白污染，影响DNA抽提3．我们实验室加ACD抗凝血液，保存3年了，抽提DNA没问题（我们是先离心后分层保存，以便后续试验）！血DNA提取技术分离外周血白细胞提取方法：试验步骤：1、取人肘静脉血5ml，EDTA抗凝，2500rpm离心10min。
2、小心吸取上层血浆，分装到3个0.5ml离心管中。
3、在血细胞中加入3倍体积的溶血液，摇匀，冰浴15min。
4、2500rpm离心10min，弃上清。
5、加入10ml溶血液，摇匀，冰浴15min。
6、3000rpm离心10min，弃上清。
7、倒置离心管，去掉残液。
8、得白细胞，－80?C冻存。
试验要求：血至分离白细胞之间隔时间在室温下放置不超过2h，4℃放置不超过5h，以防白细胞自溶。
氯仿法抽提外周血白细胞基因组DNA：试验试剂：Ligsisbuffer：133mMNH4ClNHCl7.12g0.9mMNH4HCO3NH4HCO30.071g0.1mMEDTA0.5mMEDTA0.2ml；最后加灭菌去离子水至1000ml，高压灭菌。
ACD抗凝剂：柠檬酸1.68g柠檬酸钠4.62g葡萄糖5.15g；最后加灭菌去离子水至350ml，高压灭菌。
提取缓冲液（Extractionbuffer）：10mMTrisCl(PH=8.0)1MTris.Cl(PH=8.0)1ml0.1mMEDTA(PH=8.0)0.5mMEDTA(PH=8.0)20ml0 .5%SDS10%SDS0.5ml；最后加灭菌去离子水至100ml，高压灭菌试验步骤：1、在500μl抗凝血中加入ligsisbuffer1000μl，充分颠混至清亮。
以4000rpm，离心5min。
弃上清液。
2、沉淀中加入ligsisbuffer1500μl，充分匀浆。
Promega试剂盒Wizard
按Promega试剂盒Wizard ® SV Genomic DNA Purification System使用说明进行，其具体方法和步骤如下，样品材料消耗体系见表2.1：（1）在上述的1.5 mL Eppendorf管中，分别加入275 μL消化液，具体见表2.1；（2）在55 ℃恒温下，样品消化16–18 h；（3）分别在每管中，加入250 μL Wizard® SV Lysis Buffer，旋涡振荡，混匀。
马上把管中的液体移置准备好的微型器（微型柱+收集管），室温离心13000 r/min，3 min；（4）离心后，弃去收集管中的液体，并向每个微型器中，加入650 μL Wizard® SV Wash Solution，室温离心13000 r/min，1 min；此步骤重复4次；（5）最后一次离心完，弃去收集管中的液体，放好微型柱和收集管，室温离心13000 r/min，2 min；（6）将微型柱转移到一新的Eppendorf管上，在柱中央加入30 μL Nuclease–free Water，室温放置2 min，13000 r/min离心1 min；（7）再向微型柱的柱中央加入30 μL Nuclease–free Water，室温放置2 min，13000 r/min离心2 min；（8）移去微型柱，回收洗脱液，将Eppendorf管内的虫体DNA样品置于–20 ℃冰箱保存备用。
表2.1 样品材料消化体系Table 2.1 Digestion system of samples组分Component 体积（μL）VolumeNuclei Lysis Solution 200 0.5M EDTA (PH 8.0) 50 Proteinase K (20 mg/mL) 20 RNase A Solution (4 mg/mL) 5 总体积275。
promega 组织和毛发提取试剂盒（与DNA IQ TM 系统结合使用）说明书
组织和毛发提取试剂盒（与DNA IQ TM系统结合使用）操作手册本说明书用于产品DC6740所有的技术文献均可从公司网站得到请访问公司网站以证实您所使用的技术手册为最新版本I．介绍 (1)III. 产品组分 (2)III．组织和毛发提取试剂盒与 DNA IQ TM系统结合使用的操作步骤 (2)A．试剂的准备 (2)B．从发囊及发根中纯化DNA (5)C．从新鲜组织、冰冻组织、甲醛固定组织及石蜡包埋组织中纯化DNA (6)IV．疑难解答 (7)V．参考文献 (7)VI．相关产品 (8)I.介绍Promega的 DNA IQ TM系统使用一种新的顺磁性树脂来纯化DNA, 该试剂盒中包含有DNA纯化所需的可用于多种形式样品的高效裂解液。
然而，DNA IQ TM 系统中的裂解液对一些如组织和毛发的样品不能有效地裂解，这些样品需要蛋白酶K的预处理以协助样品的裂解。
组织和毛发提取试剂盒（与DNA IQ TM系统结合使用）中提供的试剂和操作手册可用于大部分组织和毛发的有效裂解，除去样品中的蛋白和其它成分，随后用DNA IQ TM系统对样品中的DNA进行纯化。
基因组和线粒体DNA结合使用组织和毛发提取试剂盒（与DNA IQ TM系统结合使用）及DNA IQ TM系统，可高效地从样品中提取纯化双链或单链基因组DNA及线粒体DNA。
如果待提取的样品被微生物污染，则微生物DNA被一起分离。
可抑制PCR扩增的小于 80bp的 DNA可被选择性地去除，从而使纯化的 DNA更有效地用于 PCR扩增。
组织和毛发提取试剂盒（与DNA IQ TM系统结合使用）可提高 DNA纯化的产量当用DNA IQ TM系统—数据库操作手册（TB297）中涉及的样品进行 DNA纯化时，DNA IQ TM系统所提取的 DNA的量是固定的，约 100ng。
对于不同检材中DNA的定量提取依赖于样品中超量的DNA饱和DNA IQ TM 树脂。
在结合使用组织和毛发提取试剂盒（与DNA IQ TM系统结合使用）及 DNA IQ TM系统时，若用蛋白酶K消化去除竞争结合DNA IQ TM 树脂的物质，则树脂从蛋白酶K处理过的注意：本中文操作手册仅供实验参考，在实际使用中请详细对照原英文技术手册TB307。
Promega试剂盒提取DNA说明
Promega全血DNA小量提取试剂盒DNA抽提SOP1、实验场所：分子生物实验室（暂定）2、实验着装：隔离衣，塑胶手套3、实验准备：耗材：高压灭菌的黄、蓝tip和1.5mL离心管架仪器：已校准移液器（100，200，1000uL）、高速离心机、振荡器试剂：Promega全血DNA小量提取试剂盒、异丙醇、70%乙醇4、实验步骤：1）从4℃冰箱中取出装有全血的抗凝管，上下颠倒3次混匀，静置待上方盖的血液流下。
2）用镊子取N个1.5mL EP管（N=预抽提DNA血样数）垂直放于EP管架上，用防水marker笔按DNA编号在管壁和管盖上做好标记，并在DNA抽提实验记录本上对应记录血样编号、姓名及DNA编号。
保持EP管盖打开。
3）用1mL移液器取900uL cell lysis solution加入已备好1.5mL EP管中。
4）打开抗凝管盖，取300uL全血（注意勿沾血于移液器上），转移到上述1.5mL EP 管中。
每取一个血样，换一个tip头。
5）盖上EP管，室温下孵育10min。
6）室温下13000转/min离心20秒（不可延时）。
7）取出后，观察下方白色小斑块沉淀，如有则继续下一步，没有则再离心20秒。
8）打开EP管盖，手捏EP管底部，倾斜EP管口弃去部分红色上清，因表面张力无法弃去所有红色上清，抬高EP管，注视白色斑块，用100 uL移液器在不碰到白色斑块的前提下，尽量将红色上清吸尽。
9）盖上EP管，用手指弹EP管底物，将白色斑块重悬。
10）加300uL Nuclei Lysis Solution入上述EP管中，盖上EP管，上下颠倒10次混匀。
11）打开EP管，加100uL Protein Precipitation Solution入上述EP管中，盖上EP管，振荡器上振荡20秒。
12）室温下13000转/min离心3min。
13）在离心时，准备N个新的已消毒1.5EP管于管架上，标记DNA编号于管壁和管盖上。
DNA提取方法和试剂作用详解
1试剂的作用氯仿的作用？氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。
最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。
（酚易溶于氯仿中）用酚-氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇，为什么？异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。
异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。
另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。
用乙醇沉淀DNA时，为什么加入单价的阳离子？用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如NaCl 或NaAc，Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀。
2 DNA提取分为三个基本步骤每个步骤的具体方法可根据样品种类、影响提取的物质以及后续步骤的不同而有区别。
.细胞的破碎细菌有坚硬的细胞壁，首先要破碎经胞。
方法有三种;①机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法;②化学试剂法：用SDS处理细胞;③酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，都可使细胞壁破碎。
利用研磨或者超声破碎细胞，并通过加入去污剂以除掉膜脂。
加入蛋白酶，醋酸盐沉淀，或者酚/氯仿抽提，以除掉细胞内的蛋白，如与DNA 结合的组蛋白。
将DNA在冷乙醇或异丙醇中沉淀，因为DNA在醇中不可溶而黏在一起，这一步也能除掉盐分。
另外，目前也有利用吸附过柱的方法提取DNA 的商业化试剂盒。
DNA提取的几种方法(1).浓盐法A. 利用RNA和DNA在电解溶液中溶解度不同，将二者分离，常用的方法是用1M 氯纳抽提,得到的DNA粘液与含有少量蛋白质氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中,用2倍体积95%乙醇可将DNA 钠盐沉淀出来.B. 也可用0.15 MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNA,再以1MNaCL提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿---异醇法除去蛋白.两种方法比较,后种方法使核酸降解可能少一些.C.以稀盐酸溶液提取DNA 时,加入适量去污剂,如SDS可有助于蛋白质与DNA 的分离。
山羊脑多头蚴线粒体nad1基因的克隆及序列分析
山羊脑多头蚴线粒体nad1基因的克隆及序列分析汤国祥;刘笛秋【摘要】The objectives of the present study were to examine sequence variation in the mitochondrial NADH dehydrogen-ase subunit 1 (nadl)gene among Coenuruscerebralis isolates in Hunan province,and to reconstruct their phylogenetic relationship using nad sequences. The partial nadl (pnadl) vras amplified from each C. Cerebralis,and pnad1 sequences were aligned using the ClustalX 1. 81. MP and NJ trees of pnadl were constructed using the software Phylip 3. 67 version 4. 0 and Mage version 4.0,and ML tree was also constructed using Puzzle version 5. 2, sequence homology analysis was performed using the Megalign program of the software DNAStar version 5. 0. The results showed that the lengths of pnadl sequences were 430 bp. The constructed phylogenetic tree revealed that the Hunan isolates and the Taenia multiceps available in GenBank were clustered in the same clade. There is no significant variation in pnadl sequences within C. Cerebralis, while inter-species difference is obvious. It is concluded that pnadl sequences can be used as genetic marker for population genetic studies of cestodes. The results of the present study provided foundation for further studies of molecular epidemiology of C. Cerebralis,and for diagnosis of the resultant disease.%本研究旨在阐明脑多头蚴湖南分离株线粒体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脱氢酶亚单位1基因(nad1)部分序列(pnad1)的遗传变异情况,并用pnad1序列重构脑多头蚴与其他带科绦虫的种群遗传关系.利用聚合酶链反应(PCR)扩增脑多头蚴的pnad1,应用ClustalX 1.81程序对序列进行比对,再用Phylip3.67程序MP法和Mage4.0程序NJ法绘制种系发育树,并用Puzzle5.2程序构建最大似然树,同时利用DNAStar 5.0中的Megalign程序进行同源性分析.结果显示,所获得的pnad1序列长度分别均为430 bp,湖南分离株与已知多头带绦虫位于同一分枝.由于脑多头蚴pnad1序列种内相对保守,种间差异较大,故均可作为种间遗传变异研究的标记,从而为脑多头蚴的分子流行病学和其相关疾病的诊断奠定基础.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2011(038)009【总页数】4页(P87-90)【关键词】脑多头蚴;线粒体DNA;nad1基因;种系发育关系【作者】汤国祥;刘笛秋【作者单位】湖南省益阳市赫山区畜牧水产局,湖南益阳413000;湖南省益阳市赫山区畜牧水产局,湖南益阳413000【正文语种】中文【中图分类】Q78脑多头蚴（Coenurus cerebralis）又称脑包虫，是多头带绦虫（Taenia multiceps）的中绦期幼虫，主要寄生于牛、羊等反刍兽的大脑、脊髓等中枢神经系统，可引起致死性的脑多头蚴病，人也可感染此病（Avcioglu等，2011）。
promega+msi分析系统, 1.2 版本+产品使用说明说明书
技术手册MSI Analysis System, Version 1.2 MSI分析系统, 1.2版本MD1641产品使用说明MSI 分析系统，1.2 版本1. 产品介绍 (2)1.A. MSI 分析系统 .............................................................................................................................................. 2 1.B. 微卫星不稳定性（MSI ）简介 ................................................................................................................. 4 1.C. 内标（Internal Lane Standard 600， ILS 600） ........................................................................................ 4 2. 产品组分和储存条件 ............................................................................................................................................ 5 3. DNA 提取方法 ......................................................................................................................................................... 5 4. 用MSI 分析系统进行DNA 扩增 .. (6)4.A. 扩增体系的建立 ......................................................................................................................................... 6 4.B. 扩增循环参数的设置 ................................................................................................................................. 7 5. 使用ABI PRISM® 310遗传分析仪检测扩增片段 (9)5.A. Matrix 生成（或光谱校正） ...................................................................................................................... 9 5.B. 样品准备 ................................................................................................................................................... 10 5.C. 仪器准备 ................................................................................................................................................... 10 6. 用ABI PRISM® 3100遗传分析仪，用1.0.1或1.1版本的数据收集软件，检测扩增片段 (11)6.A. 光谱校正 ................................................................................................................................................... 11 6.B. 样品准备 ................................................................................................................................................... 12 6.C. 仪器准备 ................................................................................................................................................... 12 7. 使用ABI PRISM® 3100或3100-Avant 遗传分析仪，2.0版本的数据收集软件，或使用Applied Biosystems 3130或3130xl 遗传分析仪，检测扩增片段 ................................................................................................... 14 7.A. 光谱校正 ................................................................................................................................................... 15 7.B. 样品准备 ................................................................................................................................................... 15 7.C. 仪器准备 ................................................................................................................................................... 16 8. 数据分析 .. (17)8.A. MSI 分析概述 ............................................................................................................................................. 17 8.B. 将Panels 和Bins 文件导入GeneMapper®软件（4.0和4.1版本） ..................................................... 20 8.C. 用GeneMapper®软件（4.0和4.1版本）创建数据分析方法 .............................................................. 20 8.D. 创建片段大小标准（Size Standard ） ..................................................................................................... 22 8.E. 数据处理 ................................................................................................................................................... 23 8.F. 复审片段大小标准（Size Standard ） ...................................................................................................... 23 8.G. 复审样本数据分析 ................................................................................................................................... 23 9. 常见问题与解决方案 .......................................................................................................................................... 24 10. 附录 . (26)10.A. 相关产品 ................................................................................................................................................. 26 10.B. 单核苷酸重复基因座的等位基因频率 . (27)所有技术文献的英文原版均可在/protocols 获得。
法医DNA鉴定常用试剂盒
法医DNA鉴定常用试剂盒Applied Biosystems公司（美国）：1、Identifiler PCR扩增试剂盒英文名称：AmpF/STR® Identifiler® PCR Amplification Kit产品概述AmpF STR Identifiler PCR扩增试剂盒可以在单次PCR反应中同时扩增15个STR基因座和Amelogenin性别基因。
Identifiler试剂盒中进行复合扩增的四核苷酸位点包括CODIS所必需的13个核心STR位点，即CSF1PO、D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、FGA、TH01、TPOX、和vWA。
获得的数据可以满足ENFSI（欧洲法医学网）与Interpol（国际刑警组织）的要求。
另外两个四核苷酸位点（D2S1338与D19S433）与先前同FSS（英国法庭科学服务机构）联合开发的SGM Plus 扩增试剂盒相一致。
相比之前所有的AmpF STR试剂盒，包含了上述STR位点的Identifiler试剂盒是功能最强大的一个试剂盒。
6-FAM dye: CSF1PO, D7S820, D8S1179, D21S11VIC dye: D2S1338, D3S1358, D13S317, D16S539, TH01NED dye: D18S51, D19S433, TPOX, vWAPET dye: Amelogenin, D5S818, FGA特点：单管同时扩增16个位点，包括15个STR个体识别位点以及一个性别鉴定位点Amelogenin实验流程简单，一个反应管，一次进样，一个泳道分析采用与其他试剂盒完全相同的引物序列，不同试剂盒的结果具有可比性五色荧光技术，在维持扩增产物大小不变的条件下，有效提高了单个泳道分辨的片段数最大扩增产物小于350碱基，扩增容易，峰高均一提供完整的解决方案，由试剂、仪器、软件、技术支持等构成完整的体系2、Yfiler PCR扩增试剂盒英文名称：AmpF/STR® Yfiler® PCR Amplification Kit产品概述AmpF STR Yfiler PCR扩增试剂盒是一种能在单个PCR反应中复合扩增Y染色体上的17个STR 基因座的STR分析试剂盒。
Promega RNA 试剂盒(中文)
不要震荡混合 DNaseI 溶液
不要冻融 DNaseI 溶液超过三次。
RNA 裂解液 将 5ml 的 BME 加入到 250ml 的 RNA 加入ＢＭＥ后，即在瓶身上标注 BME 已加入。将ＲＮＡ
裂解液（RLA）中。
裂解液储存在４℃。每次使用后将盖子盖紧。
RNA 洗涤液 将 350ml 95％乙醇加进 206ml
加入乙醇后，在瓶身上标记乙醇已加。试剂在 22‐25℃稳
的浓缩ＲＮＡ洗涤溶液（ＲＷＡ）中。 定，拧紧瓶盖。
DNase 终止 向 26.5ml 浓缩的 DNase 终止液(DSA) 加入乙醇后，在瓶身上标记乙醇已加。试剂在 22‐25℃稳
液
中加入 40ml 95％乙醇。
定，拧紧瓶盖。
普洛麦格（北京）生物技术有限公司 电话：800 810 8133，010 58256268 网址：;
操作步骤：
要用这个系统得到最好的结果，请使用新鲜组织，储存的 组织得到的总 RNA 产量较低。如果必要，请在液氮中收集 样品，并立刻冻在－70℃将来再用。在 RNA 裂解缓冲液中 匀浆的样品可以存在‐20℃或‐70℃。如果样品珍贵，建议 每份样品都在‐70℃保存一份，以备当 RNA 纯化过程中样品 损失时用。由于 RNA 纯化试剂有毒性，而且 RNA 酶无处不
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SV Total RNA 分离纯化系统简明操作步骤（离心法）
3. 表 1. 推荐的制备裂解物所用的组织量
样品材料 30g 小鼠的器官大约湿重 每 175ul 裂解液可用最大组织量 每 ml 裂解液可用最大组织量 1
肝脏
940mg
30mg
171mg
肾脏
210mg
磁珠法DNA提取纯化试剂盒检测通则-编制说明
国家标准《磁珠法DNA提取试剂盒检测通则》编制说明（一）工作简况，包括任务来源、协作单位、主要工作过程、国家标准主要起草人及其所做的工作等；1、任务来源本标准根据国标委公布的2018 年第四批国家标准计划项目（国标委综合83 号），本项目计划编号为20184465-T-469 ，名称为磁珠法DNA提取试剂盒检测通则。
本标准由全国生化检测标准化技术委员会（SAC/TC 387）提出并归口。
本标准由联合起草。
2、目的和意义为适应高灵敏度、自动化操作的发展需求，磁珠法核酸提取由此诞生。
磁珠为拥有超顺磁性，表面经过了功能化修饰，在磁场中能够迅速聚集，离开磁场后又能够快速分散，能实现磁分离的均匀分散的一种磁性纳米级或者微米级球状或无定形颗粒物，其表面修饰有丰富的活性基团，可以和核酸分子在一定的缓冲条件下进行可逆地结合。
与传统的分离方法相比，磁珠用于生化样品复杂组分的分离，能够实现分离和富集的同时，有效地提高了分离速度和富集效率，同时也使分析检测的灵敏度大大提升。
磁珠与核酸的特异性结合使得提取的核酸纯度高，浓度大，样本需求量低，不需要苯酚和氯仿等毒性大的有机溶剂，提取步骤简单，不需离心，不仅可以满足大量规模提取的要求，还能实现自动化操作，具有传统核酸提取无法比拟的优势，是目前核酸制备的一个重要方向。
磁珠法核酸提取是一项将生物分子技术与纳米材料科学相结合的新型技术，是DNA提取纯化领域的一项重大突破，能从血液，动、植物组织，食品，土壤，粪便，唾液等样本中分离纯化DNA，已广泛应用于食品，法医，医疗等领域。
现国内磁珠法核酸提取产品厂家层出不穷，如海狸医学、英芮诚、惠尔纳米、新百基等，产品五花八门，质量参差不齐，市场较混乱。
且随着二代测序的兴起对自动化的需求越来越高，磁珠法核酸提取领域并没有相应的标准，加上，如动植物核酸提取、回收和小量血液基因组提取试剂盒的要求也都差异很大。
为规范磁珠法核酸提取试剂盒的质量，迫切需要建立其质量表征指标，规范其技术要求和测试方法。
药用野生稻基因组DNA_提取方法比较
药用野生稻基因组ＤＮＡ提取方法比较毕继安１，王芳１，张国芳１，朱宏芬１，沈岚１，郑红英２，严成其１∗㊀（１．宁波市农业科学研究院生物技术研究所，浙江宁波３１５１０１；２．宁波大学植物病毒学研究所，浙江宁波３１５２０１）摘要㊀以药用野生稻为试验材料，分别选用传统的ＣＴＡＢ提取法㊁ＣＴＡＢ改良方法㊁碱裂解法㊁磁珠法㊁吸附柱法㊁尿素提取法及酶消化法７种方法提取水稻叶片组织ＤＮＡ，７种方法分别标记为Ａ Ｇ㊂通过比较这些方法提取出ＤＮＡ的浓度和纯度，分析这些方法的优劣势㊂７种方法均能获得较好的基因组，按获得ＤＮＡ浓度表现为Ａ＞Ｂ＞Ｆ＞Ｃ＞Ｇ＞Ｅ＞Ｄ，纯度表现为Ｄ＞Ｅ＞Ｃ＞Ｇ＞Ｂ＞Ｆ＞Ａ㊂综合考量ＤＮＡ的纯度㊁浓度㊁提取时间㊁成本㊁安全无毒等方面因素，若对基因组的质量要求不高，只是做简单的检测且考虑成本问题，可以选择ＣＴＡＢ提取法㊁ＣＴＡＢ改良方法和尿素提取法；若需要高纯度基因组，可以选择磁珠法㊁吸附柱法㊁碱裂解法；若考虑安全无毒㊁快速提取及成本可控，可以选择磁珠法㊁吸附柱法；若样品稀有，可以选用ＣＴＡＢ提取法和ＣＴＡＢ改良法㊂关键词㊀药用野生稻；叶片；基因组；提取方法；有利基因中图分类号㊀Ｓ５１１㊀㊀文献标识码㊀Ａ㊀㊀文章编号㊀０５１７－６６１１（２０２３）１４－００８６－０４ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．０５１７－６６１１．２０２３．１４．０２１㊀㊀㊀㊀㊀开放科学（资源服务）标识码（ＯＳＩＤ）：ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆＤｉｆｆｅｒｅｎｔＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＭｅｔｈｏｄｓｏｆＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡｆｒｏｍＯｒｙｚａｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓＢＩＪｉ⁃ａｎ，ＷＡＮＧＦａｎｇ，ＺＨＡＮＧＧｕｏ⁃ｆａｎｇｅｔａｌ㊀（ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＮｉｎｇｂｏＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅ，Ｎｉｎｇｂｏ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ３１５１０１）Ａｂｓｔｒａｃｔ㊀ＷｉｔｈＯｒｙｚａｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓａｓｔｅｓｔｍａｔｅｒｉａｌ，ｓｅｖｅｎｍｅｔｈｏｄｓｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｅｘｔｒａｃｔｔｈｅｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｆｒｏｍｔｈｅＯｒｙｚａｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣＴＡＢｍｅｔｈｏｄ，ｉｍｐｒｏｖｅｄＣＴＡＢｍｅｔｈｏｄ，ａｌｋａｌｉｎｅｌｙｓｉｓｍｅｔｈｏｄ，ｍａｇｎｅｔｉｃｂｅａｄｍｅｔｈｏｄ，ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎｃｏｌｕｍｎｍｅｔｈｏｄ，ｕｒｅａｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄａｎｄｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ．ＴｈｅｓｅｖｅｎｍｅｔｈｏｄｓａｒｅｌａｂｅｌｅｄＡ－Ｇ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＢｙｃｏｍｐａｒｉｎｇｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｔｙｏｆＤＮＡｅｘｔｒａｃｔｅｄｂｙｔｈｅｓｅｍｅｔｈｏｄｓ，ｔｈｅａｄｖａｎｔａｇｅｓａｎｄｄｉｓａｄｖａｎｔａｇｅｓｏｆｔｈｅｓｅｍｅｔｈｏｄｓｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄ．ＡｌｌｓｅｖｅｎｍｅｔｈｏｄｓｃａｎｏｂｔａｉｎｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ．ＴｈｅｏｒｄｅｒｏｆｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｆｒｏｍｈｉｇｈｔｏｌｏｗｉｓＡ＞Ｂ＞Ｆ＞Ｃ＞Ｇ＞Ｅ＞Ｄ，ａｎｄｔｈｅｏｒｄｅｒｏｆｐｕｒｉｔｙｆｒｏｍｈｉｇｈｔｏｌｏｗｉｓＤ＞Ｅ＞Ｃ＞Ｇ＞Ｂ＞Ｆ＞Ａ．Ｃｏｎｓｉｄｅｒｉｎｇｔｈｅｐｕｒｉｔｙ，ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｔｉｍｅ，ｃｏｓｔ，ｓａｆｅｔｙａｎｄｎｏｎ⁃ｔｏｘｉｃｉｔｙｏｆｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓ，ＣＴＡＢｏｒＣＴＡＢｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｅｘｔｒａｃｔｉｏｎａｎｄｕｒｅａｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｍａｙｂｅｐｒｅｆｅｒｒｅｄａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｃｏｓｔａｎｄｐｕｒｉｔｙ．Ｔｈｅｍａｇｎｅｔｉｃｂｅａｄ，ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎｃｏｌｕｍｎａｎｄａｌｋａｌｉｎｅｌｙｓｉｓｍｅｔｈｏｄｉｓｐｒｅｆｅｒｒｅｄｗｈｅｎｈｉｇｈ⁃ｐｕｒｉｔｙａｒｅｒｅｑｕｉｒｅｄ．Ｔｈｅｍａｇｎｅｔｉｃｂｅａｄａｎｄａｄｓｏｒｐｔｉｏｎｃｏｌｕｍｎｍｅｔｈｏｄｉｓｐｒｅｆｅｒｒｅｄｗｈｅｎｓａｆｅｔｙ，ｎｏｎ⁃ｔｏｘｉｃｉｔｙ，ｒａｐｉｄｅｘｔｒａｃ⁃ｔｉｏｎａｎｄｃｏｓｔｌｉｔｔｌｅａｒｅｒｅｑｕｉｒｅｄ，ｗｈｉｌｅｔｈｅＣＴＡＢａｎｄＣＴＡＢｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｉｓｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄｆｏｒｌｉｍｉｔｅｄｓａｍｐｌｅｓ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ㊀Ｏｒｙｚａｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ；Ｌｅａｆ；Ｇｅｎｏｍｅ；Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ；Ｆａｖｏｒａｂｌｅｇｅｎｅｓ基金项目㊀宁波市农业科学研究院院长基金项目（２０２２ＮＫＹＰ００５）；宁波市科技创新２０２５重大专项（２０２１Ｚ１０６）；宁波市科技创新２０２５重大专项（２０１９Ｂ１０００４）㊂作者简介㊀毕继安（１９８７ ），男，山东青岛人，博士，从事抗病育种研究㊂∗通信作者，研究员，博士，从事抗病育种研究㊂收稿日期㊀２０２２－０８－０８㊀㊀药用野生稻多生长于海拔６００ １１００ｍ丘陵山坡中下部的冲积地和沟边，为喜暖㊁喜雨㊁喜潮湿的短日照植物，适宜在阴蔽㊁腐殖质丰富㊁ｐＨ为６左右的肥沃砂壤土上生长㊂药用野生稻在稻属２２个种中长势最强，是普通栽培稻的２０倍以上，在进化过程中，药用野生稻形成了丰富的遗传多样性，药用野生稻因长期处于野生环境，经受各种自然灾害和地理生态因素的考验，形成了较强的抗性和耐受不良环境因素等方面的优异性状，是天然的基因库㊂药用野生稻农艺性状具有大穗㊁宽叶片㊁粗茎秆等性状，为遗传改良提供了良好的资源条件㊂因此，深入挖掘药用野生稻的优良基因对于新种质创新具有重要意义㊂①大量的抗病基因㊂有研究人员通过对抗病基因的克隆以及高抗条纹叶枯病水稻材料的获得，使药用野生稻资源得到了充分利用，更进一步推动了药用野生稻抗病基因的开发与研究［１］㊂水稻白叶枯病是水稻生长发育过程中常见的病害，而药用野生稻具有大量的优异抗性基因，因此从药用野生稻中挖掘抗白叶枯病基因并加以利用，得到了广大科研工作者的高度重视㊂研究发现，云南药用野生稻多个居群类型对４种主要病害存在一定抗性［２－３］，云南药用野生稻种质资源对当地一定时期流行的白叶枯病小种及国内外部分强致病菌整体抗性较好［４］，这些研究为药用野生稻的有效抗病基因挖掘奠定了基础㊂②创制新种质资源㊂研究发现，利用构建药用野生稻ＴＡＣ文库筛选有利基因并通过克隆㊁遗传转化方法及结合育种技术，有望实现药用野生稻在新种质资源上的创制［５－７］㊂同时，栽培稻与药用野生稻种间杂种体内异源基因组重组引起的ＤＮＡ甲基化变异规律为不对称体细胞杂交的基因融合奠定了基础［８］，有研究发现，将药用野生稻总ＤＮＡ通过穗茎注射法导入恢复系Ｒ２２５可以创制耐阴㊁耐光氧化的水稻新种质［９］㊂③优异内源基因的挖掘㊂有研究表明，云南药用野生稻净光合速率较高，其在羧化效率和光饱和点上所表现出的高光效潜能为探索机体高光效基因提供了理论依据［１０－１１］㊂药用野生稻中淀粉合成酶基因在同属内的自然进化规律的探索，也为水稻的遗传育种和品质改良提供科学依据［１２－１３］㊂④抗逆途径基因挖掘㊂有研究人员通过基于药用野生稻干旱胁迫转录组数据分析探索ＡＤＦ基因对药用野生稻非生物胁迫的影响［１４］，同时还有研究表明，药用野生稻中ＬＥＡ蛋白在植物抗逆反应起着重要的作用，这为水稻遗传改良提供重要的理论依据［１１，１５］㊂上述研究说明药用野生稻中药用野生稻中存在大量㊁有利㊁可挖掘的基因，是种质创新的有利基因库，而组织样品的提取方法还不够完善与全面，这将会导致存在部分有利基因片段获取不够完整，因此选择一种合适的方法提取药用野生稻基因组ＤＮＡ对于有利基因的深入挖掘至关重㊀㊀㊀安徽农业科学，Ｊ．ＡｎｈｕｉＡｇｒｉｃ．Ｓｃｉ．２０２３，５１（１４）：８６－８９要㊂药用野生稻因其生理结构特征比栽培稻较为复杂，其基因组提取相对困难，提取质量相对偏低，因此对药用野生稻ＤＮＡ提取方法进行探索，优化提取步骤，为获得更加合适㊁更加完整的基因组结构提供理论依据㊂笔者以药用野生稻为素材，综合采用７种方法来提取植物的基因组，比较各种方法所提取的基因组含量与纯度，旨在为后序深入挖掘药用野生稻的有利基因提供技术依据㊂１㊀材料与方法１．１㊀试验材料㊀药用野生稻为该试验培育，准备药用野生稻相同叶位的７组样品，每组样品准确称取０．６ｇ，然后三等分㊂主要试剂：聚乙烯吡咯烷酮（生工生物工程（上海）股份有限公司，中国），β－巯基乙醇（索莱宝生物科技有限公司，中国），ＰｒｏｔｅｉｎＫ（索莱宝生物科技有限公司，中国），磁珠（美国Ｐｒｏｍｅｇａ公司，ＵＳ），ＤＮＡ提取试剂盒（ＱＩＡＧＥＮ，Ｇｅｒｍａｎｙ），Ｒ－淀粉酶（美国Ｓｉｇｍａ公司，ＵＳ）㊂主要仪器：组织研磨仪（Ｔｉｓｓｕｅｌｙｓｅｒ－９６，上海净信实业发展有限公司），离心机（５４２４Ｒ，德国艾本德股份公司），恒温水浴锅（ＤＫ－８Ｄ，上海一恒科学仪器有限公司），超微量紫外分光光度计（ＮａｎｏＤｒｏｐＯｎｅＣ，ＵＳ）㊂１．２㊀试验方法１．２．１㊀基于ＣＴＡＢ的经典ＤＮＡ提取方法㊂①取０．２ｇ水稻叶片组织于液氮中研磨成细粉状，并将粉末快速转移到２ｍＬ离心管中㊂②加入５００μＬ提取缓冲液［２％ＣＴＡＢ，１００ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４），５０ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ（ｐＨ８．０），１．４ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ，０．２％β－巯基乙醇］，颠倒混合均匀离心管，将混合物置于６５ħ水浴中孵育３０ｍｉｎ，每隔１０ｍｉｎ颠倒混匀一次㊂③将离心管置于离心机中，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ㊂转移离心管中上层液体到新的１．５ｍＬ离心管中㊂④加入２００μＬ苯酚ʒ氯仿ʒ异戊醇（２５ʒ２４ʒ１）到离心管中并颠倒混合均匀，于室温静置５ｍｉｎ，将离心管置于离心机中，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，转移离心管中上层液于新的１．５ｍＬ离心管中㊂⑤加入２００μＬ氯仿ʒ异戊醇（２４ʒ１）溶液轻轻颠倒混匀，于室温静置５ｍｉｎ后，将其置于离心机中，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，转移离心管的上层液体到新的１．５ｍＬ离心管中㊂⑥加入２倍体积的冷乙醇（预先于－２０ħ保存），轻混匀，并转移到－２０ħ冰箱中静置３０ｍｉｎ㊂⑦将离心管置于离心机中，１４０００ｒ／ｍｉｎ离心２ｍｉｎ，弃上清㊂⑧加入洗涤缓冲液（７０％乙醇，１０ｍｍｏｌ／Ｌ醋酸铵），重悬沉淀，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１ｍｉｎ，弃上清㊂重复该操作步骤一次㊂⑨将沉淀置于空气中干燥并用１００μＬ超纯水将其溶解，并将其置于３７ħ水浴锅中孵育３０ｍｉｎ㊂最后将其置于－２０ħ冰箱中备用或用于后续试验［１６－１７］㊂１．２．２㊀基于ＣＴＡＢ提取ＤＮＡ方法的改良㊂①取０．２ｇ水稻叶片和０．１ｇ聚乙烯吡咯烷酮于液氮中研磨成粉末㊂②将粉末转移至２ｍＬ离心管中㊂随后将１ｍＬ预冷提取缓冲液（１００ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－ＨＣｌ㊁５０ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ㊁５００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ和２％β－巯基乙醇，最终调节ｐＨ至８．０）加入离心管中，涡旋振荡混合物，并在室温下静置１０ｍｉｎ㊂然后将离心管于４ħ１２０００ｒ／ｍｉｎ下离心１０ｍｉｎ，弃上清㊂③将沉淀悬浮于１ｍＬ预热的提取缓冲液中（３％ＣＴＡＢ㊁１．４ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ㊁１００ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－ＨＣｌ㊁０．５ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ和２％β－ＭＥ，ｐＨ为８ ０），与此同时加入２０μＬＰｒｏｔｅｉｎＫ并将混合物于６５ħ水浴下孵育至少１ｈ，同时每隔２０ｍｉｎ颠倒混匀一次，然后将混合物于４ħ１２０００ｒ／ｍｉｎ下离心１０ｍｉｎ㊂④将上清液转移到新的２ｍＬ离心管中，然后向离心管中加入等体积的氯仿ʒ异戊醇（２４ʒ１）㊂颠倒混匀后置于室温下静置１０ｍｉｎ，然后于４ħ１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ㊂⑤将水相转移到新的２ｍＬ离心管中㊂加入大约１／１０体积的２．５ｍｏｌ／ＬＫＡＣ溶液（ｐＨ５．２）㊂⑥将上层水相转移到另一个新的２ｍＬ管中，加入１／３体积的冰异丙醇溶液㊂将离心管静置于－２０ħ冰箱中３０ｍｉｎ，随后在４ħ１２０００ｒ／ｍｉｎ下离心１０ｍｉｎ㊂⑦弃上清，用多糖㊁多酚洗涤缓冲液（含５０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－ＨＣｌ㊁５ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ㊁３５０ｍｍｏｌ／Ｌ山梨糖醇，ｐＨ８．０）洗涤１次㊂⑧弃掉上清液，将含有ＤＮＡ的白色沉淀用７０％乙醇洗涤２次，自然环境干燥㊂⑨将最终的ＤＮＡ沉淀用１００μＬ超纯水溶解［１８－１９］㊂１．２．３㊀碱裂解法㊂①取０．２ｇ水稻叶片组织于液氮中研磨成细粉状，接着将其转移到２ｍＬ离心管中㊂②在离心管中加入１００μＬ碱性裂解试剂［２５ｍｍｏｌ／ＬＮａＯＨ和０．２ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ（ＰＨ８．０）］，随后添加１００μＬ缓冲试剂［４０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ５）］并混匀，静置２ｍｉｎ㊂③将离心管置于离心机中１２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，取上清液㊂④上清液中加入２０μＬ蛋白酶Ｋ（２０ｍｇ／ｍＬ）及５μＬＲＮａｓｅ（１０ｍｇ／ｍＬ）后于３７ħ水浴锅中孵育３０ｍｉｎ，再将其置于６５ħ水浴锅孵育１０ｍｉｎ㊂⑤加入２００μＬ氯仿ʒ异戊醇（２４ʒ１）溶液并轻轻颠倒混匀，静置５ｍｉｎ后，将其置于离心机中，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，转移离心管中的上层液体到新的１．５ｍＬ离心管中㊂⑥加入２倍体积的冷乙醇（预先于－２０ħ保存），轻混匀，并于－２０ħ冰箱中静置３０ｍｉｎ㊂⑦将离心管置于离心机中，１４０００ｒ／ｍｉｎ离心２ｍｉｎ，弃上清㊂⑧加入７０％乙醇溶液重悬沉淀，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１ｍｉｎ，弃上清；重复该操作步骤１次㊂⑨室温条件下晾干沉淀，加入１００μＬ超纯水充分溶解，保存于－２０ħ冰箱中待用［２０］㊂１．２．４㊀磁珠法㊂①取０．２ｇ水稻叶片组织于液氮中研磨成粉末，并将粉末转移到２ｍＬ离心管中，并加入１ｍＬ裂解缓冲液（２％ＣＴＡＢ㊁２．５ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ㊁０．１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－ＨＣｌ㊁２０ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ），颠倒混匀㊂②将上述混合物通过０．２２μｍ过滤器，转移到新２ｍＬ离心管中，在滤液中加入８００μＬ异丙醇和５０μＬ蛋白酶Ｋ，充分混匀㊂③在滤液中加入２０μＬ磁珠原液并涡旋３ ４ｍｉｎ，静置１ｍｉｎ㊂④将混合物置于磁力架沉淀磁珠，弃去上清中不含磁珠的液体㊂⑤磁珠用１ｍＬＣＷ１缓冲液（含７ｍｏｌ／Ｌ盐酸胍的５０％异丙醇溶液）进行清洗㊂⑥磁珠再用１ｍＬＣＷ２缓冲液（７５％乙醇）洗涤２次㊂随后室温放置５ｍｉｎ以蒸发残留的乙醇㊂⑦将３０μＬ洗脱缓冲液（１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ８．５，预热至５５ħ）加入磁珠中，随后在５５ħ水浴锅中孵育５ｍｉｎ，孵育期间每隔１ｍｉｎ涡旋２０ｓ㊂⑧将混合物置于磁力架上，吸取上清液备用［２１－２３］㊂７８５１卷１４期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀毕继安等㊀药用野生稻基因组ＤＮＡ提取方法比较１．２．５㊀吸附柱法㊂①取０．２ｇ水稻叶片组织置于研钵中，同时加入液氮充分研磨㊂②加入４４０μＬ缓冲液ＡＰ１，颠倒混匀材料，再加４μＬＲＮａｓｅ后，剧烈涡旋混匀㊂③将上述混合物在６５ħ下温浴１５ｍｉｎ，每隔５ｍｉｎ轻轻颠倒试管２ ３次㊂④加入１３０μＬ缓冲液ＡＰ２后，轻柔颠倒混匀，并将其置于冰上静置５ｍｉｎ㊂⑤将离心管置于离心机中，１４０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，缓慢吸取上层液体（５００μＬ）置于ＭｉｎｉＳｐｉｎＣｏｌｕｍ（柱）中，１４０００ｒ／ｍｉｎ离心１ｍｉｎ㊂⑥将上一步中的滤液（４５０μＬ）缓慢转移至一新的离心管中，并在溶液中缓慢加入１．５倍体积（６７５μＬ）的缓冲液ＡＰ３㊂⑦将上一步中混合液（包括形成的沉淀）转移至ＭｉｎｉＳｐｉｎＣｏｌｕｍ（柱）中，１４０００ｒ／ｍｉｎ离心１ｍｉｎ，丢弃废液㊂⑧在ＭｉｎｉＳｐｉｎＣｏｌｕｍ（柱）中加入５００μＬ缓冲液ＡＷ，放置３ ５ｍｉｎ，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１ｍｉｎ，弃掉废液㊂重复洗涤１次㊂⑨在ＭｉｎｉＳｐｉｎＣｏｌｕｍ（柱）中加入５００μＬ无水乙醇，放置３ ５ｍｉｎ，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心３ｍｉｎ，丢弃废液和收集管㊂⑩在ＭｉｎｉＳｐｉｎＣｏｌｕｍ（柱）下置１．５ｍＬ离心管，吸取１００μＬ超纯水加到Ｄｎｅａｓｙ膜上㊂６５ħ水浴锅中静置５ｍｉｎ，１４０００ｒ／ｍｉｎ离心１ｍｉｎ得到ＤＮＡ㊂１．２．６㊀尿素提取法㊂①利用液氮将０．２ｇ水稻叶片组织研磨成粉末，并转移到２ｍＬ离心管中㊂②在离心管中加入６００μＬ尿素提取液（４２ｇ尿素㊁７ｍＬ５ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ㊁５ｍＬ１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－ＨＣｌｐＨ８．０㊁４ｍＬ０．５ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡｐＨ８．０和５ｍＬ２０％Ｎａ－Ｎ－月桂酰肌氨酸，加入无菌蒸馏水调整最终体积至１００ｍＬ，温度不高于７０ħ）涡旋混匀，于室温下静置１ｈ㊂③将离心管置于离心机中，以１２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ㊂④取上清，加入等体积的苯酚ʒ氯仿（１ʒ１）溶液，涡旋混匀离心管㊂⑤将离心管置于预冷的４ħ离心机中，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ㊂⑥取上清液，加入等体积的异丙醇溶液，颠倒混匀，于４ħ环境静置１ｈ㊂⑦将离心管置于预冷的４ħ的离心机中，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ㊂⑧弃上清，真空干燥沉淀２ｍｉｎ㊂⑨用１００μＬＴＥ缓冲液（１ｍＬ１．０ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－ＨＣｌ和０．２ｍＬ０．５ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ，调节ｐＨ到８．０，并用无菌水定容至１００ｍＬ）溶解沉淀，待用［２４－２５］㊂１．２．７㊀酶消化法㊂①取０．２ｇ水稻组织叶片在液氮中充分研磨后加入３００μＬ缓冲液［含０．１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）和０．１ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ］，并涡旋振荡混匀㊂②在上述溶液中加入１０μＬＲ－淀粉酶（Ｓｉｇｍａ，ＵＳ），颠倒混匀，于８０ħ恒温金属浴中孵育１ｈ㊂③加入３３μＬ２％ＳＤＳ㊁２０μＬＰｒｏｔｅｉｎＫ和１μＬＲＮａｓｅＡ，并将其置于５５ħ恒温金属浴中孵育１ｈ㊂④加入３００μＬ苯酚ʒ氯仿ʒ异戊醇（２５ʒ２４ʒ１）溶液，剧烈涡旋振荡２ｍｉｎ㊂⑤将上述溶液于１５０００ｒ／ｍｉｎ离心１ｍｉｎ，转移上清溶液至２．０ｍＬ离心管中，随后加入２倍体积预冷乙醇并置于冰上静置１５ｍｉｎ㊂⑥将离心管置于预冷的离心机中，４ħ１５０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，弃上清㊂⑦离心管中加入５００μＬ预冷的７０％乙醇，洗涤沉淀，４ħ，１５０００ｒ／ｍｉｎ离心１ｍｉｎ㊂重复１遍㊂⑧弃上清，室温下风干沉淀，加入１００μＬ超纯水溶解沉淀，待用［２６－２８］㊂２㊀结果与分析２．１㊀水稻基因组浓度㊀采用７种方法得到水稻叶片的基因组后，利用超微量紫外分光光度计测量其浓度，具体数值见表１，不同提取方法得到的ＤＮＡ浓度存在差异，浓度由高到低依次为Ａ＞Ｂ＞Ｆ＞Ｃ＞Ｇ＞Ｅ＞Ｄ，通过ＣＴＡＢ法获得的基因组ＤＮＡ可能存在与植物组织中少量的糖类及淀粉或其他物质结合，因此在测量过程中存在一定偏差，导致浓度偏高；而通过磁珠法提取的基因组，因其是在外磁场的作用下纳米磁性微球与核酸结合，磁场大小及磁性微球的特性决定其结合能力，因此浓度偏低一些㊂２．２㊀水稻基因组纯度㊀核酸纯度一般用Ａ２６０／Ａ２３０和Ａ２６０／Ａ２８０来表示㊂其中，２６０ｎｍ是核酸最高吸收峰的吸收波长，２３０ｎｍ是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长，２８０ｎｍ是蛋白最高吸收峰的吸收波长㊂高纯度的ＤＮＡ其Ａ２６０／Ａ２８０比值大于１．８，如果比值小于１．８，表示受到蛋白（芳香族）或酚类物质的污染，需要对样品进行纯化；同时ＤＮＡ纯度的另一个指标为Ａ２６０／Ａ２３０，如果Ａ２６０／Ａ２３０的比值大于１．８，说明纯度较高，如果小于１．８，表示样品被碳水化合物（糖类）㊁盐类或有机溶剂污染，需要对样品进行纯化㊂根据测定结果来看，这些方法提取的ＤＮＡ纯度均较高，纯度表现为Ｄ＞Ｅ＞Ｃ＞Ｇ＞Ｂ＞Ｆ＞Ａ（表１）㊂从纯度数据来看，利用磁珠法提取的基因组纯度最高㊂表１㊀不同提取方法的样品浓度及纯度比较Ｔａｂｌｅ１㊀Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｔｙｂｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｅｘｔｒａｃ⁃ｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓｏｆｓａｍｐｌｅ提取方法Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ样品平均浓度Ａｖｅｒａｇｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｓａｍｐｌｅｓʊｎｇ／μＬＡ２６０／Ａ２３０Ａ２６０／Ａ２８０Ａ１８１６．２８６１．８５０１．８７８Ｂ１６０３．５７７１．９０５１．８９６Ｃ１５８５．３０２１．９８５１．９３６Ｄ１１３１．６６７２．０２３２．１３３Ｅ１２４９．０２４１．９７８２．００５Ｆ１５８７．４９９１．８７６１．８６８Ｇ１３２８．３６９１．９６１１．９０６３㊀讨论对以上７种方法提取的基因组ＤＮＡ浓度及纯度进行测定，发现经典ＣＴＡＢ提取方法提取的浓度及纯度较高，适合一般性试验需要，但在试验过程中会用到含有氯仿的有毒试剂，且耗时较长，这需要试验人员规范操作；基于ＣＴＡＢ的改良方法，提取过程中会使用蛋白酶Ｋ，这样会有效酶解与核酸结合的组蛋白，使ＤＮＡ游离在溶液中，且ＥＤＴＡ等螯合剂均不能使之失活，这样提取出的ＤＮＡ纯度会更高一些；利用碱裂解法提取的叶片组织效果和ＣＴＡＢ相差不大，在裂解植物组织方面效果较好，尤其是在提取纤维素较多的根部㊁茎部优势较为明显；磁珠法提取基因组ＤＮＡ在前期裂解上使用的是ＣＴＡＢ试剂，但是在纯化的过程中利用了磁珠的优势，使其能在微观界面上与核酸分子特异性地识别和高效结合，并利用二氧化硅包被的纳米磁性微球的超顺磁性，在８８㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀安徽农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀２０２３年Ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ盐（盐酸胍㊁异硫氰酸胍等）和外加磁场的作用下，能从样本中分离出纯度较高的基因组ＤＮＡ，可用于后续分子杂交试验，但是价格较昂贵㊂吸附柱法是在离心吸附柱内使用一种硅基质滤膜，这种滤膜在低ｐＨ㊁高浓度盐存在的条件下，可以选择性吸附ＤＮＡ片段，而蛋白和其他杂质不会被吸附㊂通过这种方法提取出的ＤＮＡ浓度相对其他方法较低，有一定量的ＤＮＡ损失，但是纯度相对较高，减少了有毒试剂的使用，提取时间也相对较短；尿素提取法操作过程比较温和，不需要剧烈的振荡及高温的处理，不易造成ＤＮＡ变性降解；酶消化法提取的ＤＮＡ可以轻松地去除植物组织中的淀粉和糖原，用这种方法提取的ＤＮＡ能避免了基因组中淀粉及糖原的干扰，使ＤＮＡ的纯度会更高一些，利于基因组获取更加全面与完整㊂因此，需要根据试验材料㊁目的以及后续研究需要综合评估选用适宜的提取纯化方法，在得率与纯度间取得平衡㊂该研究比较了７种不同ＤＮＡ提取方法，为后续开展药用野生稻基因组的分离及其功能研究奠定基础㊂４ 结论药用野生稻作为我国的主要野生稻物种，因其体内含有大量未知功能的有利基因，近些年得到了较为广泛的研究㊂笔者比较了不同提取野生稻基因组ＤＮＡ方法，综合各方面因素考量，若只需简单的检测且考虑成本问题，可以选择ＣＴＡＢ提取法㊁ＣＴＡＢ改良方法和尿素提取法，但在使用过程中会用到较毒的有机试剂，提取过程需小心谨慎；如需要高纯度基因组可以选择磁珠法㊁吸附柱法㊁碱裂解法；若考虑安全无毒㊁快速提取及成本可控可以选磁珠法㊁吸附柱法；若样品稀有可以选用ＣＴＡＢ提取法和ＣＴＡＢ改良法㊂通过比较这些方法的优劣势，可以为满足不同试验需要选择高效㊁简便㊁安全无毒㊁低成本的最优ＤＮＡ提取方法提供了一定理论依据，同时也为指导水稻不同组织部位ＤＮＡ的提取提供了参考价值，进一步为开发与优化快速提取药用野生稻基因组ＤＮＡ提供理论指导㊂参考文献［１］董岩，钱长根，张维林，等．药用野生稻体细胞杂交后代对条纹叶枯病的抗性鉴定［Ｊ］．生物技术通讯，２０１３，２４（５）：６８２－６８４．［２］杨雅云，张敦宇，陈玲，等．云南药用野生稻对四种水稻主要病害的抗性鉴定［Ｊ］．植物病理学报，２０１９，４９（１）：１０１－１１２．［３］杨士杰药用野生稻杂交后代对稻瘟病的抗性［Ｊ］．湖北农业科学，２０１７，５６（３）：４１５－４１７．［４］陈玲，张敦宇，陈越，等．云南药用野生稻种质资源的白叶枯病抗性评价［Ｊ］．南方农业学报，２０１９，５０（７）：１４１７－１４２５．［５］刘蕊，张欢欢，陈志雄，等．筛选和转化药用野生稻ＴＡＣ克隆获得耐旱水稻［Ｊ］．中国农业科学，２０１４，４７（８）：１４４５－１４５７．［６］苏龙，徐志健，乔卫华，等．广西药用野生稻遗传多样性分析及ＳＳＲ引物数量对遗传多样性结果的影响研究［Ｊ］．植物遗传资源学报，２０１７，１８（４）：６０３－６１０．［７］张霞，景翔，周光才，等．药用野生稻ＧＢＳＳ基因的系统发育及组织特异性表达［Ｊ］．植物学报，２０１９，５４（３）：３４３－３４９．［８］何平，疏冕，蔡晓丹，等．栽培稻ˑ药用野生稻种间杂种基因组ＤＮＡ甲基化的遗传与变异研究［Ｊ］．华北农学报，２０１７，３２（４）：１９－３１．［９］韩义胜，严小微，唐清杰，等．利用药用野生稻培育耐光氧化和耐荫水稻新种质的研究［Ｊ］．广东农业科学，２０１４，４１（８）：２２－２５．［１０］柯学，殷富有，肖素勤，等．云南药用野生稻的高光效特性［Ｊ］．中国稻米，２０１５，２１（４）：７２－７６．［１１］张大燕，李红梅，李培纲，等．药用野生稻ＯｏＬＥＡ１基因的克隆和生物信息学分析［Ｊ］．分子植物育种，２０１７，１５（５）：１５９７－１６０２．［１２］景翔．药用野生稻中淀粉合成酶基因家族的进化［Ｄ］．曲阜：曲阜师范大学，２０１６．［１３］郭辉，陈灿，张晓丽，等．广西野生稻耐冷性鉴定与遗传纯合研究［Ｊ］．西南农业学报，２０１７，３０（６）：１２４５－１２５０．［１４］李培纲，李红梅，张帅，等．药用野生稻ＡＤＦ基因的克隆及其抗逆性分析［Ｊ］．华北农学报，２０１７，３２（６）：３７－４４．［１５］王玲仙，王波，陈越，等．云南药用野生稻幼穗离体培养研究［Ｊ］．中国稻米，２０２０，２６（２）：４９－５３．［１６］ＯＨＴＳＵＢＯＫ，ＳＵＺＵＫＩＫ，ＨＡＲＡＧＵＣＨＩＫ，ｅｔａｌ．Ｎｏｖｅｌｍｅｔｈｏｄｆｏｒｐｒｅｐａ⁃ｒａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｔｅｍｐｌａｔｅＤＮＡａｎｄｓｅｌｅｃｔｉｏｎｏｆｐｒｉｍｅｒｓｔｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｔｈｅｍａｔｅｒｉａｌｒｉｃｅｃｕｌｔｉｖａｒｓｏｆｒｉｃｅｗｉｎｅｂｙＰＣＲ［Ｊ］．ＪＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓＭｅｔｈ⁃ｏｄｓ，２００８，７０（６）：１０２０－１０２８．［１７］李娥贤，殷富有，张敦宇，等．云南药用野生稻高质量染色体ＤＮＡ的制备［Ｊ］．作物杂志，２０２０（５）：１０３－１０９．［１８］ＡＢＤＥＬ⁃ＬＡＴＩＦＡ，ＯＳＭＡＮＧ．ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｔｈｒｅｅｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｅｘｔｒａｃ⁃ｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓｔｏｏｂｔａｉｎｈｉｇｈＤＮＡｑｕａｌｉｔｙｆｒｏｍｍａｉｚｅ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＭｅｔｈｏｄｓ，２０１７，１３：１－９．［１９］ＷＥＮＧＱ，ＬＩＪ，ＬＩＵＸＨ，ｅｔａｌ．ＥｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆｔｏｔａｌＤＮＡａｎｄｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＲＡＰＤｒｅａｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｉｎＤｉｏｓｃｏｒｅａｏｐｐｏｓｉｔａＴｈｕｎｂ．［Ｊ］．ＧｅｎｅｔＭｏｌＲｅｓ，２０１４，１３（１）：１３３９－１３４７．［２０］ＮＡＲＵＳＨＩＭＡＪ，ＫＩＭＡＴＡＳ，ＳＯＧＡＫ，ｅｔａｌ．ＲａｐｉｄＤＮＡｔｅｍｐｌａｔｅｐｒｅｐａｒａ⁃ｔｉｏｎｄｉｒｅｃｔｌｙｆｒｏｍａｒｉｃｅｓａｍｐｌｅｗｉｔｈｏｕｔｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｆｏｒｌｏｏｐ⁃ｍｅｄｉａｔｅｄｉｓｏ⁃ｔｈｅｒｍａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）ｏｆｒｉｃｅｇｅｎｅｓ［Ｊ］．ＢｉｏｓｃｉＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＢｉｏ⁃ｃｈｅｍ，２０２０，８４（４）：６７０－６７７．［２１］ＹＵＡＮＱＢ，ＨＵＡＮＧＹＭ，ＷＵＷＢ，ｅｔａｌ．Ｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒａｎｄｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｆｒｅｅ＆ａｄｓｏｒｂｅｄａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｇｅｎｅｓｔｈｒｏｕｇｈａｗａｓｔｅｗａｔｅｒｔｒｅａｔｍｅｎｔｐｌａｎｔｂｙａｎｅｎｈａｎｃｅｄｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒＤＮＡｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｗｉｔｈｍａｇｎｅｔｉｃｂｅａｄｓ［Ｊ／ＯＬ］．ＥｎｖｉｒｏｎＩｎｔ，２０１９，１３１［２０２２－０３－１４］．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｅｎｖｉｎｔ．２０１９．１０４９８６．［２２］ＴＡＫＡＨＡＳＨＩＨ，ＴＡＫＡＫＵＲＡＣ，ＫＩＭＵＲＡＢ．Ａｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｒｅａｌ⁃ｔｉｍｅＰＣＲｍｅｔｈｏｄｆｏｒｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｂｏｔｕｌｉｎｕｍｔｙｐｅＡｉｎｒｉｃｅｓａｍｐｌｅｓ［Ｊ］．ＪＦｏｏｄＰｒｏｔ，２０１０，７３（４）：６８８－６９４．［２３］ＷＡＮＧＸＦ，ＣＨＥＮＹ，ＣＨＥＮＸＹ，ｅｔａｌ．ＡｈｉｇｈｌｙｉｎｔｅｇｒａｔｅｄｓｙｓｔｅｍｗｉｔｈｒａｐｉｄＤＮＡｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ａｎｄｌａｔｅｒａｌｆｌｏｗｂｉｏｓｅｎｓｏｒｆｏｒｏｎ⁃ｓｉｔｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙｍｏｄｉｆｉｅｄｃｒｏｐｓ［Ｊ］．ＡｎａｌＣｈｉｍＡｃｔａ，２０２０，１１０９：１５８－１６８．［２４］ＹＩＧ，ＣＨＯＩＪＨ，ＬＥＥＪＨ，ｅｔａｌ．Ｒａｐｉｄａｎｄｓｉｍｐｌｅｐｒｏｃｅｄｕｒｅｆｏｒｈｏｍｏｇｅ⁃ｎｉｚｉｎｇｌｅａｆｔｉｓｓｕｅｓｓｕｉｔａｂｌｅｆｏｒｍｉｎｉ⁃ｍｉｄｉ⁃ｓｃａｌｅＤＮＡｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｉｎｒｉｃｅ［Ｊ］．ＰｒｅｐＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００５，３５（３）：２５７－２６１．［２５］ＭＵＴＯＵＣ，ＴＡＮＡＫＡＫ，ＩＳＨＩＫＡＷＡＲ．ＤＮＡｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｆｒｏｍｒｉｃｅｅｎｄｏ⁃ｓｐｅｒｍ（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇａｐｒｏｔｏｃｏｌｆｏｒｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆＤＮＡｆｒｏｍａｎｃｉｅｎｔｓｅｅｄｓａｍ⁃ｐｌｅｓ）［Ｊ］．ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌＢｉｏｌ，２０１４，１０９９：７－１５．［２６］ＢＯＪＡＮＧＫＰ，ＫＵＮＡＡ，ＰＵＳＨＰＡＶＡＬＬＩＳＮＣＶＬ，ｅｔａｌ．ＥｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆＤＮＡｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｍｏｌｅｃｕｌａｒｔｒａｃｅａｂｉｌｉｔｙｉｎｃｏｌｄｐｒｅｓｓｅｄ，ｓｏｌｖｅｎｔｅｘｔｒａｃｔｅｄａｎｄｒｅｆｉｎｅｄｇｒｏｕｎｄｎｕｔｏｉｌｓ［Ｊ］．ＪＦｏｏｄＳｃｉＴｅｃｈｎｏｌ，２０２１，５８（９）：３５６１－３５６７．［２７］ＤＵＡＮＹＢ，ＺＨＡＯＦＬ，ＣＨＥＮＨＤ，ｅｔａｌ．ＡｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｅｘ⁃ｔｒａｃｔｉｏｎｐｒｏｔｏｃｏｌｆｏｒｐｒｅ⁃ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇｉｎｒｉｃｅ［Ｊ］．ＧｅｎｅｔＭｏｌＲｅｓ，２０１５，１４（２）：６３６９－６３７５．［２８］ＳＡＧＩＮ，ＭＯＮＭＡＫ，ＩＢＥＡ，ｅｔａｌ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｔｈｒｅｅｄｉｆｆｅｒ⁃ｅｎｔｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｒｉｃｅ（ＯｒｙｚａｓａｔｉｖａＬ．）ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ［Ｊ］．ＪＡｇｒｉｃＦｏｏｄＣｈｅｍ，２００９，５７（７）：２７４５－２７５３．９８５１卷１４期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀毕继安等㊀药用野生稻基因组ＤＮＡ提取方法比较。
promega 小提质粒提取说明书
Wizard○R Purefection Plasmid DNA Purification System protocol所用试剂盒为Promega公司的Wizard○R Purefection Plasmid DNA Purification System，能够去除对细胞有害的细菌内毒素。
具体操作步骤如下：（1）将5ml 培养过夜的阳性菌在室温(24℃)下10000×g离心10 min。
弃上清，将离心管倒置至吸水纸上去除剩余水分。
（2）加入250µl 重悬液，振荡至完全重悬。
（3）加入250µl细胞溶解液，颠倒离心管6～8次，彻底混匀。
室温孵育5min。
（4）加入350µl中和液，立即颠倒离心管6～8次，彻底混匀。
（5）室温下10000×g离心细菌溶解产物20min，上清移至新的1.5 ml 离心管，再次离心20 min，将上清移至新离心管。
（6）彻底摇匀除内毒素树脂，加50µl到离心管中，室温孵育10 min，在孵育过程中每隔3 min剧烈振荡5 sec。
（7）将离心管放置于磁珠分离架使溶液变清，颠倒磁珠分离架和离心管，去除附着在离心管壁和顶盖上的液体。
放置至液体澄清后30 sec，吸取上清至新离心管，弃去沉淀。
（8）加入200 µl GTC（5M/L），与上步分离的上清剧烈振荡混和。
如果GTC产生沉淀，37℃加温10min，冷却到25℃使用。
（9）彻底重悬磁珠，加150 µl至溶液中，剧烈振荡混和，室温孵育2～3 min。
（10）将离心管放置于磁珠分离架使溶液变清，颠倒磁珠分离架和离心管，去除附着在离心管壁和顶盖上的液体。
放置至液体澄清后30 sec，弃上清，离心管继续放置2～3min，去除剩余液体。
（11）将离心管从磁架上取出，加入200 µl 4/40洗脱液。
剧烈振荡15sec 重悬磁珠微粒。
4/40洗脱液可以去除无关蛋白，如核酸酶。
DNA提取教学课件ppt
提取病变组织的DNA可以进行疾病诊断和治疗 ，如癌症、遗传性疾病等的诊断和治疗方案的 制定。
分子生物学研究
DNA提取是分子生物学研究的基础，通过提取 DNA可以开展基因克隆、基因测序、分子标记 等研究工作。
dna提取的基本原理
细胞裂解
通过物理、化学或酶学方法将 细胞裂解，使细胞膜和细胞壁
提取DNA可以用于基因克隆、基因测序、分子标记等研究工
作，有助于深入探究生物学的奥秘。
亲子鉴定、犯罪鉴定
03
通过提取DNA可以进行亲子鉴定和犯罪鉴定，为司法鉴定提
供重要依据。
dna提取的发展历程
19世纪末期
DNA的发现和初步研究阶段，人们开始认识到DNA在遗传和细胞分裂中的重要性。
20世纪50年代至80年代
DNA提取是PCR技术的前提和基础，PCR技术需要以提取得到的DNA为模板 ，通过特定的引物进行扩增。
DNA提取与基因测序技术的关系
DNA提取是基因测序技术的重要步骤，只有经过有效的DNA提取，才能保证 测序结果的准确性。
dna提取技术的未来发展趋势
自动化和高通量
随着生物技术的发展，未来DNA提取技术将朝着自动化和高通量的方向发展，提 高提取效率和质量的同时，降低实验操作成本。
破裂，释放出其中的DNA。
沉淀与纯化
通过加入沉淀剂和纯化剂将DNA 从裂解液中沉淀出来，去除其中 的蛋白质、脂肪、糖类等杂质。
干燥和保存
将纯化后的DNA干燥并保存，以 便后续的分析和应用。
dna提取的应用
疾病诊断和治疗
01
通过提取病变组织的DNA，可以用于疾病诊断和治疗方案的
制定。
分子生物学研究
02
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PromegaDNA提取试剂盒的使用方法
一、使用前的准备工作
Proteinase k solution:用无核酸酶的水把蛋白酶K稀释成20mg/ml，按照自己的每次平均使用量分装，储存在-20℃，融化时要在冰上融化，反复冻融会降低Proteinase K的活性
消化液配制：在tube中混合下面各种反应物，使用前放在冰上。
Wizard SV Wash solution（洗脱液）的配制：按照瓶子标签上要求的量，添加95%的乙醇到Wizard sv solution 中，做上标记，室温保存。
PromegaDNA提取试剂盒的使用方法步骤（离心机法）
0、将Nuclease-Free Water 放在65℃的水浴锅中
1、剪取动物组织20mg，分成相同的2份，放在1.5ml的离心管中，
样品中决不能含有软骨组织，否则会阻塞柱子
2、每份样品中添加275ul先前准备的消化液，确保消化液能够完
全覆盖样品，如果不能覆盖，将样品再剪得小点
3、把样品放到55℃的水浴锅或加热块中孵育16-18小时（过夜），
蛋白酶K消化过夜后2000g离心，取上清液到1.5ml的离心管
中。
4、向样品中添加250ul的Wizard SV Lysis Buffer,漩涡混匀
5、处理后的产物尽快进行下面的操作，如果不能进行下面的操作，
应该把它放在-70℃下保存，使用时应该冻融或者放在55℃温
和解冻
6、将收集管做上标记，将柱子放在收集管上，把整个1.5ml离心
管内的溶解产物转移到柱子中。
13000g离心3分钟，目的是让
基因组吸附在柱子中，如果仍有残留液体，可以重新13000g
离心一分钟
7、倒掉收集管中的液体，把柱子重新放回收集管上
8、检查一下乙醇是否已经添加到Wizard SV Wash Solution中
9、每个样品中添加650ul的Wizard SV Wash Solution（真空抽
滤要加800ul），13000离心1分钟
10、去除溶液，将柱子重新放置在集合管中
11、重复9-10步3次，（一共需要洗4次）
12、洗剂结束后，清空收集管中的水13000g离心2分钟
13、去掉收集管，取相同数量的1.5ml的离心管做上标记，将柱子
将在 1.5ml的离心管上，添加250ul65℃的Nuclease-Free
Water 到柱子中，室温孵育2分钟，13000g离心1分钟（要溶液，勿扔）
14、再在柱子中添加250ul的Nuclease-Free water，室温孵育2
分钟，13000g离心1分钟
15、扔掉柱子，将收集的纯化的DNA储存在-20℃至-70℃。