细菌内毒素检查常见异常结果分析
影响内毒素G试验结果的常见因素
影响内毒素、G试验结果的一些常见因素
一、采血严格按照无菌要求采集，须用专门配套耗材，采血后及时送检。
二、黄疸、溶血、乳糜血会影响检测结果。
三、引起细菌内毒素假阳性原因是：使用某些抗生素类药物，如磺胺类、以细菌为原料加工成的药物。
四、引起G试验假阳性原因有：
1、应用纤维素膜进行血液透析患者；
2、某些纱布或其他医疗物品中含有葡聚糖；
3、某些品牌的静脉制剂（白蛋白、凝血因子、免疫球蛋白等）含有葡聚糖；
4、某些细菌败血病患者（尤其是链球菌败血症）；
5、抗肿瘤药物（如香菇多糖、裂殖菌多糖等）；
6、含有菌类食物。
五、隐球菌和接合菌不能检出。
六、内毒素检测的灵敏度大概为88%，特异性为90%；G试验的灵敏度为88%，特异性为85%。
七、一次检测结果不能成为确诊依据，须由临床医生根据检测结果并结合临床症状及其他检测结果综合分析。
八、G试验适用于深部真菌，浅部真菌在体内血液中含量并不增高。
九、尽管假阳性原因不清，需进行动态监测（1-3）-β-D葡聚糖的变化，可以降低假阳性的发生。
内毒素问题总结报告
内毒素问题总结报告1.目的1.1解决内毒素反复的问题1.2找出内毒素反复的原因2.背景从200501批次验证到200701批次验证一直存在内毒素反复不合格的问题，为了确认内毒素不合格的原因并予以解决，现进行内毒素问题筛查与解决。
3.试验过程3.1初步筛查准备SAM溶液、活化I、活化II、匀浆后溶液按照以下列表取样：按照上述样品取样后，每组样品加入内毒素用水13ml置于37℃、100rpm摇床振摇浸提。
取浸提液100ul加入1.5ml内毒素用水稀释16倍，置于漩涡混合机混合，取100ul 内毒素用水至0.03EU鲎试剂，然后加入100ul混合液封口置于内毒素测定仪37℃反应1h，倒转观察鲎试剂凝固或滴落，以此判定待测产品内毒素是否合格。
试验结果如下：初步筛查结果显示为活化II步骤存在问题，下一步主要针对活化II 进行筛查。
准备活化II、溶液＋CaCl2、溶液＋EDC、清洗未匀浆、200501二楼冻干成品、200501三楼冻干成品样品，按照下表取样：按照上述样品取样后，每组样品加入内毒素用水13ml置于37℃、100rpm摇床振摇浸提。
取浸提液100ul加入1.5ml内毒素用水稀释16倍，置于漩涡混合机混合，取100ul 内毒素用水至0.03EU鲎试剂，然后加入100ul混合液封口置于内毒素测定仪37℃反应1h，倒转观察鲎试剂凝固或滴落，以此判定待测产品内毒素是否合格。
试验结果如下：根据当前两次筛查结果显示，可能在活化II阶段存在干扰，其他步段无法检出干扰因素，分别针对溶液加CaCl2、EDC进行筛查，结果显示均为阴性，因此结合文献推断可能是Ca2+和β-葡聚糖组合干扰。
当前阶段，可供选择的解决方案有：1.采用物理方法排除干扰因素2.采用试剂排除干扰因素3.增大稀释倍数，采用精度更高的鲎试剂4.采用抗增液，结合更高精度鲎试剂3.3物理方法排除干扰针对活化II溶液，采取离心、过滤的方法进行试验。
离心方案为取2.4g溶液在3000rpm离心10min，然后对上清液进行浸提、稀释、检测，结果发现3000rpm离心10min无明显分层现象，且上层呈阳性；过滤方案为取2.4g溶液使用0.22um和0.45um的过滤器进行过滤，对滤液进行浸提、稀释、检测，结果发现溶液使用过滤器容易堵塞过滤器且过滤效率慢，且检测滤液呈阳性。
浅析细菌内毒素检测方法及常见问题
- / 0.125 -0.903
λc＝lg-1(∑X/4) ＝lg-1｛［（-1.22）＋（-0.903）＋（ -1.22 ）＋（ -1.22 ）］/4｝ ＝0.104（EU/ml）
λc在0. 5λ～2.0λ范围内，符合规定。
❖ 方法学验证—供试品干扰预试验 目的：
确证产品对方法是否存在干扰（抑制或增强）， 得到供试品的最大不干扰浓度或最小不干扰稀释倍 数，为正式干扰实验提供依据。
浅析细菌内毒素检 测方法及常见问题
一、细 菌 内 毒 素 简 介
❖ 主要内容
—— 来源 —— 特性 —— 与热源的关系 —— 在药检中应用
❖ 主要来源
主要来自于革兰氏阴性杆菌，当细菌死亡或自 溶后便会释放出内毒素，其化学成分主要是脂多糖 ，这是一种大分子物质，分子量约为106，其粒径 约在1~ 5纳米 。
故：灭菌注射用水≠细菌内毒素检查用水
光度法：
内毒素含量应小于0.005EU/ml；
细菌内毒素检测之凝胶法
❖ 实验程序 1、试验准备：试剂、仪器及用具 2、选择鲎试剂灵敏度，计算样品稀释度 3、鲎试剂灵敏度复核 4、供试品干扰试验（新药或新方法） 5、供试品细菌内毒素凝胶法检测
❖ 实验材料及用具
1、仪器
名词解释2—国家标准品及工作标准品
国家标准品： （单位：EU/ml）
自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核 、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品 的效价；
工作标准品：
经国家标准品稀释用于试验中鲎试剂灵敏度符 复核、干扰试验及各种阳性对照；
名词解释3—细菌内毒素检查用水
凝胶法：
内毒素含量小于0.015EU/ml的灭菌注射用水；
干扰的排除：
—对供试品进行更大倍数的稀释；
5、内毒素检查的常见干扰及消除
湛江安度斯公司的TAL可以抵抗一般水平的β-葡聚糖干扰。 用湛江安度斯公司的抗增液复溶鲎试剂可以消除（1-3）β-D葡
聚糖的干扰。
E3.0
NC E0.03 E0.3
每个浓度的标准内毒素溶液分别与抗增液复溶的 鲎试剂及BET水复溶的鲎试剂反应
0.1mg/ml葡聚糖（抗增液）
0.1mg/ml 葡聚糖
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
¼λ － － － －
SE¼λ ＋ － － －
符合CP要求，但不 符合USP要求
出现表b或表c的极端情况均为不适宜的实验结果，需要检查实 验条件。
干扰的类型
抑制
供试品含有的内毒素浓度≥2倍检测试剂的灵敏 度，但检测结果仍为阴性，称之为假阴性
增强
供试品含有的内毒素浓度低于检测试剂灵敏度 的1/2，但检测结果仍为阳性，称之为假阳性
在标准内毒素制备及使用过程，需要经常旋涡混合其 溶液
避免使用对标准内毒素有吸附作用的实验器具
增强的来源和解决方法
来源
β-葡聚糖是造成鲎试剂结果假阳性的一个已知来源。 美国药典BET法的要求： “除了内毒素，鲎试剂还与某些β-葡聚糖反应。一些经特殊制 备的鲎试剂不会与β-葡聚糖反应，应使用这种鲎试剂检测含β 葡聚糖的样品”
＋
溶液C（Es）
λ
½λ
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
溶液B（Et）
SEλ
SE½ λ
－
－
－
－
－
－
－
－
¼λ － － － －
SE¼ λ － － － －
不符合CP要求，但 符合USP要求
【推荐文档】细菌内毒素检查结果准确性的影响因素PPT
金属离子和弱酸阴离子的影响 注射器刻度不精确，内壁磨沙面吸附内毒素，而且要特别注意注射器针头引入的铁离子对试验结果的干扰，故不宜选用注射器。 常见现象：样品阳性不成立。
➢鲎试剂灵敏度标示值的准确性 。 1） β-葡聚糖样物质的影响
目前我公司研究证明，已知能与鲎试剂发生反应的 物质有细菌内毒素和β-葡聚糖，而内毒素反应曲 线为S型特征曲线，β-葡聚糖反应曲线为经过0点 的斜线。鲎试剂的特异性差的另一种表现，是将其 它物质（如β-葡聚糖）判定为内毒素，错误将合 格药品判为不合格，造成制药厂直接经济损失。
3 实验器皿的影响
器皿的计量管理（校正） 器皿的选择标准 器皿的正确处理
1） 器皿的选择标准
鲎试验对器皿的要求：刻度准确；内表面光 滑；易于清理。细菌内毒素检查实验不宜选用 注射器，最好使用经过校正的刻度玻璃吸管或 吸嘴。注射器刻度不精确，内壁磨沙面吸附内 毒素，而且要特别注意注射器针头引入的铁离 子对试验结果的干扰，故不宜选用注射器。
有部分客户使用厂家生产的细菌内ห้องสมุดไป่ตู้素来复核鲎试剂的灵敏度，这是一种错误行为，更有甚者使用厂家生产的细菌内毒素来交叉复核 鲎试剂的灵敏度，这是一种严重错误行为。 美国、日本药局方以及中国药典故2005版规定检品必须调节PH值6.
鲎试剂灵敏度的误差 细菌内毒素标准品的错误使用
”试验结果只要在这合格范围内表示鲎试剂标示灵敏度准确。 ③若使用的为细菌内毒素国家标准品，可按其使用说明书中的方法将其稀释至规定浓度后分装保存。
标示值是否准确？ 能将其它物质错判为内毒素。
细菌内毒素检查实验不宜选用注射器，最好使用经过校正的刻度玻璃吸管或吸嘴。 是否用细菌内毒素国家标准品标定？ 金属离子和弱酸阴离子的影响 β-葡聚糖样物质的影响
细菌内毒素检查结果准确性的影响因素
Mg2+的参与下才能被激活形成凝胶反应。许多药物因
PH值≥10时，其中的阴离子会吸收鲎试剂中的Ca2+、
标示值是否准确？
2 细菌内毒素标准品引起的误差
细菌内毒素标准品种类 细菌内毒素标准品效价误差
细菌内毒素标准品操作误差
细菌内毒素单位表示误差 细菌内毒素标准品的错误使用
1） 细菌内毒素标家标准品
细菌内毒素工作标准品
2） 细菌内毒素标准品效价误差
品，其中包括, 无热原试管、无热原移液器吸头。 这些产品可以给您的工作带来很大方便,另外，当 实验出现误差时可首先排除器皿方面的因素,很快 分析判断出误差原因。
2） 器皿的正确处理 2005年版《中国药品检验标准操作规范》278页— —细菌内毒素检查法“实验准备”规定：“将被 洗涤的玻璃器皿用洗涤剂和自来水洗净并烘干水
细菌内毒素检查结果准确性的
影响因素
一、试验误差分析及改进措施
鲎试剂质量及灵敏度标示值得的影响
细菌内毒素工作标准品效价及使用的影响
实验器皿的的影响
样品成份及理化性质的影响
实验员的影响
环境的影响
1 鲎试剂质量及灵敏度标示值得的影响
鲎试剂的质量：抗干扰能力，稳定性；
鲎试剂灵敏度标示值的准确性 。 鲎试剂灵敏度的误差 是否用细菌内毒素国家标准品标定？
细菌内毒素国家标准品与细菌内毒素工作标准品 之间或细菌内毒素工作标准品与细菌内毒素工作 标准品之间的生物效价存在一定的误差，用不同 细菌内毒素标准品复核同一批鲎试剂灵敏度时可 能 存 在 一 定 的 误 差 。 中 国 药 典 要 求 “ 当 λc 在 0.5λ-2λ(包括0.5λ和2λ)时，方可用于细菌内毒素 检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏 度。”试验结果只要在这合格范围内表示鲎试剂 标示灵敏度准确。
凝胶法细菌内毒素检查中常遇的问题及解决方法
凝胶法细菌内毒素检查中常遇的问题及解决方法陈邦树广西壮族自治区药品检验所广西南宁530021[摘要] 目的：探讨凝胶法细菌内毒素检查中常遇的问题及解决方法。
方法：对实际工作中遇到的一些具体问题进行多侧面的分析。
结果：对凝胶法细菌内毒素检查中常遇的问题进行分析并提出了解决方法。
结论：凝胶法细菌内毒素检查法影响因素较多，存在的问题仍需多方努力进行克服。
[关键词] 凝胶法环境内毒素鲎试剂问题Some commonly encountered problems and Solution methods on Gel-clot bacterial endotoxins testCHEN Bang-shu（Guangxi zhuang Autonomous Region Institute for Drug Control ，Nanning 530021）[Key words] Gel-clot; natural bacterial endotoxins; TAL; problems细菌内毒素检查法的优越性已为大多数质检人员所体会和认识。
但在实际工作中，也有一些问题使实验者感到困惑。
因此，作者认为有必要对这些问题提出并加以探讨，供大家参考。
1. 选择鲎试剂（TAL）的灵敏度值等于样品原液细菌内毒素限值进行试验是最佳方案吗？未必！选择TAL的灵敏度值等于样品原液细菌内毒素限值进行试验，无疑可节省对样品的稀释，但却不利于减少样品溶液对细菌内毒素试验干扰的可能性。
中国药典从1998年增补本[1] 开始的细菌内毒素检查法已增加了供试品阳性对照（PPC）管，如因样品溶液浓度较高而出现PPC管不凝的情况，会导致试验无效，结果“最佳方案”可能变成重试方案。
如今，国内TAL的制备技术得到了较大的发展，更高灵敏度（0.25 EU.ml -1 、0.125 EU.ml -1 、0.06 EU.ml -1 、0.03 EU.ml -1 ）的TAL供应已不成问题。
细菌内毒素检查常见干扰及消除
常见干扰及消除湛江安度斯生物有限公司2016年7月实验助手APP授权发布BET干扰的普遍性！70%！•一项对人用药品与鲎试验相容性的研究证实了干扰的影响范围，在所研究的品种中仅30%的药品可以不经任何处理直接进行BET；有97%的干扰问题可以通过稀释供试品的方法去消除。
2干扰的表现•凝胶法ChP（2015年）规定无干扰条件：当溶液A和溶液D的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C的结果符合鲎试剂灵敏度复核试验要求时，试验方为有效。
当系列溶液B的结果符合鲎试剂灵敏度复核试验要求时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。
3干扰的类型•抑制–供试品含有的内毒素浓度≥2倍检测试剂的灵敏度，但检测结果仍为阴性，称之为假阴性。
•增强–供试品含有的内毒素浓度低于检测试剂灵敏度的1/2，但检测结果仍为阳性，称之为假阳性。
4光度法的判断？无干扰可接受范围：50%≤回收率≤200%抑制：回收率＜50%增强：回收率＞200%550%200%无干扰增强抑制鲎试剂内毒素 二价阳离子浓度不足聚集高渗透压酶、酶抑制剂LAL-RM 脂质体吸附洗涤剂表面活性剂pH值干扰的因素！pH值的影响鲎试剂中的酶需要在 pH值6~8的范围内才能正常反应，极端的pH环境影响酶的活性，造成抑制一般来说鲎试剂配方中都添加了缓冲剂以帮助样品的pH值的调节，但这不足以解决所有样品的pH问题测定以1:1为比例混合的样品稀释液+鲎试剂的pH值 以获得准确的pH值7解决有关pH的问题1•用BET水对供试品在允许的范围内进行稀释2•用缓冲液制备供试品3•用酸、碱或缓冲液来调节pH8二价阳离子浓度不足Mg2+离子是鲎试剂重要的辅因子，没有Mg2+离子，内毒素将无法激活鲎试剂的酶。
供试品中的螯合剂成分会螯合试剂中的二价阳离子（如Mg2+离子），造成抑制常见的螯合剂有：EDTA、柠檬酸钠、肝素钠、喹诺酮类药物等9解决二价阳离子浓度不足问题1•用BET水对供试品在允许的范围内进行稀释2•使用含Mg 2+或Ca 2+离子的稀释剂稀释样品，降低活性螯合剂含量3•注意过高的二价阳离子（如Ca 2+）浓度可能会带来抑制10高渗透压问题较高浓度的糖或者盐通常会抑制鲎试剂反应，如50%葡萄糖或5%氯化钠溶液。
细菌内毒素检测试验注意事项与误差分析课件下载
➢在进行鲎试剂灵敏度复核、干扰实验和供试 品细菌内毒素检查时，各个实验中要求的对照 应同时进行，并在实验有效的情况才能进行计 算和判断。
➢在进行鲎试剂灵敏度复核、干扰实验和供试 品细菌内毒素检查时，各个实验中要求的对照 应同时进行，并在实验有效的情况才能进行计 算和判断。
二、影响试验结果的因素分析
3） 金属离子和弱酸阴离子
国外内毒素标准品：国标、工作品
细菌内毒素标准品操作误差 细菌内毒素工作标准品（200758-201174）
用 75% 酒 精 棉 球 擦 拭 后 启 开 ，
实验室湿度：45%～75%
防止玻璃屑落入瓶内。 在41～46℃之间，温度对鲎试剂的灵敏度无明显影响；
——2010年版《中国药品检验标准操作规程》
➢影响酶原的激活；
➢影响酶分子的构象，过高过低的PH会改变酶的活 性中心的构象，或甚至改变整个酶分子的机构使 其变性失活。
故鲎试验时，供试品 pH 最好应预调和6.58.0 为好，必要时可用无内毒素的 HCl 或NaOH 稀 溶液调节 pH 值。美国、日本药局方以及中国药典 故2005版规定检品必须调节PH值6.0-8.0。
1 鲎试剂
鲎试剂灵敏度复核的目的不仅是考察鲎试剂 的灵敏度是否准确，也是考查检验人员操作方 法是否正确及实验条件是否符合规定。
因此要求每个实验室在使用一批新的鲎试剂 进行供试品干扰实验或供试品细菌内毒素检查 前必须进行鲎试剂灵敏度复核实验。
——2010版《中国药品检验标准操作规程》
1 鲎试剂
➢外 观：本品为白色或类白色冻干块或粉末， 在水和生理盐水中易溶。
➢蒸馏水
➢有效期
应该特别注意，该规程明确规定最后冲洗玻璃器 皿必须“用蒸馏水冲洗，禁用纯化水冲洗。”有 的客户使用反渗透制备的纯化水冲洗试验用玻璃 器皿，结果试验中所有的阳性对照都为阴性，复 核鲎试剂灵敏度时试验结果误差较大，这主要是 由于纯化水和蒸馏水的质量不同所造成的。
细菌内毒素检查案例分析
规格 0.1ml/支 \ 30ml/瓶 40孔
标示效价 0.03EU/ml 10000EU/支 \ \
数量 8支 1支 1瓶 1台
14
4.例子Ⅱ -凝胶限度法试验
• （3）反应溶液的制备
• 按照干扰试验方法制备各反应溶液，检测结 果如下：
溶液C
溶液B
溶液D 溶液A 溶液A
E0.06 ++
SE0.06 ++
0.015g/ml；
8
3.例子Ⅰ-凝胶法干扰试验
②溶液C的制备 • 取细菌内毒素国家标准品1支，按照使用说明书，
加入1mlBET水，旋涡混合15分钟，得到细菌内毒 素溶液10000EU/ml，稀释到2000EU/ml，分装 0.3ml/瓶。-20℃冷冻保存，备用。 • 把标准内毒素溶液稀释至0.625EU/ml、 0.0625EU/ml、0.03EU/ml、0.015EU/ml和 0.0075EU/ml。
旋涡混合9分钟
吸附内毒素
1500转离心5分钟
分离活性炭
0.22μm滤膜过滤
再分离活性炭
24
3.例子Ⅰ-凝胶限度法试验
（1）供试品 细菌内毒素限值：2.0EU/ml； 细菌内毒素限值：0.2EU/ml；
细菌内毒素检查结果准确性的影响因素
性受到抑制。
PH
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PH对反应速度的影响: 影响酶原的激活； 影响酶分子的构象，过高过低的PH会改变酶的活性 中心的构象，或甚至改变整个酶分子的机构使其变性 失活。
第二十二页，本课件共有31页
故鲎试验时，供试品 pH 最好应预调和6.5-8.0 为 好，必要时可用无内毒素的 HCl 或NaOH 稀溶液调节 pH 值。美国、日本药局方以及中国药典故2005版规定检品 必须调节PH值6.0-8.0。
第十二页，本课件共有31页
2） 器皿的正确处理 2005年版《中国药品检验标准操作规范》278页—— 细菌内毒素检查法“实验准备”规定：“将被洗涤 的玻璃器皿用洗涤剂和自来水洗净并烘干水分后， 置洗液中浸泡4小时，取出将洗液沥干，用自来水将
残余的洗液洗净，再用蒸
第十三页，本课件共有31页
馏水冲洗干燥后置适宜的密闭金属容器中，迅速置烤 箱中，除去玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒素。 ” 应该特别注意，该规程明确规定最后冲洗玻璃器皿必须 “用蒸馏水冲洗，禁用纯化水冲洗。”有的客户使用反 渗透制备的纯化水冲洗试验用玻璃器皿，结果试验中所 有的阳性对
达49℃保温90min也未出现凝胶。
第二十七页，本课件共有31页
从实验可以看出，温度对鲎试剂的灵敏度影响
很大，保温温度在25～41℃之间，随着温度的升 高，反应速度也升高，41℃尚未达到反应速度 峰值，25℃ 时反应速度已相当快；在41～46℃
之间，温度对鲎试剂的灵敏度无明显影响；达到
49℃或更高温度时，随温度升高而使酶蛋白逐渐
②只能取1ml的细菌内毒素检查用水复溶细菌
内毒素工作标准品。 ③若使用的为细菌内毒素国家标准品，可按
其使用说明书中的方法将其稀释至规定浓度后分装 保存。若为细菌内毒素工作标准品，为一次性使用 。
细菌内毒素检查结果准确性的影响因素
影响酶原的激活；
影响酶分子的构象，过高过低的PH会改变酶的 活性中心的构象，或甚至改变整个酶分子的机构 使其变性失活。
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故鲎试验时，供试品 pH 最好应预调和6.58.0 为好，必要时可用无内毒素的 HCl 或NaOH 稀 溶液调节 pH 值。美国、日本药局方以及中国药典 故2005版规定检品必须调节PH值6.0-8.0。
②只能取1ml的细菌内毒素检查用水复溶 细菌内毒素工作标准品。
③若使用的为细菌内毒素国家标准品，可 按其使用说明书中的方法将其稀释至规定浓度后 分装保存。若为细菌内毒素工作标准品，为一次 性使用。
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4） 错误使用
有部分客户使用厂家生产的细菌内毒素来复核 鲎试剂的灵敏度，这是一种错误行为，更有甚 者使用厂家生产的细菌内毒素来交叉复核鲎试 剂的灵敏度，这是一种严重错误行为。
细菌内毒素检查结果准确性的 影响因素
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一、试验误差分析及改进措施
鲎试剂质量及灵敏度标示值得的影响 细菌内毒素工作标准品效价及使用的影响 实验器皿的的影响 样品成份及理化性质的影响 实验员的影响 环境的影响
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1 鲎试剂质量及灵敏度标示值得的影响
➢鲎试剂的质量：抗干扰能力，稳定性； ➢鲎试剂灵敏度标示值的准确性 。
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如果用量不大，使用频率不高，建议大家选用 本公司提供的一次性耗材。无热原耗材是一种在 此行业中被鉴定为无内毒素和β-葡聚糖污染的产 品，其中包括, 无热原试管、无热原移液器吸头。 这些产品可以给您的工作带来很大方便,另外，当 实验出现误差时可首先排除器皿方面的因素,很快 分析判断出误差原因。
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2008 无菌_微生物限度及细菌内毒素检查方法学验证中常见问题及分析_国明
中国药品标准 2008年第 9卷第 1 Nhomakorabea 47以减少膜的吸附, 对于抑菌性较强的注射用无菌粉 末或固体原料, 一定要充分溶解、混合均匀。 114 加菌时机不一致
验证试验主要考虑滤器中残留抗菌物质对阳性 菌生长的影响, 应与对照滤器比较而作出判断, 所以 验证试验中加菌时机要与对照一致 [ 2] 。
115 薄膜过滤法滤膜材质选择不正确, 直接影 响试验结果
20 05年 版药 典执 行以 来药 品 生 产企 业 、科 研 单 位等 在药品质量标准建立及检验工作中困难和问题较多 的项目。我们在药品注册品种的审核检验中, 发现 有的申报单位对方法学验证的意义理解不够, 验证 试验的科学性、完整性及可操作性均存在着很多问 题。为尽快提高方法学验证水平, 更好地保证用药 的安全性, 现将方法学验证工作中常遇到的问题进 行分析、讨论。 1 无菌检查方法学验证问题及分析 111 验证菌株选择不正确 11111 敏感菌株与阳性对照菌不一致, 降低了阳性 对照菌的意义。有些药品选择了敏感菌株进行方法 学验证试验, 但是无菌检查时阳性对照菌不是验证 试验选定的敏感菌株。实际工作中抑制枯草芽孢杆 菌的样品很多, 可用此作为敏感菌株, 但药典规定无 菌检查时以金黄色葡萄球菌作为阳性对照菌, 使金 黄色葡萄球菌失去了阳性对照菌的意义。应在此类 无菌检查时也增加敏感菌株作为阳性对照菌。 11112 2005年版药典无菌检查中规定 / 抗革兰阴 性菌为主的供 试品以大肠埃希菌为对照菌 0, 但方 法学验证规定用菌株没有大肠埃希菌, 缺少了验证 此类药物抗菌作用的代表菌株。建议对抗菌作用中 明确具有抗革兰阴性菌的药品进行无菌检查方法学 验证时, 应增加大肠埃希菌作为验证菌株。 112 验证时取样量不符合要求 11211 无菌检验量与验证试验的取样量不同, 与中 国药典 2005年版方法学验证要求不符。进行供试 品检查时, 所采用的检验方法和检验条件应与验证 的方法相同, 应按照规定的检验数量和检验量取样。 11212 有的生产单位无菌检查方法学验证仅按抽 验产品检验数量进行验证, 药典规定应按照批出厂 产品最少检验数量进行试验 [ 1] 。 113 方法选择错误或不恰当, 不符合 2005 年版中 国药典要求 11311 有的申报单位无菌检查时无论什么药品都 用直接接种法。 2005年版中国药典规定, 只要供试 品性状允许, 应采用薄膜过滤法 [ 1] 。 11312 有些申报单位对非抑菌性供试品也用大量 的冲洗液冲洗, 如每次 100 mL, 10次 /膜, 既增加了 对膜的损伤和对微生物生物特性的破坏机会, 也增 加了检验繁琐性和检验人员的工作量。所以薄膜过 滤时尽 可能 减少 冲 洗量, 冲 洗 不一 定 为每 次 100 mL, 可少量多次, 并注意充分振摇。对于抑菌性较 强的供试品, 可以先用适宜的稀释液稀释后再过滤,
细菌内毒素检测试验注意事项与误差分析
董光宴 工程师
一、实验注意事项
二、影响试验结果的因素分析
湛江博康海洋生物有限公司
2014年10月24日 博康 1
一、试验操作注意事项
——2010年版《中国药品检验标准操作规程》P310细菌内毒素检查法
实验前，须用肥皂洗手，用 75 ％酒精棉球消毒。
2014年10月24日
博康
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2） PH值对反应速度的影响 常见现象：样品阳性不成立。 鲎试剂与内毒素反应的最适宜 pH 在 6.5-8.0 ； pH ≤3 或≥ 10 时， 酶活性受到抑制。
相 对 活 力
7.0
PH
2014年10月24日
博康
33
在使用洗耳球、移液管取样时，应注意不要将 洗耳球中的气体吹入溶液中，以防止气体中的内 毒素进入供试液。 复溶0.5ml鲎试剂时，在旋涡混合器上点击1～3 秒，促进鲎试剂的溶解。
2014年10月24日
博康
2
由于凝集反应是不可逆的，所以在反应过程 中及观察结果时应注意不要使试管受到振动， 以免使凝胶破碎产生假阴性结果。 进行干扰实验时，标准对照系列和含内毒素 的供试品溶液系列应同时进行，并使用同一支 细菌内毒素标准品。
2014年10月24日 博康 19
2） 湿度
吸潮
灵敏度增高 挥发
2014年10月24日
博康
20
5 实验器皿
器皿的计量管理（校正）
器皿的选择标准 器皿的正确处理
2014年10月24日
博康
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1） 器皿的选择标准
2014年10月24日
博康
4
二、影响试验结果的因素分析
鲎试剂
细菌内毒素检查结果准确性的影响因素
精选课件
5
2） 细菌内毒素标准品效价误差
细菌内毒素国家标准品与细菌内毒素工作标准品 之间或细菌内毒素工作标准品与细菌内毒素工作 标准品之间的生物效价存在一定的误差，用不同 细菌内毒素标准品复核同一批鲎试剂灵敏度时可 能 存 在 一 定 的 误 差 。 中 国 药 典 要 求 “ 当 λc 在 0.5λ-2λ(包括0.5λ和2λ)时，方可用于细菌内毒素 检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏 度。”试验结果只要在这合格范围内表示鲎试剂 标示灵敏度准确。
细菌内毒素检查结果准确性的 影响因素
精选课件
1
一、试验误差分析及改进措施
鲎试剂质量及灵敏度标示值得的影响 细菌内毒素工作标准品效价及使用的影响 实验器皿的的影响 样品成份及理化性质的影响 实验员的影响 环境的影响
精选课件
2
1 鲎试剂质量及灵敏度标示值得的影响
➢鲎试剂的质量：抗干扰能力，稳定性； ➢鲎试剂灵敏度标示值的准确性 。
精选课件
15
4 样品成份及理化性质的影响
β-葡聚糖样物质的影响 PH值的影响 金属离子和弱酸阴离子的影响 药物浓度的影响
精选课件
16
1） β-葡聚糖样物质的影响
常见现象：假阳性。
鲎试剂的特异性系指在药品、生物制品和血液制 品中鲎试剂能准确测出被测物质内毒素的能力， 既不能造成样品内毒素的漏检，也不能将其它物 质错判为内毒素。
精选课件
11
如果用量不大，使用频率不高，建议大家选用 本公司提供的一次性耗材。无热原耗材是一种在 此行业中被鉴定为无内毒素和β-葡聚糖污染的产 品，其中包括, 无热原试管、无热原移液器吸头。 这些产品可以给您的工作带来很大方便,另外，当 实验出现误差时可首先排除器皿方面的因素,很快 分析判断出误差原因。
细菌内毒素检查结果准确性的影响因素
3） 金属离子和弱酸阴离子 离子对细菌内毒素测定结果影响较大，一方面阳
离子如Fe3+、Al3+强度较大会引起内毒素的聚集造成内 毒素局部浓度过高，同时还必须注意高价阳离子（如 Fe3+）的氧化性对鲎试剂酶反应具有强抑制作用；重金 属离子如Ag+、Cu2+、Pb2+可以使蛋白质变性而使酶失 活；另一方面鲎试剂必须在二价阳离子Ca2+、Mg2+的
第九页，编辑于星期五：二十一点 四十三分。
3 实验器皿的影响
器皿的计量管理（校正） 器皿的选择标准
器皿的正确处理
第十页，编辑于星期五：二十一点 四十三分。
1） 器皿的选择标准
鲎试验对器皿的要求：刻度准确；内表面光 滑；易于清理。细菌内毒素检查实验不宜选用注 射器，最好使用经过校正的刻度玻璃吸管或吸嘴。 注射器刻度不精确，内壁磨沙面吸附内毒素，而 且要特别注意注射器针头引入的铁离子对试验结 果的干扰，故不宜选用注射器。
第十二页，编辑于星期五：二十一点 四十三分。
2） 器皿的正确处理
2005年版《中国药品检验标准操作规范》278页— —细菌内毒素检查法“实验准备”规定：“将被洗 涤的玻璃器皿用洗涤剂和自来水洗净并烘干水分后， 置洗液中浸泡4小时，取出将洗液沥干，用自来水 将残余的洗液洗净，再用蒸
第十三页，编辑于星期五：二十一点 四十三分。
第二十七页，编辑于星期五：二十一点 四十三 分。
从实验可以看出，温度对鲎试剂的灵敏度影响很 大，保温温度在25～41℃之间，随着温度的升高， 反 应 速 度 也 升 高 ， 41℃ 尚 未 达 到 反 应 速 度 峰 值 ， 25℃ 时反应速度已相当快；在41～46℃之间，温 度对鲎试剂的灵敏度无明显影响；达到49℃或更高 温度时，随温度升高而使酶蛋白逐渐变性，则鲎试 剂被破坏，反应速度反而降低。
细菌内毒素检查结果准确性的影响因素
2） 细菌内毒素标准品效价误差
细菌内毒素国家标准品与细菌内毒素工作标准品 之间或细菌内毒素工作标准品与细菌内毒素工作 标准品之间的生物效价存在一定的误差，用不同 细菌内毒素标准品复核同一批鲎试剂灵敏度时可 能 存 在 一 定 的 误 差 。 中 国 药 典 要 求 “ 当 λc 在 0.5λ-2λ(包括0.5λ和2λ)时，方可用于细菌内毒素 检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏 度。”试验结果只要在这合格范围内表示鲎试剂 标示灵敏度准确。
4 样品成份及理化性质的影响
β-葡聚糖样物质的影响 PH值的影响 金属离子和弱酸阴离子的影响 药物浓度的影响
1） β-葡聚糖样物质的影响
常见现象：假阳性。
鲎试剂的特异性系指在药品、生物制品和血液制 品中鲎试剂能准确测出被测物质内毒素的能力， 既不能造成样品内毒素的漏检，也不能将其它物 质错判为内毒素。
3 实验器皿的影响
器皿的计量管理（校正） 器皿的选择标准 器皿的正确处理
1） 器皿的选择标准
鲎试验对器皿的要求：刻度准确；内表面光 滑；易于清理。细菌内毒素检查实验不宜选用 注射器，最好使用经过校正的刻度玻璃吸管或 吸嘴。注射器刻度不精确，内壁磨沙面吸附内 毒素，而且要特别注意注射器针头引入的铁离 子对试验结果的干扰，故不宜选用注射器。
如果用量不大，使用频率不高，建议大家选用 本公司提供的一次性耗材。无热原耗材是一种在 此行业中被鉴定为无内毒素和β-葡聚糖污染的产 品，其中包括, 无热原试管、无热原移液器吸头。 这些产品可以给您的工作带来很大方便,另外，当 实验出现误差时可首先排除器皿方面的因素,很快 分析判断出误差原因。
2） 器皿的正确处理
故鲎试验时，供试品 pH 最好应预调和6.58.0 为好，必要时可用无内毒素的 HCl 或NaOH 稀 溶液调节 pH 值。美国、日本药局方以及中国药典 故2005版规定检品必须调节PH值6.0-8.0。
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BET常见异常
结果分析
湛江安度斯生物有限公司
2016年7月
实验助手APP授权发布
1
BET常见异常结果分析
凝胶法
灵敏度复核不符合规定
阳性对照阴性供试品阳性
对照阴性
阴性对照
阳性
供试品一
阳一阴
2
1.阴性对照为阳性
✓实验环境-有扬尘；
✓实验操作不规范-人为污染；
✓配套用品（移液管、反应管、吸头污染或没有完全除热原）
✓试剂性能-鲎试剂或水出问题
✓设备-恒温水浴，水滴进反应混合液中
3
2.阳性对照为阴性
✓标准内毒素溶液的制备是否准确；
✓试剂性能（内毒素标准品、鲎试剂和检查用水的质量和是否匹配）；
✓配套用品（移液管、稀释管、反应管、吸头是否有干扰）；
✓操作是否规范；
✓设备-恒温孵育的温度和时间是否合适；✓实验环境；
4
3.供试品阳性对照为阴性
阳性对照为阴性，供试品阳性对照为
阴性—参考实验结果出现异常的分析2） 阳性对照为阳性，供试品阳性对照为
阴性
✓供试品阳性对照溶液配制是否正确；
✓供试品有抑制干扰作用；
✓配套用品（稀释管、反应管、移液用
具是否有干扰）；
✓其他
5
4.阴性对照正常，供试品为阳性
供试品内毒素含量不符合规定；
污染
✓配套用品（稀释管、反应管、刻度吸管、吸头）；
✓试验操作、环境、试剂等
假阳性-增强干扰作用
•凝胶法中，没有对照项可以判断供试品是否存在增强作用。
6
4.阴性对照正常，供试品为阳性
假阳性
的判断
凝胶法
检测
配套稀释液抗增液
复溶鲎
试剂
特异性
鲎试剂
光度法
检测
分析内
毒素含
量
反应动
力学曲
线分析
7
5.同一供试品结果有时阳性，有时阴性
样品
✓供试品内毒素含量在1/2L左右；
✓供试品存在干扰
试剂-不同试剂，抗干扰能力不同
试验条件（环境、人员操作技能、恒温孵育温度和时间）
8
6.灵敏度复核不符合规定
参照案例分析（二）鲎试剂灵敏度复核不符合规定原因调查。
9
BET常见异常结果分析
光度法
标准曲线的线性不合格
变异系数大内毒素回收率
不合格
阴性对照不合
格
不正确的预设
Rt或OD值，
导致的异常结
果
10
1.线性不足
标准内毒素
•某个标准内毒素浓度制备误差•标准品旋涡混合不充分
•标准品储存不当或用具干扰试剂
•污染
•检测能力不足
仪器设置
•不正确的预设Rt/OD值
不正确的反应时间
•终点法
11
2.阴性对照不合格
配套用品激活（污染）鲎试剂
✓塑料吸头和吸管可激活或污染鲎试剂 反应试管或孔没有完全除内毒素
操作污染
✓细菌内毒素检查用水
✓鲎试剂
✓反应试管或孔受污染
试剂灵敏度不足或不合适的预设Rt/OD
12
3.变异系数偏大
气泡试剂
质量加样
误差
试管/
孔受
污染
移液
管/吸
头污
染
样品
沉淀
或悬
浮
内毒
素添
加的
量不
准确
13
4.回收率问题
标准内毒素溶液制备或加入不准确 试剂加入不准确
样品
✓内毒素浓度太高
✓抑制作用
✓增强作用
✓工艺、原辅料的改变
14
5.不正确的预设Rt或OD值，导致的异
常结果
预设Rt/OD值指光度变化值，是一个参考值，一般由鲎试剂生产厂家提供。
合适的预设Rt/OD值
✓标准曲线最低点浓度在设定时间内能达到预设
Rt/OD值
✓标准曲线最低点浓度在设定时间内反应时间和阴性对照有差异
✓标准曲线的相关系数|r| ≥ 0.980
预设Rt/OD值的取值范围越宽，鲎试剂的稳健性越好（安度斯光度法试剂的特征）
15
光度变化预设值的影响
预设OD值0.02
相关系数-0.9990
0.0024
供试品内毒素含量
（EU/ml）
回收率92.9%
50.50.050.00
5
16
光度变化预设值的影响
预设OD值0.05
相关系数-0.9984
＜0.0038
供试品内毒素含量
（EU/ml）
回收率102.3%
50.50.050.00
5
17
光度变化预设值的影响
预设OD值0.1相关系数
-0.9985供试品内毒素含量（EU/ml）＜0.0051回收率
?104.6%50.5
0.05
0.005
标准曲线最低点浓度OD值不达限18
安度斯光度法鲎试剂预设光度变化值
（建议）
表1：动态试管检测仪-405nm
仪器名称动态试管检测仪厂家莱伯金耐特
检测波长405nm
光度法试剂动态浊度法动态显色法
预设Rt值95%92%
表2：动态试管检测仪-660nm
仪器名称动态试管检测仪厂家莱伯金耐特
检测波长660nm
光度法试剂动态浊度法动态显色法
预设Rt值95%/
安度斯光度法鲎试剂预设光度变化值
（建议）
表3：ELx808IU酶标仪-405nm
仪器名称ELx808IU酶标仪厂家美国伯腾
检测波长405nm
光度法试剂动态浊度法动态显色法
预设OD值0.030.05
表4：FC/ET型酶标仪-405nm
仪器名称FC/ET型酶标仪厂家赛默飞世尔
检测波长405nm
光度法试剂动态浊度法动态显色法（微孔板法）
预设OD值/0.1
20。