层析技术

2、液相层析仪器
(1)、基本构造
记录器
储液器
层析柱 检测器 收集器
HPLC
•储液器
储存样品和流动相的试剂瓶
• 层析柱 包括：层析介质、柱管和柱管的各种接口。
有机 无机 生物 金属柱 有机玻璃柱 玻璃柱
•填充技术
装柱前介质的预处理:
溶胀、漂洗、再生、转型、脱气等；
湿法填充：将预处理过的介质，加入约1倍体积的溶液，搅
b.荧光检测器： 灵敏度高专一性强 稠环芳烃，甾族化合物，蛋白质（酶）， 氨基酸，维生素，色素等
c.示差折光率检测器：偏转式和反射式 旋光物质 化学检测器： 电导检测器：电流
样品浓度
• 记录器：
将检测器检测到的信号放大、计算、 处理以图表的形式显示出来。
•其它附件：部分收集器，定量输液泵， 梯度混合器等。
层析的定量分析： 在一定的层析操作条件下，待测物的含量与层析仪 检测器上产生响应的信号成正比。
积分仪
纯度鉴定： 根据层析峰的数量判断纯度。纯的物质只有 一个保留值。
应用实例
通过适当的样品处理方法，游离的和结合的 植物激素类似物[大豆素(daidzein)，雌马酚 (eguol)，染料木素(genitein)，芒柄花素 (formononetin)，香豆雌酚(coumestrol)和美皂 异黄酮biochanin A)]从新鲜植物材料白三叶草 (Trifolium repens)的提取物中分离出来。并在 不同的紫外光波长下，可被HPLC法定量测定。 根据滞留时间和标准品的添加，可鉴定出植 物激素类似物的层析峰。本方法的测定灵敏度为 2ppm。 通过比较游离植物激素类似物的含量测定， 本方法的提取率比经典的甲醇浸提法更为有效。
20世纪50年代 Cermer 气相层析技术 60年代 高压液相层析技术 80年代 超临界色谱 90年代 微量高效液相
气相色谱仪
超临界色谱仪
高压液相色谱仪（HPLC）
蛋白快速分离系统（FPLC）
2、层析特点
(1)、层析技术的应用范围
范围：无机，有机，生物大分子以及活体 生物等。
（2）、分析参数
吸附容量：指单位质量或体积的层析介质吸附流动相 中溶质的质量，常用mg/g，mg/ml， mol/g, etc.表示 吸附容量大小 分离效率
4、流动相 两类：缓冲液：合适浓度、pH值、离子强度、
缓冲容量等。 有时加保护剂： 如抗氧化剂：DTT，巯基乙醇； 稳定剂：离子强度，糖类，尿素； 蛋白酶抑制剂：PMSF
3.固定相
固定相(层析介质、填料、填充剂)：
不溶于溶剂和水的固体化颗粒。
材料：无机----Al2O3，硅胶，沸石、
硅藻土等
有机-----聚苯乙烯，聚甲基丙烯酸等 多糖类----葡聚糖，琼脂糖， 聚丙烯酰胺等。
•层析介质与生物大分子的关系
分离生物大分子的介质
大孔径、亲水性好的球形材料 多糖类凝胶类层析介质 不同胶联度－－不同分子量 适合：多糖、酶、蛋白质、核酸 葡聚糖凝胶（sephadex） 琼脂糖凝胶（sepharose） 聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Gel）
（2）有机溶剂提取法
与脂质结合比较牢固的蛋白质和酶， 常用不同比例的有机溶剂提取。
在提取蛋白质的过程中，应加入表面活性剂（SDS）、 还原剂（DTT，巯基乙醇）、变性剂（尿素）、酶 （RNAse, DNAse）、蛋白酶抑制剂（PMSF,aprotinin, Leupeptin, pepstatin）等。
2.细胞的破碎
物理法 机械磨碎法 加压破碎法 超声波处理 反复冻融法 自溶法 溶菌酶处理 表面活性剂处理 脂溶性溶剂处理 用低渗溶液
生物化学法
化学处理法
3.提取 将经过处理或破碎的细胞，置于一定条件和溶剂中， 让被提取的生物大分子充分释放出来的过程。 蛋白质和酶的提取 (1)、水溶液提取法： 常用方法 缓冲液，稀盐溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大 用量越大，提取越安全，浓度不能过稀 温度，pH，盐浓度
塔板理论和速率理论
2、塔板理论
色谱柱长：L， 虚拟的塔板间距离：H，
色谱柱的理论塔板数：n，
则三者的关系为：
n=L/H
1941年,Martin和Synge阐述 了色谱的塔板理论。
塔板理论
将色谱柱比作蒸馏塔，把一根连续的色谱柱设想成由 许多小段组成。在每一小段内，一部分空间为固定相 占据，另一部分空间充满流动相。组分随流动相进入 色谱柱后，就在两相间进行分配。并假定在每一小段 内组分可以很快地在两相中达到分配平衡，这样一个 小段称作一个理论塔板（theoretical plate），一个 理论塔板的长度称为理论塔板高度（theoretical plate height）H。经过多次分配平衡，分配系数小的 组分，先离开蒸馏塔，分配系数大的组分后离开蒸馏塔 。由于色谱柱内的塔板数相当多，因此即使组分分配 系数只有微小差异，仍然可以获得好的分离效果。
均匀度：介质颗粒大小在一定范围内的正态分布。如 50 μm －150 μm层析过程中，颗粒大小均匀、流速 快，线性关系，峰值集中。 机械强度：即刚性，衡量层析介质耐压程度的一 个重要标志，常用Pa表示。 机械强度高，流速快，保留值小。
理化性质：表示合成介质的材料及合成后的介质的物理 化学性质。 优：性质稳定，非特异吸附少，亲水性好， 能耐受一定浓度的酸碱和有机溶剂。
第二章 层析技术
一、层析技术的发现和发展 二、层析的原理 三、液相层析 四、吸附层析 五、离子交换层析 六、亲和层析
七、排阻层析
八、疏水层析
一、层析技术(chromatography techniques)
1、发展
1903年 俄国植物学家 Tswett CaCO3和石油醚
叶绿素提取液
样品混合物的分离过程是样品中各组分在色 谱分离柱的两相间不断进行着的分配过程。 ★ ★ 其中的一相固定不动，称为固定相； 另一相是携带样品混合物流过此固定相 的流体（气体或液体），称为流动相。
饱和吸附： 吸附 平 衡 解吸附
检测流入和流出溶液中被分离物质的量， 如果相等，表示该层析柱已达饱和吸附。
3、吸附介质的分类及其性质
种类多； 多为天然材料制：如硅胶，氧化铝，沸石， 活性碳，磷酸钙等； 少数为化学合成：聚酰胺，聚苯乙烯等。
实验课人数 实验时间
周次
日期
内容
姓名
实验
2
3 6 7 8
9月13-19
9月 20-26 10月11-17 10月 18-24 10月25-31
分光光度计
色谱技术 芯片技术 实时定量 PCR技术 共聚焦激光 扫描显微技 术 质谱技术 离心技术
张学琴
张学琴 闫红 陈智忠 刘毅敏
张学琴，闫红
移至第8周 闫红 陈智忠 刘毅敏(confocal) 闫红(色谱) 冯继东 张学琴
9 10
11月1-7 11月8-14
冯继东 张学琴
11
Leabharlann Baidu11月15-21
电泳技术
张学琴(说明考试方式)
周三下午5-7节理论课；周五下午5-7节实验课
样品制备
生物大分子制备步骤： 材料的选择 和预处理
纯化
细胞的 破碎
提取
浓缩、干燥和保存
1. 材料选择及预处理
微生物： 对数生长期，酶和核酸的含量最高
代谢产物和胞外酶 菌体本身的物质
四、吸附层析 (absorption chromatography)
1、发展历史 2、原理
3、吸附介质的分类及其性质
4、吸附层析技术
5、分离过程
6、应用实例
1、发展历史
凡是利用固定相表面的活性基团来吸附流动相 中溶质而进行分离的方法，称为吸附层析。 1903年，俄国植物学家 CaCO3作固定相 石油醚作流动相 分离植物叶片压汁中的色素类物质。
三、液相层析(liquid chromatography)
1、原理 2、液相层析仪器 3、固定相 4、流动相 5、应用
1、原理
根据萃取过程中被分离物质在有机相和水相的 相似相溶原理进行分离，不同的溶质在有机相和水 相互不相容的两相中分配系数有差异，在层析柱内 的保留值就不同，利用这些性质可以把它们分开。 液相层析中的两相是指固定相和流动相，它是 利用被分离物质的物理、化学及生物学特性，如吸 附力、带电性、分子量、分子极性、生物活性等的 差异，根据这些特性，选择不同的分离模式将各种 物质分开。
有机溶剂：极性和溶解度 分离生物大分子：甲醇， 乙醇，乙腈，丙醇等。
5、应用 层析定性分析：
a. 保留值及其测定方法：
绝对保留值：温度、流速、固定相性质、样品杂 质等影响，导致重现性差。 相对保留值：常用法。与柱温，固定相性质关。 b.已知内标法：在未知样品中加入一定的已知 物使层析峰增高来进行定性分析。
1931年
R
Kuhn 同样方法
蛋黄
黄体素
玉米
1941年 Martin 分配层析 1944年 R Consden
玉米黄色素
亲水能力的硅胶层析柱 分离aa 第一次上升为理论(塔板论) 滤纸 分离aa 纸层析
为水不溶性多糖聚合物作为新型介质奠定基础
1947年 美国原子能委员会 离子交换层析分
离稀土元素论文
对物质进行定量、定性和纯度鉴定。
3、层析分类
(1)、按层析的分离相状态分类： 气相层析，液相层析，超临界层析
(2)、按层析的分离机理分类
吸附层析，分配层析，排阻层析，离子交换层析， 亲和层析，金属螯合层析，疏水层析，反向层析， 聚焦层析，灌注层析
4、层析技术术语
(1)、层析图谱
HPLCL ： 标准胰蛋白酶峰
1931年，氧化铝作吸附介质 分离胡萝卜素的同 分异构体，表明吸附层析有较高的分辩率。
后来，活性碳、羟基磷灰石、磷酸钙、硅胶、沸石、 聚苯乙烯聚合物作介质，分离aa，核苷酸， 蛋白质，胺类化合物，生物碱类，黄酮类等 生物、有机和天然药物分子。
推出具高分辨率的用于微量分析的吸附层析介质。
2、原理 •吸附现象 吸附：密集行为 吸附现象：溶质从溶液中到停留在固体表面 上这一过程。 固－气，固－液，液－气 吸附介质与被吸附物质：吸附与被吸附 •吸附力的产生
缺点：刚性差，不能耐压，分离时间长
•层析介质的性能 a. 形状 球形：实心和空心，网状球 不定形（纤维素粉、沸石等）
MILLIPORE
独特基质和多种特异性亲和配基的 Prosep亲和层析介质,适合不同抗体 的纯化 。
b. 技术指标： 粒度大小：直径（μm）粒度大的介质，流速快，理 论塔板数量低，分离效果差。反之，分离效果好。
拌均匀，再在层析柱内装入1/4床体积溶液，悬浮均匀装入柱 内，自然沉降。
填充质量：填料在柱内大小分布均匀，松紧一致； 填料微孔中无气泡，柱与柱的连接处无死体积； 柱床体积稳定，在较高的压力下不漏，流速稳定。
•检测器
包括：光学检测器和化学检测器 吸收 离子导电
光学检测器： a.紫外检测器
应用最广，80% 检测波长：215nm，254nm，280nm 检测波长连续可调 光源：氘灯，汞灯，空心阴极灯， 流动池：石英玻璃，5、10、20、 50、100µ l
保留体积：自流动相中的某一组分进入层析柱开 始到出现该组分峰最高点时，所收集的体积.
保留时间：自流动相中的某一组分进入层析柱开始到 出现该组分峰最高点时，所需要的时间。
二、层析的原理
1、分离现象
完全分离，必须具备两个基本条件：
•两层析峰之间必须有足够远的距离，这是由分配 系数决定的； •每一个层析峰的峰宽尽可能窄，与层析过程中的 传质速度和扩散行为有关。
离心等方法分离开
植物:
细胞壁中有大量纤维素，很坚韧 酚类物质多，不易去除 植物品种、生长发育，生物大分子的量变 化大 与季节有关 各器官、组织所含成分也不同
动物：
选择有效成分含量丰富的脏器组织 便于提取 绞碎、脱脂制成丙酮粉
对于预处理好的材料，若不立即进行实验， 应冷冻保存。对于易分解的生物大分子应选 用新鲜材料制备。
•吸附类型
物理吸附：范德华力 无选择性，吸附速度快，可逆 吸附力较强，吸附过程中释放的 能量小，吸附的分子层有单层、有 多层，易被解吸附。 化学吸附：化学键 选择性吸附，吸附速度慢，吸附 过程中释放的能量大，吸附力强， 不易被解吸附，被吸附的分子层只 有单层。
复合吸附：物理吸附和化学吸附同时发生
以组分的保留值为横坐标，吸光值为纵坐标作图， 得到层析图谱（层析曲线）。
(2)、层析峰的区域与名称
(3)、保留值
死体积：流动相中的溶质进入层析柱后，不被固定相 所吸附，与固定相不发生任何作用，通过柱所收集的 体积。它属于非滞留收集体积，与固定相填料的空隙 体积成正比。 死时间：流动相中的溶质进入层析柱后，不被固定相 所吸附，与固定相不发生任何作用，通过柱所需要的 时间。