酒窖底泥中丁酸梭菌的分离及其特性研究
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
］ ５ ～ ６ 序［ 。
２ 结果
２ １ 丁酸梭菌的分离培养与鉴定 实验通过 ２ １ １ 酒窖底泥中丁酸梭菌的分离培养： 稀释涂平板法分离培养后共挑取 １ 株单菌落， 其培 ４ 养特征和显微形态见表 １ 。根据《 伯杰细菌鉴定手 册》 ， 丁酸梭菌为严格厌氧杆菌， 内生孢子卵圆， 偏心
］ ７ ～ ９ 行活菌计数， 计算存活率［ 。
致病菌的单独培 １ ２ ９ 肠道致病菌体外拮抗实验： 养： 将０ 活化好的致病菌菌悬液转接入 ９ １ｍ Ｌ ９ｍ Ｌ 置３ 分别在 ０ 、 、 Ｒ Ｃ Ｍ液体培养基， ７℃静止培养， ｈ ４ ｈ 、 、 、 、 、 、 ８ ｈ １ ２ ｈ １ ６ ｈ ２ ０ ｈ ２ ４ ｈ ３ ６ ｈ ４ ８ ｈ取 菌 液 测 活 菌 数 和 ｐ Ｈ值。 丁酸梭菌和致病菌混合培养： 活化好的丁酸梭
４ ５ 菌和致病菌菌液均稀释到 １ ， 各 ０ ｃ ｆ ｕ ? ｍ Ｌ ～ １ ０ ｃ ｆ ｕ ? ｍ Ｌ
明胶液化试 １ ２ ２ 分离菌株生理生化实验鉴定： 验、 密二糖、 松三糖、 淀粉水解试验和石蕊牛乳试验
［ ］ ３ 参照《 伯杰细菌鉴定手册》 和《 常见细菌系统鉴定 ［ ］ ４ 进行。 手册》
提取纯 １ ２ ３ 分离菌株 １ ６ Ｓｒ Ｄ Ｎ Ａ序列分析鉴定： ， 设计 Ｐ ： 化细 菌 总 Ｄ Ｎ Ａ Ｃ Ｒ 引 物 分 别 为： Ｐ ０ ５ ′ ， Ｇ Ａ Ｇ Ｔ Ｔ Ｔ Ｇ Ａ Ｔ Ｃ Ｍ Ｔ Ｇ Ｇ Ｃ Ｔ Ｃ Ａ Ｇ ３ ′ ： Ｐ Ｃ ３ ５ ′ 。Ｐ Ｃ Ｒ程序为： ９ ５℃ ５ Ｃ Ｔ Ａ Ｈ Ａ Ｇ Ｇ Ｇ Ｔ Ａ Ｔ Ｃ Ｔ Ａ Ａ Ｔ Ｃ Ｃ Ｔ ３ ′ ， ， ， ， 个循环 ９ ４℃ １ｍ ｉ ｎ ５ ０℃ １ｍ ｉ ｎ ７ ２℃ １ｍ ｉ ｎ ３ ０ ｍ ｉ ｎ 后７ 。Ｐ ２℃ 延 伸 １ ０ｍ ｉ ｎ Ｃ Ｒ产 物 的 回 收 纯 化 并 测
。
由于耐药性问题， 抗生素在饲料中应用受到严 格的限制， 动物微生态制剂被认为是取代抗生素最 具潜力的发展方向。丁酸梭菌产生内生芽孢， 在生 产加工和储藏过程中优势明显， 在饲料工业中的应
］ ２ 用前景非常诱人［ 。近年来国内对丁酸梭菌的研究
多集中在医学方面， 饲料方面的研究也逐渐升温， 菌 种多分离自人和动物肠道， 许多其它环境的潜在优 良菌株还有待发现。本研究中， 作者从酒窖底泥中
［ ］ 进行生理生化鉴定和 １ ６ Ｓｒ Ｄ Ｎ Ａ序列分析鉴定 ５～６ 。
耐胆汁实验： 取０ １ ２ ８ ２ｍ Ｌ离心洗涤菌悬液接种 于含 ０ １ ％、 ０ ３ ％、 ０ ５ ％猪胆盐的 ２ ｍ ＬＲ Ｃ Ｍ液体培 养基中。置 ３ 分别于 ０ 、 、 、 进 ７℃培养箱中， ｈ １ ｈ ２ ｈ ３ ｈ
Ｓ ｔ ｕ ｄ ｙｏ ｎＩ ｓ ｏ ｌ ａ ｔ ｉ ｏ ｎｏ ｆ Ｃ ｌ ｏ ｓ ｔ ｒ ｉ ｄ ｉ ｕ ｍＢ ｕ ｔ ｙ ｒ ｉ ｃ ｕ ｍｆ ｏ ｒ ｍＰ ｉ ｔ ｓ Ｓ ｌ ｕ ｄ ｇ ｅ ａ ｎ ｄｉ ｔ ｓ Ｃ ｈ ａ ｒ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｓ ｔ ｉ ｃ ｓ
Ｘ Ｉ ＥＳ ｈ ｕ Ｇ ｕ ｉＤ Ａ Ｉ Ｑ ｉ ｎ ｇ Ｚ Ｈ Ａ ＯＳ ｈ ｕ Ｍ ｉ ａ ｏ Ｌ Ｉ Ａ Ｎ ＧＹ ｕ ｎ Ｘ ｉ ａ ｎ ｇ
［ ］ １ ～ ２
分离得到性状优良的丁酸梭菌， 并在体外研究了其 耐酸、 耐胆盐、 耐抗生素和拮抗致病菌特性， 为丁酸 梭菌的分离应用提供了一定依据。
１ 材料与方法
１ １ 实验材料 湖北省劲牌酒业有限公司刘仁八 １ １ １ 样品采集： 镇基酒基地酒窖底泥 猪大肠杆菌（ ） 和肠 １ １ ２ 菌种： Ｅ ｓ ｃ ｈ ｅ ｔ ｉ ｃ ｈ ｉ ａｃ ｏ ｌ ｉ Ｋ ８ ８ 炎沙门氏菌（ ） 由华中农业 Ｓ ａ ｌ ｍ ｏ ｎ ｅ ｌ ｌ ａＥ ｎ ｔ ｅ ｒ ｉ ｔ ｉ ｄ ｉ ｓ Ｏ ４ Ｈ ｉ 大学农业微生物国家重点实验室提供。 梭菌增殖培养基（ ： 酵 １ １ ３ 培养基： Ｒ Ｃ Ｍ 培养基） 母浸膏 ３ｇ 、 牛肉浸膏 １ 、 胰蛋白胨 １ 、 葡萄糖 ５ ０ｇ ０ｇ 、 可溶性淀粉 １ｇ 、 氯化钠 ５ｇ 、 三水合乙酸钠 ３ｇ 、 半 ｇ 胱氨酸盐酸盐 ０ 、 、 琼脂 １ ５ｇ ０ ５ ％美蓝 ０ ２ｍ Ｌ ５ｇ （ 固体培养基时用） 、 蒸馏水 １ ； 调节 ｐ ０ ０ ０ｍ Ｌ Ｈ７ １ ± ， 灭菌备用。 ０ １ １ １ ５℃， ２ ０ｍ ｉ ｎ
·２ · ０
微生物学通报
年３ （ ） ２ ０ ０ ７ ４ ６
梭菌选择性培养基（ ： 胰蛋白胨 １ Ｔ Ｓ Ｎ培养基） ５ 、 酵母浸粉 １ 、 亚硫酸钠 １ 、 枸橼酸铁 ０ 、 新生 ｇ ０ ｇ ｇ ５ ｇ 、 多粘菌素 ０ 、 琼脂 ０ （ 配固体培 霉素 ０ ０ ２ｇ ０ ５ｇ ５ｇ 养基时用） ， ， ， 灭菌备用。 ｐ Ｈ７ ２ １ × １ ０Ｐ ａ ２ ０ｍ ｉ ｎ 产酸指示培养基基、 明胶液化试验、 密二糖、 松 三糖、 淀粉水解试验和石蕊牛乳试验培养基参照《 伯
］ ７ ～ ９ 、 、 进行活菌计数， 计算存活率［ 。 １ ｈ ２ ｈ ３ ｈ
１ ２ 实验方法 分离培养方法： 本实验中， 运用 ８ １ ２ １ ２ ５ Ａ型厌氧 菌培养罐（ 沈阳市第五人民医院生产） 来进行厌氧菌 液体培养、 分离和稀释平板计数。丁酸梭菌的分离： ） 取酒窖窖泥样品 １ ， 加入到 ９ 置 １ ０ｇ ０ｍ Ｌ无菌水中， ， 杀死非芽孢菌， 转入梭菌增殖液 ８ ０℃水浴 １ ０ｍ ｉ ｎ 体培养基， 。２ ） 将上述培养液置 ３ ７℃厌氧培养 ４ ８ ｈ ， 转入梭菌选择性液体培养基， ８ ０℃水浴 １ ０ｍ ｉ ｎ ３ ７ 。３ ） 梯度稀释培养液， ℃厌氧选择性富集培养 ４ ８ ｈ 涂布梭菌选择性培养基平板， 置入厌氧培养罐， ３ ７ 。４ ） 影印好养和厌氧培养， 除去好氧和 ℃培养 ４ ８ ｈ 兼性厌氧菌， 得到严格厌氧菌。５ ） 选取培养特征、 菌 落形态和显微形态均符合丁酸梭菌培养特征的菌株
取０ 接种到 ９ 置３ １ｍ Ｌ ８ｍ ＬＲ Ｃ Ｍ液体培养基中， ７ 、 、 、 、 、 、 、 ｈ ４ ｈ ８ ｈ １ ２ ｈ １ ６ ｈ ２ ０ ｈ ２ ４ ｈ ℃静止培养。分别在 ０ 、 取样测活菌数和 ｐ 并与单独培养相比 ３ ６ ｈ ４ ８ ｈ Ｈ值，
］ １ ０ ～ １ １ 较［ 。
［ ］ ３ 杰细菌鉴定手册》ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ和《 常见细菌系统鉴定手册》 配 ］ ４ 制［ 。 ５
性试验， 参照 Ｇ Ｂ１ ５ １ ９ ３ ３ ２ ０ ０ ３最 大 耐 受 剂 量 法 进 行。取体重在 １ 的小鼠雌雄各 １ 只， 观察 ８ｇ ～ ２ ２ｇ ５ 后， 一日内分 ３次经口给予 ０ ３ ｄ ２ ５ｇ ? ｍ Ｌ菌液 ０ ４ （ 相当于 １ 体重） ， 连续 １ 观察小鼠是 ｍ Ｌ ５ ０ ０ ０ｍ ｇ ? ｋ ｇ ４ ｄ 否有中毒和死亡现象。 接种 １ １ ２ ６ 耐药性实验： ％菌液于常用浓度抗生 置３ ， 观察生长 素Ｒ Ｃ Ｍ培养基中， ７℃厌氧培养 ２ ４ ｈ 情况。 取０ １ ２ ７ 耐酸性实验： ２ｍ Ｌ离心洗涤菌悬液接 种于含有 ２ｍ 、 、 Ｌ无菌磷酸缓冲液的 ｐ Ｈ１ ０ ｐ Ｈ２ ０ 厌氧试管中， 置３ 分别于 ０ 、 ｐ Ｈ３ ０ ７℃培养箱中， ｈ
年３ （ ） ２ ０ ０ ７ ４ ６
微生物学通报
·１ · ９
酒窖底泥中丁酸梭菌的分离及其特性研究
谢树贵 戴 青 赵述淼 梁运祥
（ 农业微生物学国家重点实验室 华中农业大学生命科学技术学院 武汉 ） ４ ３ ０ ０ ７ ０
摘要： 通过厌氧培养法从酒窖底泥中分离得到 １ 个菌株， 生理生化实验和 １ 株丁酸梭 ４ ６ Ｓｒ Ｄ Ｎ Ａ序列分析鉴定出 ２ 菌。选取丁酸梭菌菌株 Ｂ 研究了其生长特性和安全性， 体外研究表明其具有较强的耐酸、 耐胆汁和耐抗生素能 １ 力， 并能显著抑制常见肠道致病菌的生长， 具有作为饲用微生态制剂应用的潜力。 关键词： 丁酸梭菌， 分离， 鉴定， 益生菌 中图分类号： Ｑ ９ ３ ９ １ 文献标识码： Ａ 文章编号： （ ） ０ ２ ５ ３ ２ ６ ５ ４ ２ ０ ０ ７ ０ ６ ０ ０ ０
（ ，Ｃ ， Ｓ ｔ ａ ｔ ｅ Ｋ ｅ ｙ Ｌ ａ ｂ ｏ ｒ ａ ｔ ｏ ｒ ｙ ｏ ｆ Ａ ｇ ｒ ｉ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｅ Ｍ ｉ ｃ ｒ ｏ ｂ ｉ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ｏ ｌ ｌ ｅ ｇ ｅ ｏ ｆ Ｌ ｉ ｆ ｅ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ＆Ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ） Ｈ ｕ ａ ｚ ｈ ｏ ｎ ｇＡ ｇ ｒ ｉ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ａ ｌ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ Ｗ ｕ ｈ ａ ｎ ４ ３ ０ ０ ７ ０ ： ，ｔ Ａ ｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ １ ４ｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｎ ｓ ｗ ｅ ｒ ｅ ｉ ｓ ｏ ｌ ａ ｔ ｅ ｄｆ ｒ ｏ ｍｐ ｉ ｔ ｓ ｓ ｌ ｕ ｄ ｇ ｅｂ ｙａ ｎ ａ ｅ ｒ ｏ ｂ ｉ ｃｃ ｕ ｌ ｔ ｉ ｖ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｗ ｏＣ ｌ ｏ ｓ ｔ ｒ ｉ ｄ ｉ ｕ ｍｂ ｕ ｔ ｙ ｒ ｉ ｃ ｕ ｍｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｎ ｓ ｗ ｅ ｒ ｅｉ ｄ ｅ ｎ ｔ ｉ ｆ ｉ ｅ ｄｂ ｙｐ ｈ ｙ ｓ ｉ ｏ ｌ ｏ ｇ ｉ ｃ ａ ｌ ａ ｎ ｄ ｂ ｉ ｏ ｃ ｈ ｅ ｍ ｉ ｃ ａ ｌ ｅ ｘ ｐ ｅ ｒ ｉ ｍ ｅ ｎ ｔ ｓ ａ ｎ ｄｔ ｈ ｅｓ ｅ ｑ ｕ ｅ ｎ ｃ ｅａ ｎ ａ ｌ ｙ ｓ ｉ ｓｏ ｆ １ ６ Ｓｒ Ｄ Ｎ Ａ ．Ｔ ｈ ｅｐ ｈ ｙ ｓ ｉ ｏ ｌ ｏ ｇ ｉ ｃ ａ ｌ ｃ ｈ ａ ｒ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｓ ｔ ｉ ｃ ｓａ ｎ ｄｓ ｅ ｃ ｕ ｒ ｉ ｔ ｙｏ ｆＣ ｌ ｏ ｓ ｔ ｒ ｉ ｄ ｉ ｕ ｍｂ ｕ ｔ ｙ ｒ ｉ ｃ ｕ ｍＢ １ｗ ａ ｓ ，ｉ ，ｂ ｓ ｔ ｕ ｄ ｉ ｅ ｄ ｎｖ ｉ ｔ ｒ ｏｒ ｅ ｓ ｅ ａ ｒ ｃ ｈｉ ｎ ｄ ｉ ｃ ａ ｔ ｅ ｄｉ ｔ ｗ ａ ｓ ｔ ｏ ｌ ｅ ｒ ａ ｎ ｔ ａ ｇ ａ ｉ ｎ ｓ ｔ ｌ ｏ ｗｐ Ｈ ｉ ｌ ｅ ｃ ｏ ｎ ｃ ｅ ｎ ｔ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｎａ ｎ ｄａ ｎ ｔ ｉ ｂ ｉ ｏ ｔ ｉ ｃ ｓ ａ ｎ ｄｈ ａ ｓ ａ ｎ ｔ ａ ｇ ｏ ｎ ｉ ｓ ｍｅ ｆ ｆ ｅ ｃ ｔ ｓ ａ ｇ ａ ｉ ｎ ｓ ｔ ｐ ａ ｔ ｈ ｏ ｇ ｅ ｎ ｓ ． ： ，Ｉ ，Ｉ ，Ｐ Ｋ ｅ ｙｗ ｏ ｒ ｄ ｓ Ｃ ｌ ｏ ｓ ｔ ｒ ｉ ｄ ｉ ｕ ｍｂ ｕ ｔ ｉ ｒ ｉ ｃ ｕ ｍ ｓ ｏ ｌ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｄ ｅ ｎ ｔ ｉ ｆ ｉ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｒ ｏ ｂ ｉ ｏ ｔ ｉ ｃ ｓ
丁酸梭菌， 即酪酸梭菌， 是１ ９ ３ ３年由日本千叶 医科大学宫入近治博士首先发现并报告的， 因此又 名宫入菌。日本最初将其用作整肠剂， 广泛用于肠 道菌群失调， 急慢性腹泻， 肠易激综合症， 抗生素相 关性肠炎等疾病的治疗； 现也将其用于畜禽饲料添 加剂替代抗生素， 发挥防病促长的作用。丁酸梭菌 形成内生芽孢， 具有耐高温、 耐酸、 耐胆盐、 耐部分抗 生素等特性，作为饲料添加剂和兽药， 与非芽孢类 活菌制剂相比， 具有更为广阔的应用前景
浙江省重大科技攻关项目（ 计划编号： ） ２ ０ ０ ４ Ｃ １ ２ ６ １ ０ 通讯作者
： ， ： Ｔ ｅ ｌ ０ ２ ７ ８ ７ ２ ８ １ ０ ４ ０ Ｅ ｍ ａ ｉ ｌ ｆ ａ ｌ ｙ ｘ ＠１ ６ ３ ｃ ｏ ｍ 收稿日期： ， 修回日期： ２ ０ ０ ７ ０ ２ １ ２ ２ ０ ０ ７ ０ ４ ２ ８
２ 结果
２ １ 丁酸梭菌的分离培养与鉴定 实验通过 ２ １ １ 酒窖底泥中丁酸梭菌的分离培养： 稀释涂平板法分离培养后共挑取 １ 株单菌落， 其培 ４ 养特征和显微形态见表 １ 。根据《 伯杰细菌鉴定手 册》 ， 丁酸梭菌为严格厌氧杆菌， 内生孢子卵圆， 偏心
］ ７ ～ ９ 行活菌计数， 计算存活率［ 。
致病菌的单独培 １ ２ ９ 肠道致病菌体外拮抗实验： 养： 将０ 活化好的致病菌菌悬液转接入 ９ １ｍ Ｌ ９ｍ Ｌ 置３ 分别在 ０ 、 、 Ｒ Ｃ Ｍ液体培养基， ７℃静止培养， ｈ ４ ｈ 、 、 、 、 、 、 ８ ｈ １ ２ ｈ １ ６ ｈ ２ ０ ｈ ２ ４ ｈ ３ ６ ｈ ４ ８ ｈ取 菌 液 测 活 菌 数 和 ｐ Ｈ值。 丁酸梭菌和致病菌混合培养： 活化好的丁酸梭
４ ５ 菌和致病菌菌液均稀释到 １ ， 各 ０ ｃ ｆ ｕ ? ｍ Ｌ ～ １ ０ ｃ ｆ ｕ ? ｍ Ｌ
明胶液化试 １ ２ ２ 分离菌株生理生化实验鉴定： 验、 密二糖、 松三糖、 淀粉水解试验和石蕊牛乳试验
［ ］ ３ 参照《 伯杰细菌鉴定手册》 和《 常见细菌系统鉴定 ［ ］ ４ 进行。 手册》
提取纯 １ ２ ３ 分离菌株 １ ６ Ｓｒ Ｄ Ｎ Ａ序列分析鉴定： ， 设计 Ｐ ： 化细 菌 总 Ｄ Ｎ Ａ Ｃ Ｒ 引 物 分 别 为： Ｐ ０ ５ ′ ， Ｇ Ａ Ｇ Ｔ Ｔ Ｔ Ｇ Ａ Ｔ Ｃ Ｍ Ｔ Ｇ Ｇ Ｃ Ｔ Ｃ Ａ Ｇ ３ ′ ： Ｐ Ｃ ３ ５ ′ 。Ｐ Ｃ Ｒ程序为： ９ ５℃ ５ Ｃ Ｔ Ａ Ｈ Ａ Ｇ Ｇ Ｇ Ｔ Ａ Ｔ Ｃ Ｔ Ａ Ａ Ｔ Ｃ Ｃ Ｔ ３ ′ ， ， ， ， 个循环 ９ ４℃ １ｍ ｉ ｎ ５ ０℃ １ｍ ｉ ｎ ７ ２℃ １ｍ ｉ ｎ ３ ０ ｍ ｉ ｎ 后７ 。Ｐ ２℃ 延 伸 １ ０ｍ ｉ ｎ Ｃ Ｒ产 物 的 回 收 纯 化 并 测
。
由于耐药性问题， 抗生素在饲料中应用受到严 格的限制， 动物微生态制剂被认为是取代抗生素最 具潜力的发展方向。丁酸梭菌产生内生芽孢， 在生 产加工和储藏过程中优势明显， 在饲料工业中的应
］ ２ 用前景非常诱人［ 。近年来国内对丁酸梭菌的研究
多集中在医学方面， 饲料方面的研究也逐渐升温， 菌 种多分离自人和动物肠道， 许多其它环境的潜在优 良菌株还有待发现。本研究中， 作者从酒窖底泥中
［ ］ 进行生理生化鉴定和 １ ６ Ｓｒ Ｄ Ｎ Ａ序列分析鉴定 ５～６ 。
耐胆汁实验： 取０ １ ２ ８ ２ｍ Ｌ离心洗涤菌悬液接种 于含 ０ １ ％、 ０ ３ ％、 ０ ５ ％猪胆盐的 ２ ｍ ＬＲ Ｃ Ｍ液体培 养基中。置 ３ 分别于 ０ 、 、 、 进 ７℃培养箱中， ｈ １ ｈ ２ ｈ ３ ｈ
Ｓ ｔ ｕ ｄ ｙｏ ｎＩ ｓ ｏ ｌ ａ ｔ ｉ ｏ ｎｏ ｆ Ｃ ｌ ｏ ｓ ｔ ｒ ｉ ｄ ｉ ｕ ｍＢ ｕ ｔ ｙ ｒ ｉ ｃ ｕ ｍｆ ｏ ｒ ｍＰ ｉ ｔ ｓ Ｓ ｌ ｕ ｄ ｇ ｅ ａ ｎ ｄｉ ｔ ｓ Ｃ ｈ ａ ｒ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｓ ｔ ｉ ｃ ｓ
Ｘ Ｉ ＥＳ ｈ ｕ Ｇ ｕ ｉＤ Ａ Ｉ Ｑ ｉ ｎ ｇ Ｚ Ｈ Ａ ＯＳ ｈ ｕ Ｍ ｉ ａ ｏ Ｌ Ｉ Ａ Ｎ ＧＹ ｕ ｎ Ｘ ｉ ａ ｎ ｇ
［ ］ １ ～ ２
分离得到性状优良的丁酸梭菌， 并在体外研究了其 耐酸、 耐胆盐、 耐抗生素和拮抗致病菌特性， 为丁酸 梭菌的分离应用提供了一定依据。
１ 材料与方法
１ １ 实验材料 湖北省劲牌酒业有限公司刘仁八 １ １ １ 样品采集： 镇基酒基地酒窖底泥 猪大肠杆菌（ ） 和肠 １ １ ２ 菌种： Ｅ ｓ ｃ ｈ ｅ ｔ ｉ ｃ ｈ ｉ ａｃ ｏ ｌ ｉ Ｋ ８ ８ 炎沙门氏菌（ ） 由华中农业 Ｓ ａ ｌ ｍ ｏ ｎ ｅ ｌ ｌ ａＥ ｎ ｔ ｅ ｒ ｉ ｔ ｉ ｄ ｉ ｓ Ｏ ４ Ｈ ｉ 大学农业微生物国家重点实验室提供。 梭菌增殖培养基（ ： 酵 １ １ ３ 培养基： Ｒ Ｃ Ｍ 培养基） 母浸膏 ３ｇ 、 牛肉浸膏 １ 、 胰蛋白胨 １ 、 葡萄糖 ５ ０ｇ ０ｇ 、 可溶性淀粉 １ｇ 、 氯化钠 ５ｇ 、 三水合乙酸钠 ３ｇ 、 半 ｇ 胱氨酸盐酸盐 ０ 、 、 琼脂 １ ５ｇ ０ ５ ％美蓝 ０ ２ｍ Ｌ ５ｇ （ 固体培养基时用） 、 蒸馏水 １ ； 调节 ｐ ０ ０ ０ｍ Ｌ Ｈ７ １ ± ， 灭菌备用。 ０ １ １ １ ５℃， ２ ０ｍ ｉ ｎ
·２ · ０
微生物学通报
年３ （ ） ２ ０ ０ ７ ４ ６
梭菌选择性培养基（ ： 胰蛋白胨 １ Ｔ Ｓ Ｎ培养基） ５ 、 酵母浸粉 １ 、 亚硫酸钠 １ 、 枸橼酸铁 ０ 、 新生 ｇ ０ ｇ ｇ ５ ｇ 、 多粘菌素 ０ 、 琼脂 ０ （ 配固体培 霉素 ０ ０ ２ｇ ０ ５ｇ ５ｇ 养基时用） ， ， ， 灭菌备用。 ｐ Ｈ７ ２ １ × １ ０Ｐ ａ ２ ０ｍ ｉ ｎ 产酸指示培养基基、 明胶液化试验、 密二糖、 松 三糖、 淀粉水解试验和石蕊牛乳试验培养基参照《 伯
］ ７ ～ ９ 、 、 进行活菌计数， 计算存活率［ 。 １ ｈ ２ ｈ ３ ｈ
１ ２ 实验方法 分离培养方法： 本实验中， 运用 ８ １ ２ １ ２ ５ Ａ型厌氧 菌培养罐（ 沈阳市第五人民医院生产） 来进行厌氧菌 液体培养、 分离和稀释平板计数。丁酸梭菌的分离： ） 取酒窖窖泥样品 １ ， 加入到 ９ 置 １ ０ｇ ０ｍ Ｌ无菌水中， ， 杀死非芽孢菌， 转入梭菌增殖液 ８ ０℃水浴 １ ０ｍ ｉ ｎ 体培养基， 。２ ） 将上述培养液置 ３ ７℃厌氧培养 ４ ８ ｈ ， 转入梭菌选择性液体培养基， ８ ０℃水浴 １ ０ｍ ｉ ｎ ３ ７ 。３ ） 梯度稀释培养液， ℃厌氧选择性富集培养 ４ ８ ｈ 涂布梭菌选择性培养基平板， 置入厌氧培养罐， ３ ７ 。４ ） 影印好养和厌氧培养， 除去好氧和 ℃培养 ４ ８ ｈ 兼性厌氧菌， 得到严格厌氧菌。５ ） 选取培养特征、 菌 落形态和显微形态均符合丁酸梭菌培养特征的菌株
取０ 接种到 ９ 置３ １ｍ Ｌ ８ｍ ＬＲ Ｃ Ｍ液体培养基中， ７ 、 、 、 、 、 、 、 ｈ ４ ｈ ８ ｈ １ ２ ｈ １ ６ ｈ ２ ０ ｈ ２ ４ ｈ ℃静止培养。分别在 ０ 、 取样测活菌数和 ｐ 并与单独培养相比 ３ ６ ｈ ４ ８ ｈ Ｈ值，
］ １ ０ ～ １ １ 较［ 。
［ ］ ３ 杰细菌鉴定手册》ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ和《 常见细菌系统鉴定手册》 配 ］ ４ 制［ 。 ５
性试验， 参照 Ｇ Ｂ１ ５ １ ９ ３ ３ ２ ０ ０ ３最 大 耐 受 剂 量 法 进 行。取体重在 １ 的小鼠雌雄各 １ 只， 观察 ８ｇ ～ ２ ２ｇ ５ 后， 一日内分 ３次经口给予 ０ ３ ｄ ２ ５ｇ ? ｍ Ｌ菌液 ０ ４ （ 相当于 １ 体重） ， 连续 １ 观察小鼠是 ｍ Ｌ ５ ０ ０ ０ｍ ｇ ? ｋ ｇ ４ ｄ 否有中毒和死亡现象。 接种 １ １ ２ ６ 耐药性实验： ％菌液于常用浓度抗生 置３ ， 观察生长 素Ｒ Ｃ Ｍ培养基中， ７℃厌氧培养 ２ ４ ｈ 情况。 取０ １ ２ ７ 耐酸性实验： ２ｍ Ｌ离心洗涤菌悬液接 种于含有 ２ｍ 、 、 Ｌ无菌磷酸缓冲液的 ｐ Ｈ１ ０ ｐ Ｈ２ ０ 厌氧试管中， 置３ 分别于 ０ 、 ｐ Ｈ３ ０ ７℃培养箱中， ｈ
年３ （ ） ２ ０ ０ ７ ４ ６
微生物学通报
·１ · ９
酒窖底泥中丁酸梭菌的分离及其特性研究
谢树贵 戴 青 赵述淼 梁运祥
（ 农业微生物学国家重点实验室 华中农业大学生命科学技术学院 武汉 ） ４ ３ ０ ０ ７ ０
摘要： 通过厌氧培养法从酒窖底泥中分离得到 １ 个菌株， 生理生化实验和 １ 株丁酸梭 ４ ６ Ｓｒ Ｄ Ｎ Ａ序列分析鉴定出 ２ 菌。选取丁酸梭菌菌株 Ｂ 研究了其生长特性和安全性， 体外研究表明其具有较强的耐酸、 耐胆汁和耐抗生素能 １ 力， 并能显著抑制常见肠道致病菌的生长， 具有作为饲用微生态制剂应用的潜力。 关键词： 丁酸梭菌， 分离， 鉴定， 益生菌 中图分类号： Ｑ ９ ３ ９ １ 文献标识码： Ａ 文章编号： （ ） ０ ２ ５ ３ ２ ６ ５ ４ ２ ０ ０ ７ ０ ６ ０ ０ ０
（ ，Ｃ ， Ｓ ｔ ａ ｔ ｅ Ｋ ｅ ｙ Ｌ ａ ｂ ｏ ｒ ａ ｔ ｏ ｒ ｙ ｏ ｆ Ａ ｇ ｒ ｉ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｅ Ｍ ｉ ｃ ｒ ｏ ｂ ｉ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ｏ ｌ ｌ ｅ ｇ ｅ ｏ ｆ Ｌ ｉ ｆ ｅ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ＆Ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ） Ｈ ｕ ａ ｚ ｈ ｏ ｎ ｇＡ ｇ ｒ ｉ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ａ ｌ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ Ｗ ｕ ｈ ａ ｎ ４ ３ ０ ０ ７ ０ ： ，ｔ Ａ ｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ １ ４ｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｎ ｓ ｗ ｅ ｒ ｅ ｉ ｓ ｏ ｌ ａ ｔ ｅ ｄｆ ｒ ｏ ｍｐ ｉ ｔ ｓ ｓ ｌ ｕ ｄ ｇ ｅｂ ｙａ ｎ ａ ｅ ｒ ｏ ｂ ｉ ｃｃ ｕ ｌ ｔ ｉ ｖ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｗ ｏＣ ｌ ｏ ｓ ｔ ｒ ｉ ｄ ｉ ｕ ｍｂ ｕ ｔ ｙ ｒ ｉ ｃ ｕ ｍｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｎ ｓ ｗ ｅ ｒ ｅｉ ｄ ｅ ｎ ｔ ｉ ｆ ｉ ｅ ｄｂ ｙｐ ｈ ｙ ｓ ｉ ｏ ｌ ｏ ｇ ｉ ｃ ａ ｌ ａ ｎ ｄ ｂ ｉ ｏ ｃ ｈ ｅ ｍ ｉ ｃ ａ ｌ ｅ ｘ ｐ ｅ ｒ ｉ ｍ ｅ ｎ ｔ ｓ ａ ｎ ｄｔ ｈ ｅｓ ｅ ｑ ｕ ｅ ｎ ｃ ｅａ ｎ ａ ｌ ｙ ｓ ｉ ｓｏ ｆ １ ６ Ｓｒ Ｄ Ｎ Ａ ．Ｔ ｈ ｅｐ ｈ ｙ ｓ ｉ ｏ ｌ ｏ ｇ ｉ ｃ ａ ｌ ｃ ｈ ａ ｒ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｓ ｔ ｉ ｃ ｓａ ｎ ｄｓ ｅ ｃ ｕ ｒ ｉ ｔ ｙｏ ｆＣ ｌ ｏ ｓ ｔ ｒ ｉ ｄ ｉ ｕ ｍｂ ｕ ｔ ｙ ｒ ｉ ｃ ｕ ｍＢ １ｗ ａ ｓ ，ｉ ，ｂ ｓ ｔ ｕ ｄ ｉ ｅ ｄ ｎｖ ｉ ｔ ｒ ｏｒ ｅ ｓ ｅ ａ ｒ ｃ ｈｉ ｎ ｄ ｉ ｃ ａ ｔ ｅ ｄｉ ｔ ｗ ａ ｓ ｔ ｏ ｌ ｅ ｒ ａ ｎ ｔ ａ ｇ ａ ｉ ｎ ｓ ｔ ｌ ｏ ｗｐ Ｈ ｉ ｌ ｅ ｃ ｏ ｎ ｃ ｅ ｎ ｔ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｎａ ｎ ｄａ ｎ ｔ ｉ ｂ ｉ ｏ ｔ ｉ ｃ ｓ ａ ｎ ｄｈ ａ ｓ ａ ｎ ｔ ａ ｇ ｏ ｎ ｉ ｓ ｍｅ ｆ ｆ ｅ ｃ ｔ ｓ ａ ｇ ａ ｉ ｎ ｓ ｔ ｐ ａ ｔ ｈ ｏ ｇ ｅ ｎ ｓ ． ： ，Ｉ ，Ｉ ，Ｐ Ｋ ｅ ｙｗ ｏ ｒ ｄ ｓ Ｃ ｌ ｏ ｓ ｔ ｒ ｉ ｄ ｉ ｕ ｍｂ ｕ ｔ ｉ ｒ ｉ ｃ ｕ ｍ ｓ ｏ ｌ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｄ ｅ ｎ ｔ ｉ ｆ ｉ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｒ ｏ ｂ ｉ ｏ ｔ ｉ ｃ ｓ
丁酸梭菌， 即酪酸梭菌， 是１ ９ ３ ３年由日本千叶 医科大学宫入近治博士首先发现并报告的， 因此又 名宫入菌。日本最初将其用作整肠剂， 广泛用于肠 道菌群失调， 急慢性腹泻， 肠易激综合症， 抗生素相 关性肠炎等疾病的治疗； 现也将其用于畜禽饲料添 加剂替代抗生素， 发挥防病促长的作用。丁酸梭菌 形成内生芽孢， 具有耐高温、 耐酸、 耐胆盐、 耐部分抗 生素等特性，作为饲料添加剂和兽药， 与非芽孢类 活菌制剂相比， 具有更为广阔的应用前景
浙江省重大科技攻关项目（ 计划编号： ） ２ ０ ０ ４ Ｃ １ ２ ６ １ ０ 通讯作者
： ， ： Ｔ ｅ ｌ ０ ２ ７ ８ ７ ２ ８ １ ０ ４ ０ Ｅ ｍ ａ ｉ ｌ ｆ ａ ｌ ｙ ｘ ＠１ ６ ３ ｃ ｏ ｍ 收稿日期： ， 修回日期： ２ ０ ０ ７ ０ ２ １ ２ ２ ０ ０ ７ ０ ４ ２ ８