第14章 核酸的理化性质

核酸的理化性质——核酸的水解
3、酶水解
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3`——N—N—N—N—C—T—T—A—A—G—N—N—N—N——5` E. coR I
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一、核酸的理化性质——核酸的水解
1、酸水解
核苷酸的糖苷键和磷酸二酯键均可被酸水解，但糖苷
键比磷酸二酯键更易被酸水解。
水解
水解
核酸的理化性质——核酸的水解
2、碱水解
RNA的磷酸键易被碱水解，产生核苷酸，DNA的磷酸键则不 易水解，因为RNA上2‘-OH基，在碱作用下易形成磷酸三酯 而易水解。
水解
核酸的理化性质——核酸的水解
核酸的理化性质——核酸的变性、复性与杂交
3、核酸的分子杂交
基因芯片（gene chip）是指将现代探针固相原位合成技术、 照相平板印刷技术、高分子合成技术等微电子技术与分子生 物学技术（如核酸杂交技术、PCR等）相结合，在一定狭小 的空间内实现高速度、高通量、集约化和低成本的基因分析 技术。它利用核酸双链的互补碱基之间的氢键作用，形成稳 定的双链结构，通过检测目的单链上的荧光信号，从而达到 一次试验同时检测多种疾病或分析多种生物样品的目的。目 前，比较成熟的产品有检测基因突变的芯片，检测细胞基因 表达水平的表达基因芯片等。
核酸的理化性质——核酸的变性、复性与杂交
2、核酸的复性
核酸的理化性质——核酸的变性、复性与杂交
2、核酸的复性
核酸的理化性质——核酸的变性、复性与杂交
3、核酸的分子杂交（ hybridization）
将不同来源的DNA放在试管里，经热变性后，慢慢冷却， 让其复性。若这些异源DNA在某些区断内有相同的序列，则 复性时，会形成杂交DNA分子，且DNA与互补的RNA之间也可 发生杂交。
2、碱水解
核酸的理化性质——核酸的水解
2、碱水解
核酸的理化性质——核酸的水解
2、碱水解
核酸的理化性质——核酸的水解
3、酶水解
非特异性水解多聚核苷酸链中磷酸二酯键的酶称为磷酸二酯 酶，特异性水解核酸的磷酸二酯酶称为核酸酶
DNA水解酶（DNases）以DNA为底物，RNA水解酶（RNases）以 RNA为底物。 根据作用方式又分作两类：核酸外切酶和核酸内切酶。 核酸外切酶的作用方式是从多聚核苷酸链的一端（3′-端或 5′-端）开始，逐个水解切除核苷酸；核酸内切酶的作用方 式刚好和外切酶相反，它从多聚核苷酸链中间开始，在某个 位点切断磷酸二酯键。 在分子生物学研究中最有应用价值的是限制性核酸内切酶。 这种酶可以特异性的水解核酸中某些特定碱基顺序部位。
1、核酸的变性（denaturation）
核酸的理化性质——核酸的变性、复性与杂交
1、核酸的变性（denaturation）
用加热的方法使DNA变性叫 做热变性 DNA的变性过程是爆发性的， 它在很窄的温度区间内完成。 因此，通常将DNA的变性达 到50%时，即增色效应达到 一半时的温度称为DNA的解 链温度（melting temperature,Tm）,Tm也称 一般DNA的Tm值在 熔解温度或DNA的熔点。 70-85C之间
二、核酸的理化性质——核酸的紫外吸收
1、紫外吸收
DNA和RNA的碱基有共轭双键，而使核酸在240~290nm有
光吸收，最大吸收在260nm附近。 可用紫外分光光度法进行核酸纯度鉴定。 纯DNA样品：A260/A280>1.8 纯RNA样品：A260/A280>2.0 对纯样品：A=1.0相当于50ug/mL双链DNA或40ug/mL单 链DNA或20ug/mL寡核苷酸。

核酸的理化性质——核酸的变性、复性与杂交
1、核酸的变性（denaturation） Tm与下列因素有关： 1）DNA的均一性： 均质DNA的熔解过程发生在一个较 小的温度范围内；异质DNA的熔解过程发生在一个较宽 的温度范围内。
核酸的理化性质——核酸的变性、复性与杂交
1、核酸的变性（denaturation）
3、酶水解
限制性内切酶是一类重要的作用于DNA的内切酶
限制性内切酶识别部位一般都是由4-8个碱基对组成的一段 序列，而且有一个二重对称轴，即5`-3`方向残基序列在DNA 的两条链上是一样的，这样的序列称为回文结构。 E. CoR I是一个重要的限制性内切酶，它识别由6个碱基对 组成的特殊序列（每条链上是GAATTC）。 大多数限制性内切酶都是将双链DNA切开，形成两个粘性末 端（带有与另一末端互补的单链） 限制性内切酶往往与一种甲基化酶同时成对的存在，它们具 有相同的底物专一性，具有识别相同碱基序列的能力。
核酸的理化性质——核酸的紫外吸收
2、增色效应与减色效应
核酸的理化性质——核酸的紫外吸收
2、增色效应与减色效应
有时核酸溶液的紫外吸收用摩尔磷吸光度表示，根据磷 含量及紫外吸收值然后算出摩尔磷吸光系数。 (P)=A/cL =30.98A/WL 一般天然DNA的(P)为6600，RNA为7700~7800。由于单 链核苷酸的(P)比双链的要高，所以核酸发生变性时， (P)升高，故称增色效应；复性时(P)降低，称为减色
核酸的理化性质——核酸的变性、复性与杂交
3、核酸的分子杂交
核酸的理化性质——核酸的变性、复性与杂交
3、核酸的分子杂交
Southern印迹杂交（Southern blot）。是研究DNA图谱的基 本技术，在遗传病诊断、DNA图谱分析及PCR产物分析等方面 有重要价值。Southern印迹杂交的基本方法是将DNA标本用限 制性内切酶消化后，经琼脂糖凝胶电泳分离各酶解片段，然 后经碱变性，Tris缓冲液中和和高盐下通过毛吸作用将DNA从 凝胶中转印至硝酸纤维素膜上、烘干固定后即可用于杂交。 凝胶中DNA片段的相对位置在DNA片段转移到滤膜的过程中继 续保持着，附着在滤膜上的DNA与32P标记的探针杂交，利用 放射自显影术确立探针互补的每一条DNA带的位置，从而可以 确定在众多消化产物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大 小。
第14章 核酸的理化性质
核酸的理化性质——一般物理性质
DNA为白色纤维状固体，RNA为白色粉末状固体。 都微溶于水，其钠盐在水中的溶解度较大。但不溶于 乙醇、乙醚和氯仿等一般有机溶剂。 DNA和RNA在细胞中常以核酸—蛋白复合体（核蛋白） 形式存在，两种核蛋白在盐溶液中的溶解度不同。 DNA核蛋白 RNA核蛋白
核酸的理化性质——核酸的水解
3、酶水解
蛇毒磷酸二酯酶和牛脾磷酸二酯酶是从不同末端降解 多聚核苷酸的核酸外切酶
核酸的理化性质——核酸的水解
3、酶水解
牛胰核糖核酸酶（RNase I）作用位点为嘧啶核苷-3`磷酸与其它核苷酸之间的连键，产物为3`-嘧啶核苷酸； 或以3`-嘧啶核苷酸结尾的寡核苷酸。
核酸的理化性质——核酸的水解
0.14mol/LNaCl 1-2mol/LNaCl + + -
DNA溶液的粘度很大，而RNA溶液的粘度小得多。核酸 发生变性或降解后其粘度降低。 核酸受到强大离心力的作用时，可从溶液中沉降下来， 其沉降速度与核酸的大小和密度有关。
核酸的理化性质——核酸的两性性质
• 与蛋白质相似，RNA分子中既含有酸性基团 （磷酸基）也含有弱碱性碱基基团，因而RNA 也具有两性性质。 • 由于RNA分子中的磷酸是一个中等强度的酸， 而碱基呈现弱碱性，所以RNA的等电点比较低。 （当核酸分子内的酸性解离和碱性解离相等， 本身所带的正电荷与负电荷相等时，此时核酸 溶液的pH值即为核酸的等电点pI）RNA在其等 电点时溶解度最小。 • RNA的等电点比较低的原因，是RNA分子中核糖 基2′-OH通过氢键促进了磷酸基上质子的解离。
核酸的理化性质——核酸的变性、复性与杂交
3、核酸的分子杂交
核酸的理化性质——核酸的变性、复性与杂交
3、核酸的分子杂交
核酸的理化性质——核酸的变性、复性与杂交
3、核酸的分子杂交
Northern印迹杂交（Northern blot）。这是一种 将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方 法。因RNA印迹技术正好与DNA相对应，故被称为 Northern印迹杂交。Northern 印迹杂交的RNA吸 印与Southern印迹杂交的DNA吸印方法类似，只是 在进样前用乙二醛或甲醛使RNA变性，而不用NaOH， 因为它会水解RNA的2'-羟基基团。
核酸的理化性质——核酸的水解
3、酶水解
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3`——N—N—N—N—C—T—T—A—A——5` 5`——A—A—T—T—C—N—N—N—N——3` 3`——G—N—N—N—N——5`
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3`——N—N—N—N—C—T—T—A—A—G—N—N—N—N——5`
效应。
三、核酸的理化性质——核酸的变性、复性与 杂交
1、核酸的变性（denaturation）
是指核酸的双螺旋区的氢键断裂，变成单链，并不涉 及共价键的断裂。 变性因素：酸碱、热、尿素等； DNA热变性后一些理化性质改变： 260nm紫外区吸收值升高； 粘度降低；
浮力密度升高；
双折射现象消失；
核酸的理化性质——核酸的变性、复性与杂交
2）G-C的含量：含量越高，Tm越高；
经验公式：G-C%=（Tm-69.3）*2.44
3）离子强度：I越高，Tm越大，DNA宜保存在高浓度盐中。
核酸的理化性质——核酸的变性、复性与杂交
2、核酸的复性（Renaturation）
变性DNA在适当的条件下，两条彼此分开的单链可以 重新缔合成为双螺旋结构，这一过程称为复性。DNA复 性后，一系列物理、化学性质将得到恢复。DNA复性的 程度、速率与复性过程的条件有关。 将热变性的DNA骤然冷却至低温时，DNA不可能复性。 但是将变性的DNA缓慢冷却时，可以复性，这一过程也 叫退火（annealing)。分子量越大复性越难。浓度越 大，复性越容易。此外，DNA的复性也与它本身的组成 和结构有关。 复性反应的速度用Cot1/2 衡量。Co为变性DNA复性时 的浓度，t为时间，以秒表示。 Cot1/2衡量表示复性一 半时的Cot值。