单克隆抗体的制备及应用
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这种杂交瘤，通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单 克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针对同一抗 原决定簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体 （ mAbs ），简称单抗。
2 第二部分
单克隆抗体技术的发展经历
单克隆抗体技术发展经历
鼠源性单克隆抗体
鼠源性单克隆抗体是来源于 鼠蛋白，因此对于人体而言 是外来物从而易被抵抗。
目 前 常 用 的 免 疫 程 序
细胞融合和选择性培养
融合过程中，常采用聚乙二醇（PEG）作为融合诱 导剂。PEG促进细胞融合的机制可能是与临近细胞膜 的水分相结合使细胞间的水分被取代，降低细胞表 面的极性，导致脂质双分子层不稳定，引起细胞膜 的融合 。
注意：PEG 的分子量和浓度与融合效果相关，PEG 的分子量越大，浓度越高，其促融率也越高，但其 粘度和细胞的毒性也随之增大；浓度低于30％时， 融合率低。
嵌合性单克隆抗体 全人源单克隆抗体
3 第三部分
单克隆抗体的制备
单克隆抗的制备
11
动物免疫
2
细胞融合和选择性培养
3
杂交瘤细胞的筛选及克隆化
4
大量制备及纯化
单克隆抗体制备的简易流程
动物免疫
抗原制备：制备单克隆抗体的免疫抗原，从纯度上 说虽不要求很高，但高纯度的抗原使得到所需单抗 的机会增加，同时可以减轻筛选的工作量。因此， 免疫抗原是越纯越好，同时应根据所研究的抗原和 实验室的条件来决定。一般来说，免疫用的抗原只 需初步提纯甚至不提纯，但抗原中混杂物很多，特 别是如果这些混杂物的免疫原性较强时，则必须对 抗原进行纯化。
HAT选择性培养 1964年Littlefield首先发明了HAT (H—Hypoxanthine次黄 嘌呤，A—Aminopterin甲氨喋呤，T—Thymidine 胸腺 嘧啶核苷) 选择性培养。 HAT选择性培养基是根据次黄嘌呤核苷酸和嘧啶核苷 酸生物合成途径设计的。
细胞利合用 成内糖核和苷DN氨酸A基，的酸进生物合成途径
• A蛋白-Sepharose CL 4B
4 第四部分
单克隆抗体的应用
单克隆抗体的应用
农兽药的快速检测 检验医学诊断试剂
作为亲和层系的配体
作为生物治疗的导向武器
应用
作为免疫抑制剂
增强抗原的免疫原性
作为研究工作中的探针
作为亲和层系的配体
单克隆抗体能与其相应的抗原特异性结合，因 而能能够从复杂系统中识别出单个成分。只要 得到针对某一成分的单克隆抗体，固定在层析 柱上，通过亲和层析，即可从复杂的混合物中 分离、纯化这一特定成分。
血清 ｜ 50%饱和度硫酸胺
上清 （清蛋白）
沉淀（球蛋白） ｜ 33%饱和度硫酸胺
上清 拟球蛋白
沉淀 r球蛋白
凝胶过滤法：干燥的凝胶颗粒吸水后形成了多孔胶粒，将蛋 白质溶液加在凝胶柱上进行洗脱时，大分子蛋白不能穿过凝 胶网孔进入。胶粒内，留在胶粒间隙的溶液中，随洗脱液最 先流出，小分子蛋白可穿过凝胶网孔进入胶粒内，受到凝胶 的阻留，向下移动较慢洗脱出来较慢，据此将不同大小的蛋 白质分离出来。
而合成DNA
主要生物 合成途径
叶酸拮抗物氨基蝶 呤可阻断主要途径
甲氨喋呤
补救途径
次黄嘌呤
HGPRT+ 次黄嘌呤 核苷酸
胸腺嘧啶 TK+
胸腺嘧啶
脱氧核苷酸
DNA
• 小鼠HGPRT-骨髓瘤细胞（Sp2/0）
• 融合后的细胞在HAT选择培养基中结局
+ Sp2/0
B
Sቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ2/0 Sp2/0
BB
Sp2/0 B
交联葡聚糖凝胶(Sephadex）
琼脂糖凝胶(Sepharose)
离子交换层析法 DEAE纤维素：结合溶液中带负电荷的蛋白质，又称 阴离子交换剂 CM纤维素：结合溶液中带正电荷的蛋白质，又称阳 离子交换剂
亲和层析法： • 将抗原（或抗体）连接到固相载体上，特异性吸
附液相中的抗体（或抗原），形成抗原抗体复合 物，然后改变条件，使抗原抗体复合物解离洗脱 出纯化的抗体（或抗原）。
有限稀释法
4
22
m
3
43
42
32
44
m
14 1
4
3
3
3 33
4 44
3 33
大量制备及纯化
大量制备
纯化方法
1、盐析 2、凝胶过滤 3、离子交换层析 4、亲和层析法
盐析：用中性盐使蛋白质沉淀析出的方法为盐析。大量的盐加入到蛋白溶液中， 高浓度的盐离子有很强的水化力，可夺取蛋白质的水化层，使蛋白质胶粒失水 发生凝聚而沉淀析出。
人源化单克隆抗体
人源化抗体就是指抗体的可变区部 分或抗体全部由人类抗体基因所编 码。人源化抗体可以大大减少异源 抗体对人类机体造成的免疫副反应。
其抗体的可变区和 嵌源结合构合性 成 抗单 ， 原克 通 ，隆 常 人抗 是 源体 部30是 分%指 用比同 来70时 诱%具 导。有 产鼠人生源恒去副和疗部除作定鼠效分免用区的。用都疫。来来是原。人性源和的毒，
单克隆抗体的制备及应用
目录
1 单克隆抗体的简介 2 单克隆抗体技术发展经历 3 单克隆抗体的制备 4 单克隆抗体的应用 5 展望
1 第一部分
单克隆抗体的简介
单克隆抗体的简介
1975年分子生物学家G.J.F.克勒和C.米尔斯坦在自然杂交 技术的基础上，创建立杂交瘤技术。他们把可在体外培养 和无限增殖的骨髓瘤细胞与经抗原免疫后的纯系小鼠脾细 胞融合，形成B细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞既具有瘤细胞 易于在体外无限增殖的特性，又具有脾淋巴细胞那样合成 和分泌特异性抗体的特点。
死亡 死亡 存活
杂交瘤细胞的筛选及克隆化
克隆化：指将抗体阳性孔进行克隆化。目的是将抗体 分泌细胞、抗体非分泌细胞、特异性抗体分泌细胞和 无关抗体分泌细胞分开。 克隆化的原则：尽早进行，反复4-5次 克隆化方法：有限稀释法、软琼脂平板法、显微克隆 法
阳性杂交瘤细胞应及时冻存，防染色体丢失、变异及 污染
免疫动物的选择：一般的杂交瘤生产都选用 BALB/c 小 鼠 或 LOU/c 大 鼠 作 为 免 疫 动 物 。 但 是 ， 有时为了特殊目的而需进行种间杂交，则可免疫其 他动物。就小鼠而言，初次免疫时以8-12周龄为宜， 雌性鼠较便于操作。
免疫程序的确定：在设计免疫程序时，应考虑到抗 原的性质和纯度、抗原量、免疫途径、免疫次数与 间隔时间、佐剂的应用及动物对该抗原的应答能力 等。没有一个免疫程序能适用于各种抗原。
2 第二部分
单克隆抗体技术的发展经历
单克隆抗体技术发展经历
鼠源性单克隆抗体
鼠源性单克隆抗体是来源于 鼠蛋白，因此对于人体而言 是外来物从而易被抵抗。
目 前 常 用 的 免 疫 程 序
细胞融合和选择性培养
融合过程中，常采用聚乙二醇（PEG）作为融合诱 导剂。PEG促进细胞融合的机制可能是与临近细胞膜 的水分相结合使细胞间的水分被取代，降低细胞表 面的极性，导致脂质双分子层不稳定，引起细胞膜 的融合 。
注意：PEG 的分子量和浓度与融合效果相关，PEG 的分子量越大，浓度越高，其促融率也越高，但其 粘度和细胞的毒性也随之增大；浓度低于30％时， 融合率低。
嵌合性单克隆抗体 全人源单克隆抗体
3 第三部分
单克隆抗体的制备
单克隆抗的制备
11
动物免疫
2
细胞融合和选择性培养
3
杂交瘤细胞的筛选及克隆化
4
大量制备及纯化
单克隆抗体制备的简易流程
动物免疫
抗原制备：制备单克隆抗体的免疫抗原，从纯度上 说虽不要求很高，但高纯度的抗原使得到所需单抗 的机会增加，同时可以减轻筛选的工作量。因此， 免疫抗原是越纯越好，同时应根据所研究的抗原和 实验室的条件来决定。一般来说，免疫用的抗原只 需初步提纯甚至不提纯，但抗原中混杂物很多，特 别是如果这些混杂物的免疫原性较强时，则必须对 抗原进行纯化。
HAT选择性培养 1964年Littlefield首先发明了HAT (H—Hypoxanthine次黄 嘌呤，A—Aminopterin甲氨喋呤，T—Thymidine 胸腺 嘧啶核苷) 选择性培养。 HAT选择性培养基是根据次黄嘌呤核苷酸和嘧啶核苷 酸生物合成途径设计的。
细胞利合用 成内糖核和苷DN氨酸A基，的酸进生物合成途径
• A蛋白-Sepharose CL 4B
4 第四部分
单克隆抗体的应用
单克隆抗体的应用
农兽药的快速检测 检验医学诊断试剂
作为亲和层系的配体
作为生物治疗的导向武器
应用
作为免疫抑制剂
增强抗原的免疫原性
作为研究工作中的探针
作为亲和层系的配体
单克隆抗体能与其相应的抗原特异性结合，因 而能能够从复杂系统中识别出单个成分。只要 得到针对某一成分的单克隆抗体，固定在层析 柱上，通过亲和层析，即可从复杂的混合物中 分离、纯化这一特定成分。
血清 ｜ 50%饱和度硫酸胺
上清 （清蛋白）
沉淀（球蛋白） ｜ 33%饱和度硫酸胺
上清 拟球蛋白
沉淀 r球蛋白
凝胶过滤法：干燥的凝胶颗粒吸水后形成了多孔胶粒，将蛋 白质溶液加在凝胶柱上进行洗脱时，大分子蛋白不能穿过凝 胶网孔进入。胶粒内，留在胶粒间隙的溶液中，随洗脱液最 先流出，小分子蛋白可穿过凝胶网孔进入胶粒内，受到凝胶 的阻留，向下移动较慢洗脱出来较慢，据此将不同大小的蛋 白质分离出来。
而合成DNA
主要生物 合成途径
叶酸拮抗物氨基蝶 呤可阻断主要途径
甲氨喋呤
补救途径
次黄嘌呤
HGPRT+ 次黄嘌呤 核苷酸
胸腺嘧啶 TK+
胸腺嘧啶
脱氧核苷酸
DNA
• 小鼠HGPRT-骨髓瘤细胞（Sp2/0）
• 融合后的细胞在HAT选择培养基中结局
+ Sp2/0
B
Sቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ2/0 Sp2/0
BB
Sp2/0 B
交联葡聚糖凝胶(Sephadex）
琼脂糖凝胶(Sepharose)
离子交换层析法 DEAE纤维素：结合溶液中带负电荷的蛋白质，又称 阴离子交换剂 CM纤维素：结合溶液中带正电荷的蛋白质，又称阳 离子交换剂
亲和层析法： • 将抗原（或抗体）连接到固相载体上，特异性吸
附液相中的抗体（或抗原），形成抗原抗体复合 物，然后改变条件，使抗原抗体复合物解离洗脱 出纯化的抗体（或抗原）。
有限稀释法
4
22
m
3
43
42
32
44
m
14 1
4
3
3
3 33
4 44
3 33
大量制备及纯化
大量制备
纯化方法
1、盐析 2、凝胶过滤 3、离子交换层析 4、亲和层析法
盐析：用中性盐使蛋白质沉淀析出的方法为盐析。大量的盐加入到蛋白溶液中， 高浓度的盐离子有很强的水化力，可夺取蛋白质的水化层，使蛋白质胶粒失水 发生凝聚而沉淀析出。
人源化单克隆抗体
人源化抗体就是指抗体的可变区部 分或抗体全部由人类抗体基因所编 码。人源化抗体可以大大减少异源 抗体对人类机体造成的免疫副反应。
其抗体的可变区和 嵌源结合构合性 成 抗单 ， 原克 通 ，隆 常 人抗 是 源体 部30是 分%指 用比同 来70时 诱%具 导。有 产鼠人生源恒去副和疗部除作定鼠效分免用区的。用都疫。来来是原。人性源和的毒，
单克隆抗体的制备及应用
目录
1 单克隆抗体的简介 2 单克隆抗体技术发展经历 3 单克隆抗体的制备 4 单克隆抗体的应用 5 展望
1 第一部分
单克隆抗体的简介
单克隆抗体的简介
1975年分子生物学家G.J.F.克勒和C.米尔斯坦在自然杂交 技术的基础上，创建立杂交瘤技术。他们把可在体外培养 和无限增殖的骨髓瘤细胞与经抗原免疫后的纯系小鼠脾细 胞融合，形成B细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞既具有瘤细胞 易于在体外无限增殖的特性，又具有脾淋巴细胞那样合成 和分泌特异性抗体的特点。
死亡 死亡 存活
杂交瘤细胞的筛选及克隆化
克隆化：指将抗体阳性孔进行克隆化。目的是将抗体 分泌细胞、抗体非分泌细胞、特异性抗体分泌细胞和 无关抗体分泌细胞分开。 克隆化的原则：尽早进行，反复4-5次 克隆化方法：有限稀释法、软琼脂平板法、显微克隆 法
阳性杂交瘤细胞应及时冻存，防染色体丢失、变异及 污染
免疫动物的选择：一般的杂交瘤生产都选用 BALB/c 小 鼠 或 LOU/c 大 鼠 作 为 免 疫 动 物 。 但 是 ， 有时为了特殊目的而需进行种间杂交，则可免疫其 他动物。就小鼠而言，初次免疫时以8-12周龄为宜， 雌性鼠较便于操作。
免疫程序的确定：在设计免疫程序时，应考虑到抗 原的性质和纯度、抗原量、免疫途径、免疫次数与 间隔时间、佐剂的应用及动物对该抗原的应答能力 等。没有一个免疫程序能适用于各种抗原。