JNK 抑制剂对D2 氨基葡萄糖衍生物诱导人食管癌Eca2109 细胞周期阻滞和凋亡的影响
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1 实验
111 材料 人食管癌细胞株 Eca2109由兰州大学第一医院
中心实验室保存 ; COPADG由中国科学院兰州化学 物理研究所合成并惠赠 ,分子式为 : C10 H17 NO8 , 用 RPM I1640培养液配成所需浓度的工作液 ,过滤除 菌 , 4 ℃保存 ;特异性 JNK抑制剂 SP600125 (用少许 二甲基亚砜溶解配制成 40 mmol/L的储液 , 4 ℃下保 存 ,临用时稀释 )和 M TT、P I (均 Sigma 公司 ) ,一抗 小鼠抗人 P2JNK mAb, 内参照 β2actin mAb及二抗 辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠 IgG ( Santa cruz公 司 ) , R IPA 细胞裂解液 (上海申能博彩生物公司 ) , 硝酸 纤 维 素 膜 (NC 膜 ) (瑞 典 Amersham 公 司 ) , EP ICS XL 型流式细胞仪 (美国 Beckman coulter公 司 ) ,WALLAC 1420型多功能时间分辨仪 (芬兰 V ic2 tor公司 ) 。
源自文库
2009129 (3)
ation of Eca2109 cells and induced them into apop to sis and cell2cycle arrest in G0 / G1 phase. W estern blo t showed that the p rotein exp ression of P2JNK was increased in a dose2dependent manner in Eca2109 cells after stimulation by COPADG. SP600125 rem arkablely inhibited the p rotein exp ression of P2JNK as well as the apop tosis rate and cell grow th inhibitory rate in Eca2109 cells induced by COPADG as compared w ith those treated w ith only COPADG, m eanwhile, cell2cycle arrest in G0 / G1 phase p rogressed to cell2cycle arrest in G2 /M phase. Conclusion JNK sig2 naling pathway m ay p lay an important role in apop tosis of Eca2109 induced by the COPADG. Key words: 22(32carboxy212oxop ropyl) am ino222deoxy2D 2Glucose; esophageal cancer; apop tosis; C2JUN NH2 term inal p rotein ki2
Q IANG Zhan2rong2 , WU J ing1, 23 , YANG Guo2dong2 , L I Juan2 , ZHOU Yong2ning2 , WAN G A i2qing3 , XU E Q un2ji3
( 11Dep t of Gastroenterology, the N inth Clinic Medcine College of Beijing University, Beijing Shijitan Hosp ital, Beijing 100038; 21Dep t. of Gastroenterology, the First Hosp ital of Lanzhou University, Lanzhou 730000; 3. Lanzhou Institute of Chem ical and Physics,
摘要 :目的 观察特异性 C2JUN氨基末端激酶 (JNK)抑制剂 SP600125对 D 2氨基葡萄糖衍生物 22(32羧基 212丙酰氨
基 ) 222脱氧 2D 2葡萄糖 (COPADG)诱导的 Eca2109细胞凋亡和细胞周期阻滞的影响 ,并探讨 COPADG诱导 Eca2109 细胞凋亡的潜在分子机制 。方法 体外培养 Eca2109 细胞 ,以 COPADG及 SP600125 与细胞作用 ; W estern blot法检 测 P2JNK蛋白表达 , M TT法检测细胞增殖 ,流式细胞 术检测细胞周期 。结果 COPADG显著增加 Eca2109 细胞 P2JNK蛋白的表达和细胞凋亡率 ,且诱导 Eca2109细胞发生 G0 / G1 期细胞阻滞 , SP600125明显减少 Eca2109细胞凋 亡 ,并使 G0 / G1 期细胞阻滞向 G2 /M 期细胞阻滞发展 。结论 COPADG可能通过激活 JNK信号通路诱导 Eca2109细 胞凋亡 。
收稿日期 : 2008 - 05 - 20 修回日期 : 2008 - 10 - 06 基金项目 : 中国科学院西部之光项目 (NO CX805) 3 通信作者 ( correspond ing author) : wujing36@163. com
260
基础医学与临床 B asic & Clinical M edicine
关键词 : 22(32羧基 212丙酰氨基 ) 222脱氧 2D 2葡萄糖 ; 食管癌 ; 凋亡 ; C2JUN氨基末端激酶 ; 细胞周期阻滞
中图分类号 : R 73511 文献标志码 : A
Effect of JNK inhibitor on apop tosis and cell cycle arrest of human esophageal cancer cell line Eca2109 induced by the derivative of D 2am ine2glucose
nase; cell2cycle arrest
D 2氨基葡萄糖衍生物具有较强的抑制肿瘤作 用 ,而对人体正常细胞毒性很小 ,因而有极大的潜在 临床应用价值 [ 1 ] 。 22( 32羧基 212丙酰氨基 ) 222脱氧 2 D 2葡萄糖 [ 22( 32carboxy212oxop ropyl) am ino222deoxy2 D 2Glucose, COPADG ]是一种含羧基侧链的 D 2氨基葡 萄糖衍生物 ,能够显著诱导人食管癌 Eca2109细胞 、 人肝细胞癌 HepG2 细胞和人结肠癌细胞 SW 1116细 胞凋亡 [ 2 - 4 ] ,但诱导细胞凋亡的内在机制仍不甚明 了 。C2JUN 氨基末端激酶 ( C2JUN NH22term inal ki2 nase, JNK) 是有丝分裂原活化蛋白激酶 (m itogen activated p rotein kinase, MAPK)家族成员之一 。研 究表明 , JNK通路的激活与细胞凋亡有密切关系 [ 5 ] 。 本研究从体外细胞学实验的角度来研究 COPADG 抗人食管癌的作用并探讨其作用机制 。
112 方法 11211 细胞培养 : 人食管癌 Eca2109 细胞稀释成 1 ×108L - 1分别接种于新的培养瓶中 ,用含小牛血清 的 RPM I1640全培养液 (青霉素 1 ×105U /L ,链霉素 100 mg /L )在饱和湿度 , 37 ℃, 5% CO2 孵箱中培 养传代 。 11212 实验分组 : 实验随机分为 4组 , 未加药对照 组 (D组 ) ; SP600125组 (A 组 )每孔加入 20μmol/L的 SP600125; COPADG 组 ( B 组 ) 加 入 30μmol/L 的 COPADG; COPADG + 抑 制 剂 组 ( C 组 ) 先 加 入 20μmol/L 的 SP600125 孵 育 30 m in 后 再 加 入 30μmol/L的 COPADG。W estern blot实验还另设终 浓度分别为 10、20 和 40μmol/L的 COPADG作用组 。 11213 W estern blot检测细胞内 P2JNK蛋白 (活化 的 JNK)表达变化 : 收集各药物处理组及对照组细 胞 ,细胞裂解液裂解细胞 ,抽提蛋白 ,确定总蛋白浓 度 ,每个加样孔上样 50μg蛋白 , 40 V 恒定电压使溴 粉蓝染料从 50 g /L浓缩胶进入 150 g /L分离胶后 ,以 100 V恒定电压电泳至分离胶底端 , 50 V电压 4 ℃转 移 115 h, 丽春红 S染色确定是否转印成功 ,小牛血 清封闭 30 m in, 加 入 一 抗 ( 1∶400 ) 过 夜 , PB S2T 洗 膜 ,加二抗 (1∶600) 37 ℃摇床孵育 2 h, DAB 显色 ,照 相 ,显色条带采用 Bandscan分析软件测定成像条带 平均吸 光 度 值 , 以 目 的 基 因 /内 参 照 (即 P2JNK / β2actin)平均吸光度比值半定量分析 P2JNK蛋白表 达。 11214 M TT法检测细胞增殖活力 : 取对数生长期 的 Eca2109 细胞 ,经胰酶消化后 ,吹打成单细胞悬 液 ,调整细胞数为 1 ×109L - 1 ,以每孔 20μL单细胞悬 液及等量小牛血清 ,接种于 96 孔板 ,分别加入不同 药物 ,每组设 4 ～8 个复孔 ,用 RPM I1640 调整每孔 的总体积为 200μL ,另设不加药的阴性对照组 ,待药
2009年 3月 第 29卷 第 3期
基础医学与临床 Basic & C linical M edicine
文章编号 : 1 0 0 1 26 3 2 5 ( 2 0 0 9 ) 0 3 20 2 5 9 20 5
M arch 2009 Vol. 29 No. 3
研究论文
JNK抑制剂对 D2氨基葡萄糖衍生物诱导人食管癌 Eca2109 细胞周期阻滞和凋亡的影响
Chinese Scientific Academy, Lanzhou 730000, China)
Abstract: O bjective To exp lore the effect of SP600125, a specific C2JUN NH2 term inal p rotein kinase ( JNK) inhibitor, on apop tosis and cell2cycle arrest of the human esophageal cancer cell line Eca2109 induced by 22( 32 carboxy212oxop ropyl) am ino222deoxy2D 2Glucose ( COPADG) and potential molecular m echanism in COPADG2in2 duced cell apop tosis was discussed. M ethods Eca2109 cells were cultured and then p re2incubated w ith SP600125 for 30 m in p rior to exposure to COPADG of different concentrations and for different tim es. Changes of exp ression of P2JNK p rotein were exam ined by W estern blot; Cell grow th inhibitory rate was detected by M TT colorim etric assay; Apop tosis and cell2cycle arrest were analyzed by flow cytometry. Results COPADG significantly inhibited p ro lifer2
强占荣 2 , 吴 静 1, 23 , 杨国栋 2 , 李 娟 2 , 周永宁 2 , 王爱勤 3 , 薛群基 3
(11北京世纪坛医院 北京大学 第九临床医学院 消化科 , 北京 100038; 21兰州大学 第一医院 消化科 , 甘肃 兰州 730000; 31中国科学院 兰州化学物理研究所 , 甘肃 兰州 730000)
111 材料 人食管癌细胞株 Eca2109由兰州大学第一医院
中心实验室保存 ; COPADG由中国科学院兰州化学 物理研究所合成并惠赠 ,分子式为 : C10 H17 NO8 , 用 RPM I1640培养液配成所需浓度的工作液 ,过滤除 菌 , 4 ℃保存 ;特异性 JNK抑制剂 SP600125 (用少许 二甲基亚砜溶解配制成 40 mmol/L的储液 , 4 ℃下保 存 ,临用时稀释 )和 M TT、P I (均 Sigma 公司 ) ,一抗 小鼠抗人 P2JNK mAb, 内参照 β2actin mAb及二抗 辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠 IgG ( Santa cruz公 司 ) , R IPA 细胞裂解液 (上海申能博彩生物公司 ) , 硝酸 纤 维 素 膜 (NC 膜 ) (瑞 典 Amersham 公 司 ) , EP ICS XL 型流式细胞仪 (美国 Beckman coulter公 司 ) ,WALLAC 1420型多功能时间分辨仪 (芬兰 V ic2 tor公司 ) 。
源自文库
2009129 (3)
ation of Eca2109 cells and induced them into apop to sis and cell2cycle arrest in G0 / G1 phase. W estern blo t showed that the p rotein exp ression of P2JNK was increased in a dose2dependent manner in Eca2109 cells after stimulation by COPADG. SP600125 rem arkablely inhibited the p rotein exp ression of P2JNK as well as the apop tosis rate and cell grow th inhibitory rate in Eca2109 cells induced by COPADG as compared w ith those treated w ith only COPADG, m eanwhile, cell2cycle arrest in G0 / G1 phase p rogressed to cell2cycle arrest in G2 /M phase. Conclusion JNK sig2 naling pathway m ay p lay an important role in apop tosis of Eca2109 induced by the COPADG. Key words: 22(32carboxy212oxop ropyl) am ino222deoxy2D 2Glucose; esophageal cancer; apop tosis; C2JUN NH2 term inal p rotein ki2
Q IANG Zhan2rong2 , WU J ing1, 23 , YANG Guo2dong2 , L I Juan2 , ZHOU Yong2ning2 , WAN G A i2qing3 , XU E Q un2ji3
( 11Dep t of Gastroenterology, the N inth Clinic Medcine College of Beijing University, Beijing Shijitan Hosp ital, Beijing 100038; 21Dep t. of Gastroenterology, the First Hosp ital of Lanzhou University, Lanzhou 730000; 3. Lanzhou Institute of Chem ical and Physics,
摘要 :目的 观察特异性 C2JUN氨基末端激酶 (JNK)抑制剂 SP600125对 D 2氨基葡萄糖衍生物 22(32羧基 212丙酰氨
基 ) 222脱氧 2D 2葡萄糖 (COPADG)诱导的 Eca2109细胞凋亡和细胞周期阻滞的影响 ,并探讨 COPADG诱导 Eca2109 细胞凋亡的潜在分子机制 。方法 体外培养 Eca2109 细胞 ,以 COPADG及 SP600125 与细胞作用 ; W estern blot法检 测 P2JNK蛋白表达 , M TT法检测细胞增殖 ,流式细胞 术检测细胞周期 。结果 COPADG显著增加 Eca2109 细胞 P2JNK蛋白的表达和细胞凋亡率 ,且诱导 Eca2109细胞发生 G0 / G1 期细胞阻滞 , SP600125明显减少 Eca2109细胞凋 亡 ,并使 G0 / G1 期细胞阻滞向 G2 /M 期细胞阻滞发展 。结论 COPADG可能通过激活 JNK信号通路诱导 Eca2109细 胞凋亡 。
收稿日期 : 2008 - 05 - 20 修回日期 : 2008 - 10 - 06 基金项目 : 中国科学院西部之光项目 (NO CX805) 3 通信作者 ( correspond ing author) : wujing36@163. com
260
基础医学与临床 B asic & Clinical M edicine
关键词 : 22(32羧基 212丙酰氨基 ) 222脱氧 2D 2葡萄糖 ; 食管癌 ; 凋亡 ; C2JUN氨基末端激酶 ; 细胞周期阻滞
中图分类号 : R 73511 文献标志码 : A
Effect of JNK inhibitor on apop tosis and cell cycle arrest of human esophageal cancer cell line Eca2109 induced by the derivative of D 2am ine2glucose
nase; cell2cycle arrest
D 2氨基葡萄糖衍生物具有较强的抑制肿瘤作 用 ,而对人体正常细胞毒性很小 ,因而有极大的潜在 临床应用价值 [ 1 ] 。 22( 32羧基 212丙酰氨基 ) 222脱氧 2 D 2葡萄糖 [ 22( 32carboxy212oxop ropyl) am ino222deoxy2 D 2Glucose, COPADG ]是一种含羧基侧链的 D 2氨基葡 萄糖衍生物 ,能够显著诱导人食管癌 Eca2109细胞 、 人肝细胞癌 HepG2 细胞和人结肠癌细胞 SW 1116细 胞凋亡 [ 2 - 4 ] ,但诱导细胞凋亡的内在机制仍不甚明 了 。C2JUN 氨基末端激酶 ( C2JUN NH22term inal ki2 nase, JNK) 是有丝分裂原活化蛋白激酶 (m itogen activated p rotein kinase, MAPK)家族成员之一 。研 究表明 , JNK通路的激活与细胞凋亡有密切关系 [ 5 ] 。 本研究从体外细胞学实验的角度来研究 COPADG 抗人食管癌的作用并探讨其作用机制 。
112 方法 11211 细胞培养 : 人食管癌 Eca2109 细胞稀释成 1 ×108L - 1分别接种于新的培养瓶中 ,用含小牛血清 的 RPM I1640全培养液 (青霉素 1 ×105U /L ,链霉素 100 mg /L )在饱和湿度 , 37 ℃, 5% CO2 孵箱中培 养传代 。 11212 实验分组 : 实验随机分为 4组 , 未加药对照 组 (D组 ) ; SP600125组 (A 组 )每孔加入 20μmol/L的 SP600125; COPADG 组 ( B 组 ) 加 入 30μmol/L 的 COPADG; COPADG + 抑 制 剂 组 ( C 组 ) 先 加 入 20μmol/L 的 SP600125 孵 育 30 m in 后 再 加 入 30μmol/L的 COPADG。W estern blot实验还另设终 浓度分别为 10、20 和 40μmol/L的 COPADG作用组 。 11213 W estern blot检测细胞内 P2JNK蛋白 (活化 的 JNK)表达变化 : 收集各药物处理组及对照组细 胞 ,细胞裂解液裂解细胞 ,抽提蛋白 ,确定总蛋白浓 度 ,每个加样孔上样 50μg蛋白 , 40 V 恒定电压使溴 粉蓝染料从 50 g /L浓缩胶进入 150 g /L分离胶后 ,以 100 V恒定电压电泳至分离胶底端 , 50 V电压 4 ℃转 移 115 h, 丽春红 S染色确定是否转印成功 ,小牛血 清封闭 30 m in, 加 入 一 抗 ( 1∶400 ) 过 夜 , PB S2T 洗 膜 ,加二抗 (1∶600) 37 ℃摇床孵育 2 h, DAB 显色 ,照 相 ,显色条带采用 Bandscan分析软件测定成像条带 平均吸 光 度 值 , 以 目 的 基 因 /内 参 照 (即 P2JNK / β2actin)平均吸光度比值半定量分析 P2JNK蛋白表 达。 11214 M TT法检测细胞增殖活力 : 取对数生长期 的 Eca2109 细胞 ,经胰酶消化后 ,吹打成单细胞悬 液 ,调整细胞数为 1 ×109L - 1 ,以每孔 20μL单细胞悬 液及等量小牛血清 ,接种于 96 孔板 ,分别加入不同 药物 ,每组设 4 ～8 个复孔 ,用 RPM I1640 调整每孔 的总体积为 200μL ,另设不加药的阴性对照组 ,待药
2009年 3月 第 29卷 第 3期
基础医学与临床 Basic & C linical M edicine
文章编号 : 1 0 0 1 26 3 2 5 ( 2 0 0 9 ) 0 3 20 2 5 9 20 5
M arch 2009 Vol. 29 No. 3
研究论文
JNK抑制剂对 D2氨基葡萄糖衍生物诱导人食管癌 Eca2109 细胞周期阻滞和凋亡的影响
Chinese Scientific Academy, Lanzhou 730000, China)
Abstract: O bjective To exp lore the effect of SP600125, a specific C2JUN NH2 term inal p rotein kinase ( JNK) inhibitor, on apop tosis and cell2cycle arrest of the human esophageal cancer cell line Eca2109 induced by 22( 32 carboxy212oxop ropyl) am ino222deoxy2D 2Glucose ( COPADG) and potential molecular m echanism in COPADG2in2 duced cell apop tosis was discussed. M ethods Eca2109 cells were cultured and then p re2incubated w ith SP600125 for 30 m in p rior to exposure to COPADG of different concentrations and for different tim es. Changes of exp ression of P2JNK p rotein were exam ined by W estern blot; Cell grow th inhibitory rate was detected by M TT colorim etric assay; Apop tosis and cell2cycle arrest were analyzed by flow cytometry. Results COPADG significantly inhibited p ro lifer2
强占荣 2 , 吴 静 1, 23 , 杨国栋 2 , 李 娟 2 , 周永宁 2 , 王爱勤 3 , 薛群基 3
(11北京世纪坛医院 北京大学 第九临床医学院 消化科 , 北京 100038; 21兰州大学 第一医院 消化科 , 甘肃 兰州 730000; 31中国科学院 兰州化学物理研究所 , 甘肃 兰州 730000)