荧光免疫层析技术原理进展 ppt
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免疫荧光技术PPT课件
可采用涂片、印片或切片方式制备抗原片。
细胞采用涂片、印片或切片的方式制备抗 原片。
2 标本的固定： ⑴ 固定目的
防止细胞、细菌或切片从玻片上脱落。
去除组织中妨碍抗原抗体结合的类脂质。
易于保存。
（但CD、SIg的检测不进行固定，而采用 活细胞染色）。
⑵ 常用的固定方法：
抗原 固定方法
直接法原理示意图
抗原 抗体
标记 抗体
荧光 光原
间接法原理示意图
抗体
补体
标记 抗补 体抗 体
荧光
光 源
补体结合法原理示意图
㈢荧光显微镜检查： （由实验课介绍）
三、其它免疫荧光技术 1 流式细胞仪 2 时间分辨免疫荧光技术 3 荧光偏振免疫分析技术
时间分辨荧光免疫测定
(time-resolved fluoresence immunoassay,TR-FIA)
第四步： 取出透析袋，进行纯化、鉴 定。
搅拌法
第一步：
第二步：
第三步：
液 第四步：
拌
将含40mg/ml BP 溶液5ml 装入反应瓶中。
加入pH=9.0、0.5mol/L碳酸盐 缓冲液4ml
25℃磁力搅拌下，逐滴加入 1ml含2mg的FITC溶
25℃下搅拌1h，4℃下继续搅
2 荧光抗体的纯化： ⑴ 除去未结合荧光素 ⑵ 除去标记不适当的抗体 ⑶ 除去非特异反应物质
按100mg组织粉/ml标记抗体比例混合， 4℃磁力搅拌1h，静置1h，离心取上清液，在 用50mg/ml比例重复一次。
SUCCESS
THANK YOU
2019/7/31
3 荧光抗体的鉴定： ⑴ 抗体含量测定：双扩法
⑵ 结合比率(F/P)测定：
细胞采用涂片、印片或切片的方式制备抗 原片。
2 标本的固定： ⑴ 固定目的
防止细胞、细菌或切片从玻片上脱落。
去除组织中妨碍抗原抗体结合的类脂质。
易于保存。
（但CD、SIg的检测不进行固定，而采用 活细胞染色）。
⑵ 常用的固定方法：
抗原 固定方法
直接法原理示意图
抗原 抗体
标记 抗体
荧光 光原
间接法原理示意图
抗体
补体
标记 抗补 体抗 体
荧光
光 源
补体结合法原理示意图
㈢荧光显微镜检查： （由实验课介绍）
三、其它免疫荧光技术 1 流式细胞仪 2 时间分辨免疫荧光技术 3 荧光偏振免疫分析技术
时间分辨荧光免疫测定
(time-resolved fluoresence immunoassay,TR-FIA)
第四步： 取出透析袋，进行纯化、鉴 定。
搅拌法
第一步：
第二步：
第三步：
液 第四步：
拌
将含40mg/ml BP 溶液5ml 装入反应瓶中。
加入pH=9.0、0.5mol/L碳酸盐 缓冲液4ml
25℃磁力搅拌下，逐滴加入 1ml含2mg的FITC溶
25℃下搅拌1h，4℃下继续搅
2 荧光抗体的纯化： ⑴ 除去未结合荧光素 ⑵ 除去标记不适当的抗体 ⑶ 除去非特异反应物质
按100mg组织粉/ml标记抗体比例混合， 4℃磁力搅拌1h，静置1h，离心取上清液，在 用50mg/ml比例重复一次。
SUCCESS
THANK YOU
2019/7/31
3 荧光抗体的鉴定： ⑴ 抗体含量测定：双扩法
⑵ 结合比率(F/P)测定：
荧光免疫层析技术原理进展课件
控制和监测，包括自动加样、自动洗涤、 智能等技术手段对检测结果进行自动分
自动读数等环节。这不仅可以减少人为 析和解释。这有助于提高检测的准确性
误差和操作时间，还可以提高检测的准 和可靠性，并可应用于临床诊断和治疗
确性和可重复性。
方案的制定。
04
荧光免疫层析技术挑战 与前景
技术瓶颈与解决方案
技术瓶颈
荧光标记物是荧光免疫层析技术中的关键要素，其性能直接影响检测的灵敏度和特 异性。近年来，科研人员致力于研发新型荧光标记物，以提高检测性能。
新型荧光标记物包括量子点、上转换发光材料和多色荧光染料等。这些新型荧光标 记物具有更高的发光强度和稳定性，能够提高检测的灵敏度和准确性。
此外，新型荧光标记物还具有优异的光学性质，如长寿命、宽激发光谱和窄发射光 谱等，有助于实现多色标记和多重检测，提高检测的特异性。
技术在生物医学领域的前景
01
02
03
疾病诊断
荧光免疫层析技术具有高 灵敏度和特异性的特点， 可广泛应用于传染病、肿 瘤等疾病的早期诊断。
药物研发
荧光免疫层析技术可用于 药物筛选、药效评估和药 物代谢等方面的研究，加 速新药研发进程。
生物安全
荧光免疫层析技术可用于 检测生物武器和生物恐怖 袭击物质，保障国家安全 和公共卫生安全。
实例二：肿瘤标志物检测中的应用
总结词
荧光免疫层析技术用于肿瘤标志物检测，有助于早期发现肿瘤，提高患者生存率。
详细描述
通过检测患者血清或尿液中的肿瘤标志物，如癌胚抗原、甲胎蛋白等，利用荧光免疫层析技术可实现 肿瘤的早期诊断。该技术具有高灵敏度和特异性，能够提高肿瘤检出率，为患者早期治疗提供有力支 持。
分离机制
荧光免疫层析技术原理进展.
双抗体夹心法
待测液含抗原Ag
(k)Ab1-Ag
(k)Ab1-Ag-Ab2
Ab3-(k)Ab1
(k)Ab1
阳性结果T,C均有颜
Ab2
色
T
C
待测液，不含抗原 Ag
(k)Ab1 (k)Ab1
(k)Ab1 Ab2
Ab3-(k)Ab1
阴性结果T无颜色， C有颜色
T
C
双抗体加心法检测原理图 K代表某一标记物
结合垫
• 待测பைடு நூலகம்在T线处发生特异性免疫反应。 • 游离物在C线处发生免疫反应。
待
层析方向
免疫反应
测
物
T
C
免疫层析技术基本原理示意图
精品课件
常用荧光免疫层析法
夹心法
竞争法
•双抗原夹心法 双抗体夹心法
精品课件
竞争法
待测物中的某种抗原与T（检测线）线处 同种抗原竞争性地与标记抗体相结合的过 程。
精品课件
竞争法
待
层析方向
免疫反应
测
物
T
C
免疫层析技术基本原理示意图
精品课件
荧光（fluorescence）
• 荧光物质吸收激发光的能量后，电子从基态跃
迁到激发态，当其回复至基态时，以发射光形式 释放出能量，称为荧光。
发射光谱和激发光谱
➢ 发射光谱是指固定激发波长，在不同波长下
记录的样品发射荧光的强度。
➢ 激发光谱是指固定检测发射波长，用不同波
精品课件
荧光淬灭
• 定义:荧光物质在某些理化因素作用下，发 射荧光减弱甚至消退称为荧光淬灭。
• 引起荧光淬灭的因素：有如紫外线照射、 高温、某些硝基化合物、重氮化合物等。
免疫荧光技术课件概要ppt
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
3. 四乙基罗达明（tetraethyl rhodamineB200，RB200) RB200是褐红 色粉末状，溶于乙醇和丙酮，不溶于水。 最大吸收光谱为570nm，最大发射光谱为 596～600nm，呈橙红色荧光。因为 RB200比较低廉，广泛用于染色和双标 记示踪或染色。RB200不能直接和蛋白 质结合，要先经五氯化磷（PCI5）作用 下转变成黄酰氯（S02C1），在碱性条件 下易与赖氨酸s氨基反应而结合在蛋白分 子上。其分子质量为580u。
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
在一定的条件下，电子可吸收能量 （如光能，热能，电能，机械能等）跃 迁到较高能量级（即激发态），这个过 程叫激发。处于激发态的电子是不稳定 的，它总是要跃迁回到基态，并将多余 的能量释放出来。跃迁方式可能是辐射 跃迁，也可能是非辐射跃迁。以非辐射 跃迁时，能量大多转化为热能，而以辐 射方式跃迁时，能量转化成相应波长的 光，这个过程叫发射。
一、标记方法：
采用FITC标记抗体的方法
常用Marsshall（1958）法标记荧光抗 体，也可以根据条件用Chadwick等 （1960）标记法或Clark等（1963）的透 析标记法。
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
荧光免疫技术PPT课件
碱性磷酸酶
4-MUP 4-MU
360
β-半乳糖苷酶
4MUG
4-MU
360
辣根过氧化物酶 HPA 二聚体
317
450
10
450
10
414
0.03
荧光酶免疫测定
方法类型
➢ 双抗体夹心法 ➢ 双抗原夹心法 ➢ 固相抗原竞争法
荧光酶免疫测定
方法类型
➢双抗体夹心法
固相抗体和酶标记抗体与 待检原反应，形成固相抗 体-抗原-酶标抗体复合物， 加入底物进行酶促发光反 应，发光量与待检抗原含 量成正比。
三、荧光酶免疫测定
基本原理
碱性磷酸酶标记抗体或抗 原，固相载体包被抗原或 抗体，酶分解4-MUP， 脱磷酸根基团形成4-MU， 360nm激发光照射，发 出450nm荧光。
荧光酶免疫测定荧光物质产生示意图
荧光酶免疫测定
酶和荧光底物
荧光酶免疫测定标记用酶及荧光底物
标记酶
底物 荧光产物 激发光(nm) 荧光(nm) 相应信号
❖抗体效价：双向免疫扩散试验 ❖抗体特异性：吸收试验、抑制试验 ❖抗体抗体特异性染色滴度：倍比稀释
荧光抗体的制备
荧光抗体的保存
❖-20℃：保存1～2年 ❖真空干燥：长期保存
二、标本的制作
标本的类型
组织切片：冷冻切片、石蜡切片（最常用） 印片：肝、脾、淋巴结等器官或组织 涂片：各种体液、穿刺液、细菌培养物和细胞悬液 培养细胞：单层培养细胞
设立实验对照:阳性对照和阴性对照 区分特异和非特异染色 阳性细胞显色分布:胞质型、胞核型和膜表面型
27
荧光抗体染色及结果判断
荧光抗体染色结果判断
“-”：无或仅见极微弱荧光。 “+”：荧光较弱但清楚可见。 “++”：荧光明亮。 “+++”：耀眼强荧光。 特异荧光强度“++”以上判定为阳性，对照光应呈“-”或 “±”。 根据呈"++"的血清最高稀释度判定特异性抗体效价。
荧光免疫标记技术ppt课件
讨论分析
荧光FITC+RB200标志
讨论分析
荧光显微镜
光源：高压汞灯、氙灯、 卤素灯
滤板：隔热滤板、激光 滤板〔UG、BG〕、 吸收滤板〔OG、GG〕
光路：透射光、落射光
讨论分析
a 透射光
b 落射光
讨论分析
荧光显微镜台式机---FACSCalibur
双激光--488nm
635nm 四荧光参 数 分选、浓 缩系统
实验操作
【操作方法】
❖ 1.自冰箱中取出抗原基质片，平衡至室温，用记号笔画圈 标志。
❖ 2.将待检血清和对照血清用PBS作1∶10稀释，用微量 加样器加50μl待检血清或对照血清于基质片上，程度置 于湿盒中37oC温箱反响30min。
❖ 3.以PBS冲洗抗原基质片，再分别浸于盛有PBS染色缸 中，反复漂洗3次，每次5min。
性诊断 寄生虫检验---间接法测Ab,如抗疟Ab 、阿米巴Ab等 本身Ab检测
考核
配分与评分规范
序号
考核要点
分值
评分标准
1 (1) 抗原基质片，平衡 1 不符合要求将此分扣除
至室温
(2) 记号笔画圈标记
1
得分
2
(1) 待检血清和对照血 清用PBS作1∶10稀
1
不符合要求将此分扣除
释
(2) 微量加样器50μl待检
讨论分析
免疫荧光技术- 根本原理
免疫荧光技术是将抗原抗体反响的特异性 和敏感性与显微示踪的准确性相结合。
以荧光素作为标志物，与知的抗体(或抗 原)结合、但不影响其免疫学特性。然后将荧 光素标志的抗体作为规范试剂，用于检测和 鉴定未知的抗原。
在荧光显微镜下，可以直接察看呈现特 异荧光的抗原抗体复合物及其存在部位。
医学免疫学检验免疫荧光技术课件
成本较高
由于免疫荧光技术需要使用昂贵的荧光标记抗体，因此检测成本 较高，限制了其在临床上的广泛应用。
对实验人员要求高
免疫荧光技术需要具备一定的实验技能和经验，对实验人员的专业 素质要求较高。
免疫荧光技术的应用前景和研究方向
应用前景
免疫荧光技术在医学、生物学和化学等领 域具有广泛的应用前景，特别是在医学诊 断和研究中发挥着重要作用。
医学免疫学检验免疫荧光 技术课件
xx年xx月xx日
目录
• 免疫荧光技术概述 • 免疫荧光技术的基本原理和分类 • 免疫荧光技术的应用 • 免疫荧光技术的操作流程 • 免疫荧光技术的优缺点 • 免疫荧光技术在医学检验中的应用案例分析
01
免疫荧光技术概述
免疫荧光技术的定义与特点
定义
免疫荧光技术是一种在生物体上应用荧光素标记抗体，从而 检测特异性抗原的方法。
荧光显微镜观察
使用荧光显微镜观察样品，并在激发波长下观察荧光信号。
结果记录与分析
记录荧光信号的强度、分布和颜色等信息，并对这些信息进行分析，以确定 抗原的存在和定位。
影响因素和注意事项
温度和湿度
抗原分布和抗体特异性
免疫荧光技术的结果受温度和湿度的影响较 大，因此需要在恒温恒湿的环境中进行操作 。
抗原在细胞中的分布和抗体与抗原的特异性 结合是影响免疫荧光技术结果的重要因素。
04
免疫荧光技术的操作流程
样品制备
01
样品选择与处理
选择适当的临床样品，如血清、组织切片等，并进行适当的预处理，
以去除杂质和提高样品质量。
02
细胞固定
将样品在室温下与适量的缓冲液混合，然后加入适量的甲醛或乙醇，
以固定细胞并保持其完整性。
由于免疫荧光技术需要使用昂贵的荧光标记抗体，因此检测成本 较高，限制了其在临床上的广泛应用。
对实验人员要求高
免疫荧光技术需要具备一定的实验技能和经验，对实验人员的专业 素质要求较高。
免疫荧光技术的应用前景和研究方向
应用前景
免疫荧光技术在医学、生物学和化学等领 域具有广泛的应用前景，特别是在医学诊 断和研究中发挥着重要作用。
医学免疫学检验免疫荧光 技术课件
xx年xx月xx日
目录
• 免疫荧光技术概述 • 免疫荧光技术的基本原理和分类 • 免疫荧光技术的应用 • 免疫荧光技术的操作流程 • 免疫荧光技术的优缺点 • 免疫荧光技术在医学检验中的应用案例分析
01
免疫荧光技术概述
免疫荧光技术的定义与特点
定义
免疫荧光技术是一种在生物体上应用荧光素标记抗体，从而 检测特异性抗原的方法。
荧光显微镜观察
使用荧光显微镜观察样品，并在激发波长下观察荧光信号。
结果记录与分析
记录荧光信号的强度、分布和颜色等信息，并对这些信息进行分析，以确定 抗原的存在和定位。
影响因素和注意事项
温度和湿度
抗原分布和抗体特异性
免疫荧光技术的结果受温度和湿度的影响较 大，因此需要在恒温恒湿的环境中进行操作 。
抗原在细胞中的分布和抗体与抗原的特异性 结合是影响免疫荧光技术结果的重要因素。
04
免疫荧光技术的操作流程
样品制备
01
样品选择与处理
选择适当的临床样品，如血清、组织切片等，并进行适当的预处理，
以去除杂质和提高样品质量。
02
细胞固定
将样品在室温下与适量的缓冲液混合，然后加入适量的甲醛或乙醇，
以固定细胞并保持其完整性。
荧光免疫层析技术原理进展
• ①高敏感性，有报道 UCP 的灵敏度可达胶体金的 100 倍。 • ②高稳定性，UCP 的发光信号不受检测环境或样 品腐蚀或标志物自身衰变等的影响，可长期存放 和可重复。 • ③使用简便，安全无毒，可适用于定量分析与多 重分析，在一般的实验室或野外现场都可轻松应 用.
UCP应用举例
• 中科院报道了一种用 于免疫活性检测的UCP 试纸条读数计，采用 半导体激光器作为光 源，CCD作为光电接收 器，步进电机带动控 制试纸条移动的装置
• UCP 颗粒主要含有如 下三种成分: • 主基质：氧硫化物 （Y2O2S,GdO2S）、氟 化物(YF3,GdF3）、硅 酸盐 (YSi2O5,YSi3O7）... 3+ 3+ 3+ • 吸收子Yb Er Sm 3+ 3+ 3+ • 发射子Er Ho Tm
A3
S2
A2
S1
A1
UCP独特的优势
4有机纳米粒子 • 荧光素衍生物等荧光染料类有机纳米粒子是早期 常用于免疫层析技术中的一大类标志物，如异硫 • 氰酸酯荧光素，标记原理基本都是利用荧光分子 中的异硫氰酸根为反应基团，与蛋白分子中的氨 基结合，实现对蛋白的标记，同时以分子中的荧 光素为检测信号，早期应用研究较多。有机纳米 粒子的荧光发射依赖于粒子本身的化学发光集团 不具有无机纳米粒子的波长可调控的尺寸效应。
④生物相容性好 物理结合
化学偶联
量子点在免疫层析中的应用
• 量子点是一种新的荧光标记物，目前在免疫层析 中得应用相对UCP，胶体金较少见报道。 • 张国华，赖卫华等，量子点标记免疫层析试纸条 快速检测莱克多巴胺的研究[J]，2009，以CdSe 为标记物，对莱克多巴胺(一种苯酚胺类β-肾上腺 素激动剂)快速定量检测。 • 胡华军，付 涛等，CdTe / ZnSe 核壳量子点免疫 层析试纸条检测克伦特罗的研究，2010,检测克伦 特罗( Clenbuterol，CLE) —属于 β-兴奋剂类药物, 又称“瘦肉精”
UCP应用举例
• 中科院报道了一种用 于免疫活性检测的UCP 试纸条读数计，采用 半导体激光器作为光 源，CCD作为光电接收 器，步进电机带动控 制试纸条移动的装置
• UCP 颗粒主要含有如 下三种成分: • 主基质：氧硫化物 （Y2O2S,GdO2S）、氟 化物(YF3,GdF3）、硅 酸盐 (YSi2O5,YSi3O7）... 3+ 3+ 3+ • 吸收子Yb Er Sm 3+ 3+ 3+ • 发射子Er Ho Tm
A3
S2
A2
S1
A1
UCP独特的优势
4有机纳米粒子 • 荧光素衍生物等荧光染料类有机纳米粒子是早期 常用于免疫层析技术中的一大类标志物，如异硫 • 氰酸酯荧光素，标记原理基本都是利用荧光分子 中的异硫氰酸根为反应基团，与蛋白分子中的氨 基结合，实现对蛋白的标记，同时以分子中的荧 光素为检测信号，早期应用研究较多。有机纳米 粒子的荧光发射依赖于粒子本身的化学发光集团 不具有无机纳米粒子的波长可调控的尺寸效应。
④生物相容性好 物理结合
化学偶联
量子点在免疫层析中的应用
• 量子点是一种新的荧光标记物，目前在免疫层析 中得应用相对UCP，胶体金较少见报道。 • 张国华，赖卫华等，量子点标记免疫层析试纸条 快速检测莱克多巴胺的研究[J]，2009，以CdSe 为标记物，对莱克多巴胺(一种苯酚胺类β-肾上腺 素激动剂)快速定量检测。 • 胡华军，付 涛等，CdTe / ZnSe 核壳量子点免疫 层析试纸条检测克伦特罗的研究，2010,检测克伦 特罗( Clenbuterol，CLE) —属于 β-兴奋剂类药物, 又称“瘦肉精”
荧光免疫层析技术原理进展.ppt
• 固定相是固体物质或固定于固体物质上的 成分。 • 流动相是可以流动的物质，如水或各种溶 剂。
• 层析过程：当待分离混合物随流动相通过 固定相时，由于混合物各组分的理化性质 的差异，与固定相相互作用弱的组分随流 动相移动时受到的阻滞作用小，向前移的 速度快；与固定相相互作用强的组分向前 移动的速度慢。从而实现混合物中各组分 的分离。
4有机纳米粒子 • 荧光素衍生物等荧光染料类有机纳米粒子是早期 常用于免疫层析技术中的一大类标志物，如异硫 • 氰酸酯荧光素，标记原理基本都是利用荧光分子 中的异硫氰酸根为反应基团，与蛋白分子中的氨 基结合，实现对蛋白的标记，同时以分子中的荧 光素为检测信号，早期应用研究较多。有机纳米 粒子的荧光发射依赖于粒子本身的化学发光集团 不具有无机纳米粒子的波长可调控的尺寸效应。
待 测 物
层析方向
T
免疫反应CΒιβλιοθήκη 免疫层析技术基本原理示意图
荧光（fluorescence）
•
荧光物质吸收激发光的能量后，电子从基态跃 迁到激发态，当其回复至基态时，以发射光形式 释放出能量，称为荧光。 发射光谱和激发光谱
发射光谱是指固定激发波长，在不同波长下 记录的样品发射荧光的强度。 激发光谱是指固定检测发射波长，用不同波 长的激发光激发样品记录的相应的荧光发射 强度。
C
K代表某一标记物
结合垫
免疫层析法检测的实物 图
双抗原夹心法
双抗原夹心反应模式阳性检测（左）与阴性检测（右）
• 利用荧光免疫层析试纸条可以实现对待测 物的定性或者定量检测.
胶体金 其他 量子点
标记物 碳纳米管 镧系元素
纳米磁性材料
有机纳米粒子
胶体金
• 金颗粒之间存在的静电斥力使其在水中保持相 对稳定的状态，形成稳定的水溶性胶体，即称 为胶体金
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荧光效率
定义:荧光物质分子将光能转变成荧光的百分率
计算公式: 荧光效率=
发射荧光的光量子荧 数光 （强度） 吸收光的光量子数发 （光 激强度）
荧光寿命
➢定义:荧光物质被激发后所产生的荧光衰减到一定程 度时所用的时间。 ➢各种荧光物质的荧光寿命不同。
荧光淬灭
• 定义:荧光物质在某些理化因素作用下，发 射荧光减弱甚至消退称为荧光淬灭。
• 霍乱弧菌—霍乱—烈性肠道传染病 • 甲胎蛋白(AFP）-肝癌的特异性指标。
3 量子点
• 量子点( quantum dots，QDs)，主要 指主族Ⅱ～ Ⅵ( 如 CdSe) ，Ⅲ～ Ⅴ( 如 InP、InAs、GaSe) ，副族化合 物以及 Si 等元素组成的纳米颗粒
• ①QDs 有可精确调 谐的发射波长，通
（Y2O2S,GdO2S）、
氟化物(YF3,GdF3）、 S2
A2
硅酸盐
(YSi2O5,YSi3O7）...
• 吸收子Yb3+ Er3+ Sm3+ S1
A1
• 发射子Er3+ Ho3+ Tm3+
UCP独特的优势
• ①高敏感性，有报道 UCP 的灵敏度可达胶体金的 100 倍。
• ②高稳定性，UCP 的发光信号不受检测环境或样 品腐蚀或标志物自身衰变等的影响，可长期存放 和可重复。
• 两种不同镧系元素离子( 分别作为光 吸收子和发射子) 掺杂入亚微米尺寸 的陶瓷颗粒( 作为主基质) 中，会构成 一类能上转发光产生荧光的特殊材 料。—— UCP( up-converting phosphor，UCP) 颗粒。
• UCP 颗粒主要含有如 A3 下三种成分:
• 主基质：氧硫化物
结合垫
免疫层析法检测的实物 图
双抗原夹心法
双抗原夹心反应模式阳性检测（左）与阴性检测（右）
• 利用荧光免疫层析试纸条可以实现对待测 物的定性或者定量检测.
其他 碳纳米管
胶体金 标记物
量子点 镧系元素
纳米磁性材料
有机纳米粒子
胶体金
• 金颗粒之间存在的静电斥力使其在水中保持相 对稳定的状态，形成稳定的水溶性胶体，即称 为胶体金
• 典型的是以磁性材料四氧 化三铁.
• 表面引入活性基团，通过 耦联反应与酶、抗体等生 物分子结合形成生物标志 物.
• 超顺磁性.
6碳纳米管
• 碳纳米管( carbon nanotubes，CNTs) 的结构可看成 是石墨的六角形网格结构发生一定弯曲而形成的空间 拓扑结构。
• CNTs 作为生 物分子标志物 的原理与胶体 金类似，其明 显的黑色在定 性或半定量检 测中肉眼即可 见。
④生物相容性好 物理结合
化学偶联
量子点在免疫层析中的应用
• 量子点是一种新的荧光标记物，目前在免疫层析 中得应用相对UCP，胶体金较少见报道。
• 张国华，赖卫华等，量子点标记免疫层析试纸条 快速检测莱克多巴胺的研究[J]，2009，以CdSe 为标记物，对莱克多巴胺(一种苯酚胺类β-肾上腺 素激动剂)快速定量检测。
谢谢！
过调整粒子尺寸可
得到不同发射光谱，
即可使用大小不同 的同种 QDs 颗粒实 现不同颜色标记。
• ②较大的Stokes 位移和狭 窄对称的荧光谱峰。
• 使得用同一激发光源可同 时激发不同大小的量子点， 产生不同发射光谱，使同 步检测多样本成为可能。
• ③QDs 荧光性质稳定，可 长期保存，经受反复多次 激发。
荧光免疫层析技术的原理与进展
荧光免疫层析技术的基本原理
层析法(chromatography)的原理是利用混 合物中各组分的物理性质之差(如吸附力、 分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、 分配系数等)而建立来的一种分离技术。 层析系统是由固定相(stationary phase)和 流动(Mobile Phase)相组成。
免疫层析法
• 免疫层析技术是建立在层析技术和抗 原一抗体特异性免疫反应基础上的一 项新兴免疫检测技术。
• 免疫层析技术以固定有检测线和控制线的条状纤 维层析材料为固定相，测试液为流动相，通过毛 细作用使待测物在层析条上移动。
• 待测物在T线处发生特异性免疫反应。
• 游离物在C线处发生免疫反应。
待
常用荧光免疫层析法
夹心法
竞争法
•双抗原夹心法 双抗体夹心法
竞争法
待测物中的某种抗原与T（检测线）线处同 种抗原竞争性地与标记抗体相结合的过程。
竞争法
结合垫
含抗原 A
免疫层析法检测的实物 图
Y1:A的单抗与标记物的偶联体 Y2：抗原A Y3:羊抗鼠二抗
夹心法
• 待测物中某种抗体（抗原）与T线处抗原A （抗原A）以及荧光标记的抗原（抗体）特 异性相结合的过程，在T线处形成抗体A+抗 原+抗体B形式的夹心结构。
• 引起荧光淬灭的因素：有如紫外线照射、 高温、某些硝基化合物、重氮化合物等。
• 免疫层析技术以固定有检测线和控制线的条状纤 维层析材料为固定相，测试液为流动相，通过毛 细作用使待测物在层析条上移动。
• 待测物在T线处发生特异性免疫反应。
• 游离物在C线处发生免疫反应。
待
层析方向
免疫反应
测
物
T
C
免疫层析技术基本原理示意图
• 固定相是固体物质或固定于固体物质上的 成分。
• 流动相是可以流动的物质，如水或各种溶 剂。
• 层析过程：当待分离混合物随流动相通过 固定相时，由于混合物各组分的理化性质 的差异，与固定相相互作用弱的组分随流 动相移动时受到的阻滞作用小，向前移的 速度快；与固定相相互作用强的组分向前 移动的速度慢。从而实现混合物中各组分 的分离。
• ③使用简便，安全无毒，可适用于定量分析与多 重分析，在一般的实验室或野外现场都可轻松应 用.
UCP应用举例
• 中科院报道了一种用 于免疫活性检测的 UCP试纸条读数计， 采用半导体激光器作 为光源，CCD作为光 电接收器，步进电机 带动控制试纸条移动 的装置
• 军事医学科学院研 制出一种UPT十通 道免疫层析试纸盘， 同时检测多种抗体 以确证是否感染鼠 疫菌
层析方向
免疫反应
测
物
T
C
免疫层析技术基本原理示意图
荧光（fluorescence）
• 荧光物质吸收激发光的能量后，电子从基态跃
迁到激发态，当其回复至基态时，以发射光形式 释放出能量，称为荧光。
发射光谱和激发光谱
➢ 发射光谱是指固定激发波长，在不同波长下 记录的样品发射荧光的强度。
➢ 激发光谱是指固定检测发射波长，用不同波 长的激发光激发样品记录的相应的荧光发射 强度。
• 目前无论用何种方法制备 CNTs，均难以去 除其中混杂的无定形碳、石墨碳碎片等杂 质，这些杂质与 CNTs 混杂在一起，严重 限制了 CNTs的研究与应用[1].
• [1]王倩倩，颜红侠，李朋博，等． 碳纳米管的纯化、性 能及应用［J］． 化学工业与工程，2010，27( 3) : 259265．
• ③结果判断只需普通光学仪器或直接肉眼 观察。
胶体金作为标记物的应用
试孕纸
应用（定量）
• 08天津大学精密仪器 与光电子工程学院与 天津市进出口检验检 疫局合作开发研发一 种便携式仪器。
• 竞争法原理 • 用于农药残留定量检
测
2 镧系元素
• 镧系元素又称为稀土金属元素，指元素周 期表中原子序数 57～71 的所有元素。
• 胡华军，付 涛等，CdTe / ZnSe 核壳量子点免疫 层析试纸条检测克伦特罗的研究，2010,检测克伦 特罗( Clenbuterol，CLE) —属于 β-兴奋剂类药物, 又称“瘦肉精”
4有机纳米粒子
• 荧光素衍生物等荧光染料类有机纳米粒子是早期 常用于免疫层析技术中的一大类标志物，如异硫
• 胶体金既有明亮的色彩， 又有高电子密度，可以吸 附生物大分子，且不影响 生物分子的活性，故可作 为生物分子的标志物，用 于免疫反应中抗原或抗体 的标记定位，定性甚至定 量研究。层析试纸标记用 金颗粒的直径大多在 20～ 40 nm，呈深红色。
• 胶体金标记蛋白质的过程是蛋白被动吸附到金颗 粒表面的过程。
• 由于蛋白分子牢固地结合在金颗粒表面，形成一 个蛋白层，阻止了胶体金颗粒的相互接触势:
• ①几乎可标记所有的蛋白分子，过程简单， 效率高，用量少，便宜，基本不改变被标 记蛋白的活性。且稳定，无毒，使用方便， 保质期长。
• ②不同直径的纳米金可以用于多重标记。
结合垫
免疫层析法检测的实物 图
双抗体夹心法
待测液含抗原Ag
(k)Ab1-Ag
(k)Ab1-Ag-Ab2
Ab3-(k)Ab1
(k)Ab1
阳性结果T,C均有颜
Ab2
色
T
C
待测液，不含抗原 Ag
(k)Ab1 (k)Ab1
(k)Ab1 Ab2
Ab3-(k)Ab1
阴性结果T无颜色， C有颜色
T
C
双抗体加心法检测原理图 K代表某一标记物
• 氰酸酯荧光素，标记原理基本都是利用荧光分子 中的异硫氰酸根为反应基团，与蛋白分子中的氨 基结合，实现对蛋白的标记，同时以分子中的荧 光素为检测信号，早期应用研究较多。有机纳米 粒子的荧光发射依赖于粒子本身的化学发光集团 不具有无机纳米粒子的波长可调控的尺寸效应。
5纳米磁性颗粒
• 纳米磁性颗粒( magnetic nanoparticle，MNs) 也被称为超顺磁颗粒，它结合了磁性粒子和纳米 材料的优点，具有粒径小、超顺磁性和比表面积 大等特性。