2019年枯草芽孢杆菌菌悬液的制备
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枯草芽孢杆菌菌悬液的制备
B1.材料的准备
B1.1枯草芽孢杆菌
B1.2无菌稀释液
B1.2.1磷酸盐缓冲液（PBS）最终稀释液的浓缩液
a)将34gKH2PO4溶解于500ml蒸馏水中；
b)在25℃下用1mol/l的NaOH调节溶液，将a)的PH值调节至7.2±0.5；
c)用蒸馏水将b)稀释至1L。
B1.2.2磷酸盐缓冲液（PBS）最终稀释液
方法一：
a)蒸馏水——1L；
b)步骤1制得的PBS溶液备用——125mL；
c)用a)和b)溶液调配1L的PBS溶液，并调节该溶液的PH至7.2±0.5；
d)在120℃下将c)溶液高压灭菌15分钟。
e)可选择的(可加可不加)—硫酸镁（50gMgSO4·7H2O/每升蒸馏水）—5.0ml 方法二：
a)蒸馏水——1L；
b)步骤1制得的PBS溶液备用——1.25mL；
c)25℃下，用a)和b)溶液调配1L的PBS溶液，并调节该溶液的PH至
7.0±0.1；
d)在120℃下将c)溶液高压灭菌15分钟。
注意：当芽孢菌悬液要立即使用时，用方法二配制稀释液较好。如果需要在4℃条件下贮藏芽孢菌悬液，则用方法一配制较适宜。
B.2枯草芽孢杆菌的菌悬液的制备
（1）把先前获得的枯草芽孢杆菌或其冻干粉的再水合后的产物接种在250ml 无
菌的肉汤培养基上。
（2）37±0.5℃下在往复式摇床上培养48±2小时。
（3）在65±0.5℃下加热振动培养15分钟。
（4）把菌悬液转移到有螺纹盖的测试管中，并通过使用无菌蒸馏水以2500rpm
离心分离15min，如此至少洗涤三次。若需贮藏菌悬液，则还要使用PBS进行最后的洗涤。
（5）使用PBS和大豆琼脂通过标准稀释盘方法来确定芽孢浓度。由以上步骤培养出的芽孢其浓度应达到平均1.5×109/ml。
（6）培养皿在37±0.5℃下保温48±2小时。
（7）如果芽孢要被立即使用，则用PBS稀释芽孢菌悬液以获得浓度为5~8×108/ml芽孢菌悬液。
（8）为了贮藏备用芽孢培养基，将其等分并在4℃条件下把它们贮藏在无菌的有螺旋盖的管形瓶中，或在－70℃下冷冻贮藏。使用前，应通过表面涂覆和一种可接受的芽孢染色技术检查其活性。