基因工程作业题及答案6页

第二章

1. 名词解释：核酸内切酶、核酸内切限制酶、同裂酶、同尾酶、核酸外切酶、末端脱氧核苷酸转移酶

答：

核酸内切酶：是一类从多核苷酸链的内部催化磷酸二酯键断裂的酶。

核酸内切限制酶：是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（4—8bp），并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。

同裂酶：识别位点的序列相同的限制性内切酶。

同尾酶：识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。

核酸外切酶：是一类从多核苷酸链的一头开始催化降解核苷酸的酶。

末端脱氧核苷酸转移酶：可以不需要模板，在单链DNA或突出的双链DNA

3’-OH端随机添加dNTPs的酶

2. 限制性内切核酸酶的命名原则是什么？

答：限制性内切核酸酶按属名和种名相结合的原则命名的，即：属名+种名+株名+序号；

首字母：取属名的第一个字母，且斜体大写；

第二字母：取种名的第一个字母，斜体小写；

第三字母：(1)取种名的第二个字母，斜体小写；

(2)若种名有词头，且已命名过限制酶，则取词头后的第一字母代替。

第四字母：若有株名，株名则作为第四字母，是否大小写，根据原来的情况而定，但用正体。

顺序号：若在同一菌株中分离了几种限制酶，则按先后顺序冠以I、Ⅱ、Ⅲ、…等，用正体。

3．部分酶切可采取的措施有哪些？

答：1）缩短保温时间

2）降低反应温度

3）减少酶的用量

4. 在序列5'-CGAACATATGGAGT-3'中含有一个6bp

的Ⅱ类限制性内切核酸酶的识别序列，该位点的序列可能是什么?答：回文序列是：5'-CATATG-3，

5．什么是限制性内切核酸酶的星号活性? 受哪些因素影响?

答：Ⅱ类限制酶虽然识别和切割的序列都具有特异性，但是这种特异性受特定条件的限

制，即在一定环境条件下表现出来的特异性。条件的改变，限制酶的特异性就会松

动，识别的序列和切割都有一些改变，改变后的活性通常称第二活性，而将这种因

条件的改变会出现第二活性的酶的右上角加一个星号表示，因此第二活性又称为星

活性。

概括起来，诱发星活性的因素有如下几种：(1)高甘油含量(>5％, v／v)；(2)限制性

内切核酸酶用量过高(>100U／ugDNA)；(3)低离子强度(<25 mmol／L)；

(4)高pH(8．0

以上)；(5)含有有机溶剂，如DMSO，乙醇等；(6)有非Mg2+的二价阳离子存在(如

Mn2+，Cu2+，C02+，Zn2+等)。

第三章

1．如何将野生型的l噬菌体改造成为一个理想的载体?

答：①删除l噬菌体的非必需区，留出插入空间；并在余下的非必须区内制造限制酶切点

②引进某些突变表型，作为选择标记

③突变某些基因，使它成为安全载体

④删除lDNA必须区段上常用的限制酶切点

2．什么是蓝白斑筛选法?

答：这种方法是根据α互补的原理来筛选重组体。主要是在载体的非必要区插入一个带有大肠杆菌b—半乳糖苷酶的α基因片段（LacZ’），携带有lac基因片段的载体转入LacZ’－的宿主菌后，在IPTG（异丙基硫代-β-D 半乳糖）诱导下，载体表达的b—半乳糖苷酶的α肽段和宿主菌表达的b —半乳糖苷酶的b肽段互补，形成有活性的b—半乳糖苷酶，该酶可以分解无色的5—溴—4—氯—3—引哚—b—D—半乳糖苷(X-gal)得到蓝色的5

—溴—4—氯—靛蓝，因此在含有X-gal平板上形成浅蓝色的菌斑。外源基因插人LacZ’(或LacZ’基因部分被取代)后，重组的克隆将丧失分解X-gal的能力，在含有X-gal的平板上形成白色的菌斑，非重组的克隆则为蓝色菌斑。

3． M13系列载体具有哪些优缺点?

答：（1）有MCS，便于克隆不同的酶切片段

（2） Xgal显色反应，可供直接选择

（3）可以克隆双链DNA分子中的每一条链

4．辅助噬菌体DNA和相应的噬菌粒是如何协同工作的?

答：虽然噬菌粒载体携带有M13的IG区，能够合成单链DNA，但是它没有M13的功能基因，没有M13基因2的产物存在，所以不能合成单链DNA。而辅助噬菌体具有M13的所有功能基因，但是IG区是缺陷的，辅助噬菌体本身的DNA不能进行单链复制，于是就可以为噬菌粒提供基因2产物和包装蛋白。

5．某一质粒载体具有Tetr和Kanr的表型，在Kan抗性基因内有一Bgl I 的切点。现用Bgl I切割该载体进行基因克隆，问：(1)转化后涂皿时应加什么样的抗生素?(2)培养后长出的菌落具有什么样的抗性基因型?(3)如何利用抗性变化筛选到含有插入片段的重组体?

答：(1)加四环素；(2)Tet r Kan s和Tet r Kan r；(3)重新点种在含Tet、Kan 和只加Tet的平板上，选择只在Tet平板上生长的菌落，即为所需的重组体。

第四章

1. 目的基因的获取方法有哪些？各有什么优缺点？

答：1）鸟枪法克隆：优点是可以随机克隆供体细胞的全基因组DNA片段；缺点是①工作量较大，需要了解目的基因的背景知识，②不能获得最小长度的目的基因，③不能除去真核生物目的基因的内含子结构

2）cDNA法：优点是①能获得最小长度的目的基因②能除去真核生物目的基因的内含子结构；缺点是①仅限于克隆mRNA分子具有polyA结构的蛋

白质编码基因②mRNA分离纯化困难

3）PCR法：优点是高效快速的体外合成目的基因；缺点是已知待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列

4）化学合成法：优点是适于合成引物、接头等多种DNA短片段；缺点是必须已知基因的DNA序列，直接合成较大的基因成本较高

2. 什么是基因组文库(genomic library)?构建基因组文库，涉及哪些基本过程?它同遗传学上的基因库有什么不同?

答：

基因组文库是用基因工程的方法，人工构建的含有某一生物基因组DNA 的各种片段的克隆群。一般以改造的噬菌体DNA或黏粒作为载体，包括下列过程：(1)高分子量染色体DNA的制备；(2)体外重组连接；(3)包装蛋白的制备；(4)重组体的体外包装；(5)将重组DNA导人寄主细胞；

(6)筛选。基因组文库同遗传学上所讲的基因库是完全不同的概念。基因库(gene pool)是指在进行有性生殖的某一群体中，能进行生殖的个体所含总的遗传信息。在基因组文库的构建中，由于使用的载体不同，分为噬菌体载体和黏粒载体构建的基因组文库、YAC文库、BAC文库等。

3. 什么是cDNA文库(complementDNAlibrary)?同基因组文库有何差别?

答：同mRNA互补的DNA称为cDNA。cDNA文库是以某一生物的总mRNA为模板，在无细胞系统中，在反转录酶的作用下，首先合成一互补的DNA, 即第一链，破坏RNA模板后，再以第一链为模板合成第二链，得到的双链DNA称为cDNA。选用适合的载体，将合成的cDNA重组导人寄主细胞，经筛选得到韵cDNA克隆群称为cDNA文库。由于cDNA技术合成的是不含内含子的功能基因，因此是克隆真核生物基因的一种通用方法。

由于细胞内的基因在表达的时间上并非是统一的，具有发育的阶段性和时间性．有些则需要特殊的环境条件。所以，cDNA文库是不可能构建得十分全，也就是说任何一个cDNA文库都不可能包含某—生物全部编码基因。

第五章

1. 你在做Southern印迹分析，为了节省时间，你电泳后直接将DNA从凝胶转至硝酸纤维素膜上，然后用标记探针杂交，最后发现放射自显影片是空白。错在哪里?