实验六 大肠杆菌营养缺陷型的筛选

实验六大肠杆菌营养缺陷型的筛选

一、实验目的

•1、学习掌握培养基的配制方法

•2、学习掌握消毒灭菌的原理与方法

•3、学习掌握紫外线诱变育种的方法

•4、学习掌握营养缺陷型的筛选方法

•5、学习掌握微生物接种及划线分离等基本技术，巩固加强无菌操作技术.

二、实验原理

•（一）培养基

•培养基（culture medium）：人工配制的供微生物生长或产生代谢产物的营养基质。

1、制备培养基的原则

•目的明确、营养协调、理化适宜、经济节约

•1 ）根据营养类型设计培养基

•2 ）注意培养基中各种营养物质的浓度及比例

•3 ）适宜PH、氧化还原电位、水的活化度

•4 ）营养物质廉价易得

•5 ）灭菌：高温灭菌对营养物质的破坏及pH变化

2、培养基类型

•1）物理状态：固体、液体、半固体

•2 ）、化学组份：天然或合成培养基

•3 ）、根据用途：

•A、加富培养基（enrichment medium）

•B、选择培养基（selective medium）

•C、鉴别培养基（differential medium）

（二）消毒与灭菌

•1、消毒、灭菌的概念

•2、灭菌的方法

(1)高温灭菌

火焰灼烧法：

干热灭菌

高烘箱热空气法：150—170℃，2h;

温

灭

菌巴氏消毒法：60—85 ℃，20min.

煮沸消毒法：100℃

湿热灭菌间歇灭菌法(丁达尔灭菌法)：

高压蒸汽灭菌：＞110℃

超高温瞬间灭菌135-150 ℃ 2-6S

高压蒸汽灭菌

相同温度下，湿热比干热灭菌效果好

•蒸汽存在潜热；

•蛋白质更易变性；

•湿热蒸汽穿透力比干热空气强；

微生物耐热性能

细菌内生孢子＞真菌孢子＞营养体

影响灭菌的因素

温度微生物种类；微生物的数量；培养基的体积；培养基的性质:浓度、PH

（2）辐射灭菌(radiation sterilization) 利用电磁辐射产生的电磁波进行灭菌的方法

紫外线：260nm效果最好；

电离辐射：X射线，γ射线；

可见光长时照射

（3）过滤除菌

（4）高渗作用

（5）干燥

（6）超声波

（三）诱变育种

•1、基因突变的概念

•2、自发突变与诱发突变

•3、常用诱变剂

（四）营养缺陷型

•营养缺陷型是由基因突变而丧失合成某种其生长所必需的营养物质的能力，必须在培养基中添加相应的营养成分才能正常生长的突变型。它的基因型表示方法为：his C－his C＋，表型的表示方法为：HisC •营养缺陷型是一种负选择性标记（在选择培养基中不能生长），常用影印平板法进行分离

三、实验材料

• E.coli斜面菌种6支

•LB固体平板100个、基本培养基平板40个

•装有13.5ml PB的大试管3支、装有9ml PB的大试管3支

•装有50ml LB的250 ml三角瓶3支

•装有50ml 含有氨苄青霉素基本培养基的250 ml三角瓶1支

•装有4ml LB液体培养基的试管2支

•1ml移液管1支、10ml移液管6支、5ml移液管7支

•50ml离心管3支、15ml离心管2支

•培养皿2套、镊子2把、滴管2支、枪头60个、涂布器10支、牙签若干

•计数板、计数器、移液枪

四、实验内容及操作步骤

•（一）培养基的配制及材料灭菌

•LB培养基

•细菌基本培养基

•PB缓冲液

•氨基酸溶液（滤纸片）

•双蒸馏水950ml，胰蛋白胨10g，NaCL10g，酵母提取物5g，用1mol/LNaOH调节pH至7.0，加双蒸馏水至总体积

1000ml，121℃高压蒸汽灭菌30min

基本培养基

•NH4H2PO4 1g，MgSO4 ·7H2O 0.2g，葡萄糖5g，NaCL 5g，

K2HPO4 1g，水1000ml，pH7.0, 115 ℃灭菌20min

•含青霉素基本培养基：待LB培养基灭菌后冷却至50 ℃左右加入抗生素，至终浓度2000单位/ml

PB 缓冲液

•0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）：秤取Na2HPO4·12H2O 35.82g，溶于1000ml蒸馏水中，为A液；秤取NaH2PO4·2H2O 15.605g，溶于1000ml蒸馏水中，为B液。取A液61ml，B 液39ml，可得100ml0.1 mol/L pH7.0的磷酸缓冲液

（二）营养缺陷型的筛选