标准菌株的制备

标准储存菌株和工作菌株制备作业指导书

一、目的

保证菌种经过较长时间保藏后仍然保持较强的生命力，不被其他杂菌污染，减少菌株突变或发生典型的特性变化，从而保证微生物学检验结果的准确可靠。

二、方法依据

《食品安全国家标准食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求GB4789.28-2013》及《附录B标准储存菌株和工作菌株的制备》。

三、适用范围

适用于本中心检验菌种（大肠埃希氏菌、产气肠杆菌）的传代、储存及工作菌株制备。

四、名词解释

4.1标准菌株（F0）:直接从官方菌种保藏机构获得。

4.2标准储备菌株（F1):将标准菌株在实验室转接一代以后得到的一套完全相同的独立菌株。

4.3储备菌株（F2）：从标准储备菌株转接一代获得的培养物。

4.4工作菌株：由标准储备菌株、储备菌株或标准物质转接一代获得的菌株。

五、培养基和试剂

5.1营养肉汤

5.2营养琼脂

5.3乳糖蛋白胨培养液

5.4 75%乙醇

5.5 无菌水

六、仪器设备

6.1生物安全柜

6.2生化培养箱（37℃，44.5℃）

6.3高压蒸汽灭菌器

6.4冰箱（4℃，﹣20℃）

6.5微型旋涡混合仪

6.6水浴恒温振荡器

6.7接种环

6.8酒精灯

七、标准储存菌株的制备

7.1本中心所需标准菌株从认可的菌种中心购买，并要求生产商提供验证报告。冷冻干燥菌种为0代。本中心应做好符合性检查并做好符合性检查并填写记录，做好文件归档。

7.2菌种复活

7.2.1将标准菌株及已灭菌的培养基等用物移入生物安全柜。7.2.2点燃酒精灯，在酒精灯火焰周围5厘米无菌区内，用砂轮在距菌种管封口端1/3处划痕，75%酒精棉球消毒菌种管外壁，用无菌纱布包裹菌种管末端用力掰开。

7.2.3用无菌吸管吸取0.5ml适宜的液体培养基加大菌快上，混

匀成菌悬液。再将全部菌悬液移入含有5ml适宜的培养基的培养试管中，在37℃生化培养箱中培养12-18小时。

7.2.4取出培养试管，仔细观察液体培养基是否浑浊，浑浊说明菌种复活成长。形成第一代菌种（），各菌种适宜培养基及培养条件见表1.

7.3在适宜的固体培养基上进行平板分离

选择适宜的鉴别平板，用灼烧灭菌的接种环完全浸入复活的培养基中，取一满环接种物，将接种环接触容器边缘3次去除多余的液体。划线时，接种环与琼脂平面的角度应为200，300。接种环压在琼脂表面的压力和划线速度前后一致，整个划线应快速连续。置于37℃生化培养箱中培养24小时。

7.4菌种纯度检查和确认

观察菌落形态是否符合，同一平板上的单菌落的大小、形状、颜色、质地、光泽是否相似。对于出现两种或两种以上形态的菌株，需要分离挑选目标菌株。各菌种菌落形态特征见表1.

7.4.2革兰氏染色

7.4.2.1涂片：在载玻片上滴加一滴生理盐水，用灭菌接种环取典型菌落少许，与生理盐水混匀，涂布成薄膜。

7.4.2.2干燥：在室温中使自然干燥。

7.4.2.3固定：将载玻片迅速通过火焰2-3次，以载玻片反面接触皮肤，热面不烫为度。

7.4.2.4染色：滴加结晶紫染色液，染色1分钟，水洗

7.4.2.5脱色：滴加95%乙醇脱色，约30秒，水洗

7.4.2.6复染：滴加复染液，复染1分钟，水洗

显微镜下观察，革兰氏阳性菌染色后呈紫色，革兰氏阴性菌染色后呈红色，见表1

7.5菌悬液的制备