离心技术

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离心分离技术
1.离心技术的基本概念 2.离心机转头分类 3.离心的基本方法
4.细胞结构成分的离心分离方法
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学习目标
1. 离心技术的基本概念； 2. 决定离心行为的两个因素和“三要 素”； 3. 沉降系数、离心力和什么因素有关； 4. 离心的基本方法和适用范围； 5. 细胞结构成分的离心分离方法。
10 000g 1min
2 000g
5min
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学习目标
1.离心技术的基本概念 2.离心机转头分类 3.离心的基本方法
4.细胞结构成分的离心分离方法
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二.离心设备：离心机及离心管
3.离心腔 （真空设备） 1. 转头 2.控制系统 （马达）
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4.温度控制 （冷却设备）
离心机分类
低速：6800g(细胞级）
常温、低温； 台式、立式； 低速、高速、超速
分离>10000S的细胞及细胞 器 高速：17,700－50,400g（亚 细胞级）
分离 >100S的颗粒，包括部 分细胞器及病毒 超速：90,400－694,000g （分子级）离<100S的颗粒15
转头损坏及原因
转头不平衡
离心管平衡误差；
离心管放置不对称；
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2.细胞破碎
* 渗透压冲击
* 超声波振荡
* 机械力研磨或剪切
* 反复冻融
原则：只需破碎细胞膜，保留完整细胞器
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3.细胞结构成分的分步分离
一系列的差速离心＋密度梯度离心
差速离心：分离细胞器
梯度离心：纯化细胞器
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4.离心方法的选择
根据分离细胞器的性质：
匀浆物中各类细胞器大小不同：
差速离心
上清中各类细胞器大小有差别：
介质有密度梯度，颗粒密度有差异
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1.差速离心法
(differential centrifugation)
原理：通过一系列递增速度的离心，依次将大小不 同的颗粒逐级分离。
上清 上清 上清 上清
颗粒混合物
最大颗粒
较大颗粒
中等颗粒
小颗粒
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特点：
介质密度均一； 速度由低向高，逐级离心，适
用与大小差别较大的颗粒；
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3. 相对离心力 (g)和离心时间（min)决定沉降
材料
动物细胞 人红细胞 细菌 病毒
大小(m)
10-60 6- 8 1-10 0.02-0.03
离心条件(离心力，离心时间）
200-500g 500g 500-6000g 30000-40000g 5-15min 5-15min 10-15min 20-30min
操作简单，多次离心；
分离纯度不高，需要确定离心
力和离心时间。
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2.密度梯度离心法
(density gradient centrifugation)
离心介质有密度梯度
s= 2r2(p- m) 9
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理想的离心介质
可自行配制的：蔗糖 商品化的：Ficoll, Percoll, Accudenz (Nycodenz) 形成的溶液密度范围大
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用途： 分离有密度差异的颗粒,适用于病毒、DNA、 RNA、蛋白质等。 特点：
密度较高介质，陡度大，介质的最高密度应
大于被分离组分的最大密度( p< m ) 。 所需的力场通常比速率沉降法大10~100倍， 往往需要高速或超速离心。
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学习目标
1.离心技术的基本概念 2.离心机转头分类 3.离心的基本方法
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什么是离心力？ 圆周运动的物体 在旋转过程中产 生的背向旋转轴 的运动力。
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决定离心行为的主要因素
颗粒的属性：颗粒大小、密度等特性
溶液和设备：离心机、离心介质
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离心分离首先需要知道的 “三要素”
颗粒的沉降系数
相对离心力 离心时间
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1.沉降系数（ S ）：重要指标
颗粒在单位离心力的作用下的移动速度
速率区带离心
上清中各类细胞器密度有差别：
等密度离心
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密度梯度离心
梯度离心需要的设备
离心机：低速、高速、超高速 转头： 介质： 水平、固定角、垂直 蔗糖, Ficoll, Percoll, Accudenz (Nycodenz),
Metrizoate
介质的梯度形成装置和收集装置
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5.分离细胞器的鉴定和评价
粘度低
对细胞成分损伤小 离心分离后容易去除 浓度容易测定 价格
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密度梯度离心-移动区带离心法
（moving-zone centrifugation)
原理：用梯度蔗糖或甘油作为介质，将 要分离的样品放在介质表面，形成一个 狭带，然后超速离心，使不同密度的颗 粒以不同的速度向管底方向移动，形成 一系列区带，从管底小孔中分次收集各 种颗粒成分。
（1）形态鉴定：光镜或电镜 （2）生化分析：细胞器特异的标志酶
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(2)生化分析：细胞器特异的标志酶
细胞器
细胞核 线粒体 溶酶体 过氧化物酶体 内质网 高尔基体 细胞膜
标志酶
NAD合成酶、DNA聚合酶 细胞色素氧化酶、琥珀酸脱氢酶、单胺氧化酶 酸性磷酸酶、－半乳糖苷酶 过氧化氢酶、尿酸氧化酶 葡萄糖-6-磷酸酶、细胞色素P450 －半乳糖苷转移酶 5’-核苷酸酶、Na/K-ATP酶
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用途： 分离有大小和密度差异的细胞或细胞器。
特点：
密度梯度介质，且密度较低，
介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最
小密度( p> m )。 离心时间(t)，不能使所有颗粒都沉到管底。
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密度梯度离心-等密度梯度离心法
（isodensity centrifugation)
原理：离心时采用包括各种颗粒密度范围的梯度介质， 被分离颗粒达到与其相同的密度介质时不再移动，形成 一系列区带，然后从管底收集。
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ห้องสมุดไป่ตู้
6.举例:细胞核分离
原理： 细胞核特征：体积大，沉降系数大； 密度高，可通过浓蔗糖，分离容易。 分离设计： • 细胞破碎（机械匀浆，渗透溶胀，表面活性剂），
释放细胞核，光镜鉴定释放效果。
• 离心，光镜鉴定分离效果
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学习目标
1. 离心技术的基本概念； 2. 决定离心行为的两个因素和“三要 素”； 3. 沉降系数、离心力和什么因素有关； 4. 离心的基本方法和适用范围； 5. 细胞结构成分的离心分离方法。
4.细胞结构成分的离心分离方法
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四.细胞结构成分的分离
1.细胞沉淀 2.细胞破碎 3.细胞结构成分的分离－离心技术 4.分离细胞器的鉴定和评价
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1.细胞沉淀（cell pellet)
1. 介质密度为1g/ml; 2. 一般细菌和动物细胞密度为1.08-1.12g/ml, 病毒密度为1.18-1.31 g/ml。
s（秒）=
dx/dt w2x
=
2r2(p- m)
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颗粒直径
dx: 颗粒与转轴中心的距离 r:
dt：颗粒沉降所需时间
w: 角速度 X: 转子半径
p : 颗粒密度
m : 溶液介质密度
： 溶液介质粘度
S =1×10-13s
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决定沉降速度的因素：
颗粒大小；颗粒密度；溶液介质密度和粘度
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2.相对离心力（RCF）：重要指标
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3.离心时间
颗粒经过溶液形成沉淀所需要的时间 t=K/S
K: 表示转头离心效力的指标，与转速平方成反比。 离心机公司提供最高转速时的K值。 K值越小越好，效力越高。
S：沉降系数
离心时间由离心效力和沉降系数决定
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沉降离心中的两个因素RCF, t RCF1×t1= RCF2×t2
例：沉降某颗粒需10 000g· min
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一.离心技术 (Centrifuge)
利用溶液中颗粒密度、大小等特性，用旋转产生的 离心力使不同特性颗粒从溶液中分离并沉降，从而 达到分离、浓缩、提纯和鉴定的目的，称为离心技 术。
* 分离细胞或其他的悬浮颗粒；
* 从组织或细胞匀浆中分离细胞器； * 分离病毒和大分子，包括DNA、RNA、蛋白质和脂类。
离心分离时，作用在悬浮颗粒上的力常用RCF数值 表示，即同一颗粒在离心时的离心力同地球重力相 比较后得到的值。
RCF(g)=离心力/重力＝mw2x/mg=w2x/g
＝1.12r(RPM/1000)2
r: 旋转中心轴至转头内离心管某一部位 的半径 RPM（rounds per minute，转速): 转头 旋转的次数
水平转头吊桶盖安装不当； 转头不加盖； O形密封圈失效 金属疲劳 超速 化学腐蚀 离心管帽、垫圈、接合器使用不当
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学习目标
1.离心技术的基本概念 2.离心机转头分类 3.离心的基本方法
4.细胞结构成分的离心分离方法
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三.离心方法
1. 差速离心法
介质无密度梯度，颗粒大小有差异
2. 密度梯度离心法