实验六 大肠杆菌营养缺陷型的筛选
细菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选
微生物学实验报告大肠杆菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选山东大学生命科学学院2010.6.10大肠杆菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选摘要：营养缺陷型菌株或称异养型（auxotroph）菌株是许多微生物生理生化以及遗传研究的重要菌株材料。
此类菌株不仅在生物研究方面有着很重要的作用，而且在生物工程和生物技术上都有很重要的作用。
营养缺陷型菌株的筛选也成为了微生物科学工作者必备的基本实验技能之一。
本实验以大肠杆菌原养型菌株为材料，实验了营养缺陷型的诱变获得及筛选，从而了解细菌营养缺陷性的获得步骤，掌握氨基酸营养缺陷型的筛选方法和鉴别过程。
关键词：营养缺陷紫外诱变筛选生长谱测定大肠杆菌（E.coli）一、背景与原理营养缺陷型菌株指的是因自发突变或诱变丧失合成某些生活必需物质的能力的菌株。
营养缺陷型菌株不能在基本培养基上生长（增殖），必须补充一种或一种以上的营养物质才能生长。
此类突变体在理论研究和生产实践中都有重要意义，是作为研究代谢途径和遗传规律不可少的标记菌种，亦可直接用于生产氨基酸、核苷酸等代谢产物。
例如，顺反子概念的提出、基因工程转化结果的鉴定等，都是利用了营养缺陷型菌株。
.菌株自发突变为营养缺陷型的概率是很低的。
因此现代微生物遗传学实验中，为了有目的的获得营养缺陷型菌株，实验人员往往以人工诱变的方法来获得营养缺陷型。
实验中，以各种致突变因子（物理、化学等）处理待突变细胞，然后进行筛选和鉴定，获得营养缺陷型菌株。
能够用来进行诱变的物质很多，例如各种射线、紫外线、DNA染色剂、碱基类似物、强氧化剂等，但是一般实验室中最常见也最有效地史紫外线诱变法。
在紫外线照射下，DNA发生不同程度的损伤，而且会形成大量的嘧啶二聚体。
处理完细胞后，在防止光复活的前提下，细胞中DNA的损伤得不到有效修复或者只能得到SOS 修复，会形成大量的基因突变，在细胞总量较大的前提下，就有机会获得一定得目的菌株。
用于诱变处理的微生物一般处于对数生长期，那时的细菌对诱变剂的反应最灵敏。
大肠杆菌营养缺陷型
大肠杆菌营养缺陷型菌株的筛选陈瑞州201110424108一.实验原理以微生物为材料的遗传学研究中，用某些物理因素或化学因素处理细菌，使基因发生突变，丧失合成某一物质（如维生素）的能力，因而它们不能在基本培养基上生长，必须补充某些物质才能生长。
这样从野生型经诱变筛选得到的菌株称为营养缺陷型。
常用的诱变法是紫外线照射诱变法。
但是，经处理后的细菌，缺陷型还是相当少的，必须设法淘汰野生型细菌。
因为抗生素能杀死生长的细菌而对不生长的细菌没影响，而缺陷型菌株在基本培养基中不能生长，由此通过含有抗生素的基本培养基即可淘汰野生型细菌，保留缺陷型细菌。
把经过浓缩的缺陷型菌液接种在完全培养基上，待长出菌落后，将每一菌落分别接种在基本培养基和完全培养基上，凡是在基本培养基上不长，而在完全培养基上生长的菌落就是营养缺陷型。
二.实验材料大肠杆菌K12的野生型菌株大肠杆菌三.实验器具和药品1.用具：灭菌培养皿（9cm），灭菌三角瓶（150ml），灭菌离心管。
2.培养基1)肉汤液体培养基：牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，NaCl0.5g，蒸馏水100ml，Ph7.2，高压灭菌15磅/英寸2 15分钟。
2)肉汤液体培养基（2E）：牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，NaCl0.5g，蒸馏水50ml，Ph7.2，高压灭菌锅15磅/英寸215分钟。
3)基本液体培养基：葡萄糖2g，蒸馏水98ml，pH7.0，高压灭菌8磅/英寸2 30分钟4)基本固体培养基：琼脂2g，基本液体培养基100ml，pH7.0，高压灭菌8磅/英寸2 30分钟。
5)无N基本液体培养基：K2HPO40.7g，KH2PO40.3g，柠檬酸钠·3H2O 0.5g，MgSO4·7H2O 0.01g，葡萄糖2g，蒸馏水100ml，Ph7.0，高压灭菌8磅/英寸230分钟。
6)2N基本液体培养基：K2HPO40.7g，KH2PO40.3g，柠檬酸钠·3H2O 0.5g，MgSO4·7H2O0.01g，(NH4)2SO4 0.2g，葡萄糖2g，蒸馏水100ml，Ph7.0，高压灭菌8磅/英寸2 30分钟。
大肠杆菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选鉴定
大肠杆菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选鉴定关于菌株的几个概念：野生型菌株：从自然界分离到的微生物在其发生突变前的原始状态。
营养缺陷型：野生型菌株经过人工诱变或自然突变失去合成某种营养的能力，只有在基本培养基中补充所缺乏的营养因子才能生长。
原养型：营养缺陷型菌株经回复突变或重组后产生的菌株，其营养要求在表型上和野生型相同关于培养基：基本培养基（minimal medium，MM）：仅能满足微生物野生型菌株生长需要的培养基，用[－]来表示。
完全培养基（complete medium，CM）：凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半组合培养基。
用[＋]来表示。
补充培养基（supplemental medium，SM）：凡只能满足相应的营养缺陷型生长需要的组全培养基，它是在基本培养基中加入该菌株不能合成的营养因子而组成。
摘要：本实验选用紫外线为诱变剂，来诱发大肠杆菌突变，并用青霉素法淘汰野生型，逐个测定法检出缺陷型，获得100#大肠杆菌菌株，最后经生长谱法鉴定出该菌株为xxx缺陷型。
关键词：大肠杆菌紫外线营养缺陷型青霉素逐个测定法生长谱法一、目的1、了解营养缺陷型突变株选育的原理。
2、学习并掌握细菌氨基酸营养缺陷型的诱变、筛选与鉴定方法。
二、原理筛选营养缺陷型菌株一般具有四个环节：诱变处理、营养缺陷性的浓缩、检出、鉴定缺陷型。
本实验选用紫外线为诱变剂，来诱发突变，并用青霉素法淘汰野生型，逐个测定法检出缺陷型，最后经生长谱法鉴定细菌的营养缺陷型。
三、器材离心机，紫外线照射箱，冰箱，恒温箱，高压灭菌锅；三角烧瓶，试管，离心管，移液管，培养皿，接种针四、材料(一)菌种E.coli(二)培养基、1LB培养液(Luria-Bertani 培养基,这个名字来源于英语的lysogeny broth，即溶菌肉汤。
是微生物学实验中最常用的培养基，用于培养大肠杆菌等细菌，分为液态培养基和加入琼脂制成的固态培养基。
加入抗生素的LB 培养基可用于筛选以大肠杆菌为宿主的克隆。
紫外诱变选育大肠杆菌营养缺陷型菌株的研究
物技术、微生物代谢等领域的研究中均具有重要作用，另外它还是研究基因的结构与功能的常用材料。该研
究以大肠杆菌（Escherichia coli）菌株 DH5α为实验材料，利用紫外线（UV）对其进行诱变，并且采用青霉素法浓
缩营养缺陷型细菌，采用逐个测定法检出营养缺陷型，利用生长谱法对缺陷型菌株进行鉴定、分析，得到了 4
株稳定的营养缺陷型突变株，分别为赖氨酸、组氨酸、精氨酸和嘧啶营养缺陷型菌株。
关键词：大肠杆菌；营养缺陷型；紫外诱变
中图分类号 Q311
文献标识码 A
文章编号 1007-7731（2016）15-0033-03
Study on Selection of Auxotrophic Strain of Escherichia coli by UV Mutation
安徽农学通报，Anhui Agri.Sci.Bull.2016，22（15）
33
紫外诱变选育大肠杆菌营养缺陷型菌株的研究
宁 祎 李基丽 道吉吉 王春台 刘新琼*
（中南民族大学生命科学学院，湖北武汉 430074）
摘 要：营养缺陷型是一种生化突变株，它的出现是由基因突变引起的。营养缺陷型菌株在遗传学、食品生
Ning Yi et al. （College of Life Science，South-central University For Nationalities，Wuhan 430074，China） Abstract：The auxotrophic strain，which is caused by the gene mutation，is a kind of mutant strain of biochemistry. It plays an mportant role in the study of genetics，food biotechnology，microbial metabolism，and so on，besides， the auxotrophic strain has been always used to study the structure and function of genes. The steps of screening are inducing mutation，after culturing，eliminating the wild types，detecting the deficit types and identifying the deficit types.The ultraviole（t UV）was used to mutate the strain of Escherichia coli—DH5α，and then by the use of penicil⁃ lin method，the auxotrophic bacteria were concentrated and tested respectively to find out the auxotroph.Finally，the auxotrophies were identified and analyzed by growth chart of nutritional need，and four auxotrophic strains were suc⁃ cessfully obtained. Key words：Escherichia coli；Auxotrophy；UV-induced mutation
细菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选
细菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选摘要[目的]通过诱变处理，获得并筛选细菌营养缺陷型菌株。
[方法]以大肠杆菌E.coli K12SF+为实验菌株，通过紫外线诱发突变，并用青霉素法淘汰野生型菌株，经过缺陷型菌株的检出、划线复证、生长谱鉴定，最终确定得到菌株的营养缺陷型类型。
[结果]经过诱变处理后，检出了营养缺陷型，经过划线复证发现该菌株并非营养缺陷型；用其他组复证后的营养缺陷型菌株进行生长谱法鉴定，显示没有菌落形成，即没有预期的营养缺陷型菌株出现。
关键词诱变；紫外线；营养缺陷型；生长谱法鉴定；筛选前言随着微生物遗传学及其在生产实践中的不断发展，迫切的需要建立更多的新菌种为科学研究和生产所用。
其中获得微生物菌种的突变菌株就是获得新菌种的一种方法。
通过一定措施，诱发菌种发生突变，改变菌种的性能并选育，得到具有新性能的菌种。
在诱变剂选择时，首先应从诱变剂的普遍性出发，然后再考虑由于不同的生物的DNA碱基排列、GC的含量、细胞生理特性等，对诱变剂表现敏感强弱的差别。
一定剂量的紫外线照射，可以导致细胞发生突变，而且紫外线的安全性较高，易于操作，方便使用。
本实验采用紫外线诱发突变，紫外诱变机理如下：DNA和RNA的嘌呤和嘧啶吸收紫外光后，DNA分子形成嘧啶二聚体，即两个相邻的嘧啶共价连接，二聚体出现会减弱双键间氢键的作用，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而有可能引起突变或死亡。
另外二聚体的形成，会妨碍双链的解开，因而影响DNA的复制和转录。
总之紫外辐射可以引起碱基转换、颠换、移码突变或缺失，即是所谓的诱变。
在使用紫外诱变时，应注意防止光复活，紫外线照射结束后，要用黑布包裹暗箱培养。
此外，使用任何诱变剂均需考虑其剂量问题。
在计算某一诱变剂对微生物作用的最适剂量时，必须考虑到一切诱变剂都有杀菌和诱变的双重效应。
当杀菌率不高时，诱变率常随剂量的提高而提高，剂量提高到一定的浓度后，诱变率反而下降了。
如果以产量性状为标准，则诱变率的高低还有两种情况：一是产量提高的诱变率，称为正向突变；一是产量降低的诱变率，称为负向突变。
营养缺陷型突变体的筛选及其应用
营养缺陷型菌株的筛选过程
• 营养缺陷型菌株的筛选一般要经过诱变、淘汰野 生型菌株、检出缺陷型和确定生长谱四个环节。
• １诱变剂处理
• 诱变剂处理时与其它诱变处理基本相同。在诱变 处理后的存活个体中，营养缺陷型的比例一般很 低，通常只有百分之几至千分之几，采用抗菌素 法或菌丝过滤法，可以淘汰为数众多的野生型菌 株，从而达到浓缩营养缺陷型的目的。
3营养缺陷型的检出方法夹层培养法夹层培养法限量补充培养法限量补充培养法影印接种法影印接种法逐个检出法逐个检出法1影印法影印法是将诱变处理后的细胞涂布在完全培养基表面上经培养后长出菌落然后用一小块直径比平皿稍小的圆柱形木块复盖于灭过菌的丝绒布上作为接种工具将长出菌落的平皿倒转过来在丝绒上轻轻按一下转接到另一基本培养基平板上经培养后比较这两个平皿长出的菌落
• 具体方法：影印法、点种法、夹层法 、 限量补充培养法 • 夹层培养法 • 限量补充培养法 • 影印接种法 • 逐个检出法
１）影印法
• 影印法是将诱变处理后的细胞涂布在完全 培养基表面上，经培养后长出菌落，然后 用一小块直径比平皿稍小的圆柱形木块复 盖于灭过菌的丝绒布上作为接种工具，将 长出菌落的平皿倒转过来，在丝绒上轻轻 按一下，转接到另一基本培养基平板上， 经培养后，比较这两个平皿长出的菌落。 如果发现前一平扳上某一部位长有菌落， 而在后一培养基上的相应部位却没有，就 说明这是一个营养缺陷型菌落。
２）夹层培养法
• 夹层培养法是先在培养皿上倒一层基本培 养基，冷凝后加上一层含菌液的基本培养 基，凝固后再浇上一薄层的基本培养基。 经培养后，在皿底对首先出现的菌落做标 记，然后再倒上一薄层完全培养基(或补充 培养基)，再培养，这时再出现的新菌落， 多数即为营养缺陷型。此法缺点是，结果 有时不明确，而且将缺陷型菌落从夹层中 挑出并不很容易。
实验5-营养缺陷型菌株筛选及鉴定
实验五、营养缺陷型菌株筛选及鉴定1、实验名称营养缺陷型菌株筛选及鉴定2、实验操作人3、实验过程简述3.1 营养缺陷型菌株诱变3.1.1培养基的配制配置两种类型的培养基，营养丰富培养基（YPD）和基本培养基（SC），其中营养丰富的培养基在诱变的过程中用来培养菌株，在基本培养基中选择性的加入氨基酸来进行筛选，分别标记为：SC5 (SC+His+Trp+Leu+Lys+Ura)；SC5-Lys (SC+His+Trp+Leu+Ura) SC5-Leu (SC+His+Trp+Lys+Ura)；SC5-Trp (SC+His+Leu+Lys+Ura)；SC5-His (SC+Trp+Leu+Lys+Ura)；SC5-Ura(SC+His+Trp+Leu+Lys)。
3.1.2稀释涂布在超净台，取0.1 ml菌悬液转接到0.9 ml无菌水中，混匀后，取0.1 ml 稀释液转接到0. 9 ml无菌水中，混匀后，继续进行10倍的梯度稀释，稀释到10-6；取0.1 ml稀释度分别为10-4、10-5、10-6的菌悬液，加入到YPD固体平板上，用涂布棒涂布均匀，每个稀释度涂5块平板；3.1.3紫外诱变每个稀释度各取一块平板，培养皿底部标记好组号-稀释度-紫外处理时间，将平板适当垫高，防止诱变不充分，用紫外照射分别诱变处理0、30、45、60、120秒，黑布包好，置于30℃培养箱培养48h；记录各平板上的菌落数，计算不同处理的细胞致死率。
致死率（%）=1-（特定时间点平板上菌落数X稀释倍数）/（0时平板上菌落数X 稀释倍数）X100%3.2 营养缺陷型菌株初筛3.2.1选取单菌落小组内部四人分别标号为A/B/C/D（本人标号为A）,本次实验选用了两种敏感性不同的菌株，选取两种菌株内生长较好的平板，每个平板每人取3个单菌落（每人2菌×3个单菌落），用记号笔圈出标记为A1/A2/…A6防止重复挑取；取1.5ml离心管装入1ml无菌水，用接种环从YPD平板上挑取单菌落，转接到无菌水中，摇匀，室温静置2h；3.2.2点板在准备好的YPD、SC培养基平板底部做标记（培养基名称-组号）,将小组成员点菌位置画好格子；分别取一接种环菌悬液对应点于SC和YPD培养基平板上（每人1行，做好标记）；将培养皿倒置于30℃培养箱中，培养48h，注意无论涂板、还是点板，一定等菌液被培养基吸收后，再挪动或倒置；记录各单菌落在不同培养基上生长情况（生长记“+”，不生长记“-”），并拍照；根据生长情况，判断本实验各菌株是否为营养缺陷型菌株。
大肠杆菌营养缺陷型菌株的筛选
大肠杆菌营养缺陷型菌株的筛选一、实验原理在以微生物为材料的遗传学研究中，用某些物理因素或化学因素处理细菌，使基因发生突变，丧失合成某一物质(如氨基酸、维生素、核苷酸等)的能力，因而它们不能在基本培养基上生长，必须补充某些物质才能生长。
这样从野生型经诱变筛选得到的菌株，称为营养缺陷型。
筛选营养缺陷型菌株必须经过以下几个步骤:诱变处理、淘汰野生型、检出缺陷型、鉴定缺陷型。
由于本实验是以大肠杆菌为材料，所以根据细菌的特性分别说明筛选的步骤。
诱变剂的作用主要是提高突变频率，它分为物理和化学的二类。
物理诱变剂常用的有X射线、紫外线、快中子、γ射线等诱变处理首先是选择诱变剂，微生物诱变中最常用的物理诱变剂是紫外线。
诱变剂所处理的微生物，一般要求呈单核的单细胞或单孢子的悬浮液，分布均匀，这样可以避免出现不纯的菌落。
用于诱变处理的微生物一般处于对数生长期，那时的细菌对诱变剂的反应最灵敏。
2诱变处理必须选择合适的剂量，剂量的表示有二种，绝对剂量和相对剂量。
绝对剂量的单位以尔格/cm表示，一般用相对剂量。
相对剂量与三个因素有关，这三个因素是:诱变源和处理微生物的距离，诱变源(紫外灯)的功率，以及处理的时间。
前二个因素是固定的，所以通过处理时间控制诱变剂量。
各种微生物的处理最适剂量是不同的，须经预备实验确定。
经处理以后的细菌，缺陷型还是相当少的，必须设法淘汰野生型细胞，提高营养缺陷型细胞所占比例，以达到浓缩缺陷型的目的。
细菌中常用的浓缩法是青霉素法。
青霉素是杀菌剂，它只杀死生长的细胞，对不生长的细胞没有致死作用。
所以在含有青霉素的基本培养基中野生型能长而被杀死，缺陷型不能长被保存得以浓缩。
检出缺陷型的方法有逐个测定法、夹层培养法、限量补给法、影印培养法。
这里主要以逐个测定法为例进行说明。
把经过浓缩的缺陷型菌液接种在完全培养基上，待长出菌落后将每一菌落分别接种在基本培养基和完全培养基上。
凡是在基本培养基上不能生长而在完全培养基上能长的菌落就是营养缺陷型。
营养缺陷型菌株的筛选步骤和方法
营养缺陷型菌株的筛选步骤和方法
嘿，你知道营养缺陷型菌株是啥不？这玩意儿在科研和生产中可有着大用处呢！那怎么筛选营养缺陷型菌株呢？首先，咱得有个出发菌株，就像要找宝藏得先有个起点一样。
然后通过诱变处理，这就好比给菌株来个大变身，让它可能产生新的特性。
接着进行淘汰野生型，把那些不需要的家伙踢出去。
再进行检出缺陷型，这就像在一堆沙子里找金子，得仔细着呢！注意啊，整个过程中可不能马虎，每一步都得精准操作。
要是弄错了，那可就白忙活啦！
说到安全性，只要操作规范，那基本没啥问题。
稳定性嘛，筛选出来的菌株如果保存得当，那还是挺稳定的。
就像你把宝贝放在一个安全的地方，它就不会轻易丢啦！
那营养缺陷型菌株有啥应用场景呢？在生物制药、食品工业等领域都能大显身手。
它的优势可不少呢！比如可以用来研究代谢途径，就像侦探破案一样，通过它能找到生命的奥秘。
还可以作为遗传标记，帮助我们更好地了解生物的遗传特性。
举个实际案例吧！有个实验室在研究某种抗生素的生产，通过筛选营养缺陷型菌株，大大提高了抗生素的产量。
哇塞，这效果简直太棒了！
所以啊，营养缺陷型菌株的筛选真的很重要。
咱可得好好利用这个强大的工具，为科研和生产做出更大的贡献。
营养缺陷型的筛选方法
营养缺陷型的筛选方法咱今儿就来说说营养缺陷型的筛选方法。
你想想啊，这就好比在一个大果园里找那些特别的果子。
首先呢，咱得知道啥是营养缺陷型。
简单说，就是有些微生物啊，它们在生长过程中缺少了某种关键的营养物质，就没办法好好长啦。
那怎么找到它们呢？这就有几种办法咯。
有一种叫逐个检出法。
就好像你在一堆苹果里，一个一个地去检查，看哪个苹果有个小斑点或者长得不太一样。
咱对微生物也这样，一个一个地去试，看哪个在缺少特定营养的时候长不起来，那它可能就是咱要找的营养缺陷型啦。
还有一种类比起来就像撒大网捕鱼的方法，叫夹层培养法。
把不同的微生物放在两层培养基中间，上面那层可能缺某种营养，下面那层是全的。
然后呢，就看哪些微生物只能在下面那层长，长不到上面那层去，嘿，那这些很可能就是营养缺陷型呀！咱再说说限量补充培养法，这就好比给一群孩子分糖果，有的给多了，有的给少了，然后看谁表现不一样。
通过控制营养物质的量，来观察微生物的反应，从而找出那些特殊的家伙。
你说这是不是挺有意思的？就这么几种方法，就能把那些隐藏在微生物大军里的营养缺陷型给揪出来啦！想象一下，如果没有这些方法，咱怎么能知道哪些微生物需要特别照顾呢？而且啊，这些筛选方法可重要了呢！就像你找宝藏一样，得有合适的工具和方法才能找到那些宝贝呀。
在微生物研究里，这些营养缺陷型可有着大用处呢。
它们能帮助我们更好地了解微生物的特性和需求，为进一步的研究和应用打下基础。
你说，要是没有这些巧妙的筛选方法，我们对微生物的世界该有多迷茫啊！所以说啊，这些方法可真是我们探索微生物世界的得力助手呢！它们就像一把钥匙，能打开微生物世界里那些神秘的大门，让我们看到更多奇妙的景象。
所以呀，可别小瞧了这些筛选方法哦，它们真的超级厉害的！。
营养缺陷型菌株筛选
营养缺陷型菌株的筛选采用辐射，化学试剂等因素处理细菌，以提高其变异几率，关键步骤是进行营养缺陷型微生物的筛选工作，营养缺陷型是指通过诱变产生的，由于发生了丧失某酶合成能力的突变，因而只能在加有该酶合成产物的培养基中才能生长的突变株。
营养缺陷型的筛选与鉴定涉及下列几种培养基：基本培养基（MM，符号为[-]）是指仅能满足某微生物的野生型菌株生长所需的最低成分的合成培养基。
完全培养基(CM，符号为[+])是指可满足某种微生物的一切营养缺陷型菌株的营养需要的天然或半合成培养基。
补充培养基（SM，符号为[A]或[B]等）是指在基本培养基中添加某种营养物质以满足该营养物质缺陷型菌株生长需求的合成或半合成培养基。
营养缺陷型菌株不仅在生产中可直接作发酵生产核苷酸、氨基酸等中间产物的生产菌，而且在科学实验中也是研究代谢途径的好材料和研究杂交、转化、转导、原生质融合等遗传规律必不可少的遗传标记菌种。
营养缺陷型的筛选一般要经过诱变、淘汰野生型、检出和鉴定营养缺陷型四个环节。
现分述如下：第一步，诱变剂处理：与上述一般诱变处理相同。
第二步，淘汰野生型：在诱变后的存活个体中，营养缺陷型的比例一般较低。
通过以下的抗生素法或菌丝过滤法就可淘汰为数众多的野生型菌株即浓缩了营养缺陷型。
抗生素法有青霉素法和制霉菌素法等数种。
青霉素法适用于细菌，青霉素能抑制细菌细胞壁的生物合成，杀死正在繁殖的野生型细菌，但无法杀死正处于休止状态的营养缺陷型细菌。
制霉菌素法则适合于真菌，制霉菌素可与真菌细胞膜上的甾醇作用，从而引起膜的损伤，也是只能杀死生长繁殖着的酵母菌或霉菌。
在基本培养基中加入抗生素，野生型生长被杀死，营养缺陷型不能在基本培养基中生长而被保留下来。
菌丝过滤法适用于进行丝状生长的真菌和放线菌。
其原理是：在基本培养基中，野生型菌株的孢子能发芽成菌丝，而营养缺陷型的孢子则不能。
通过过滤就可除去大部分野生型，保留下营养缺陷型。
第三步，检出缺陷型：具体方法很多。
实验六 大肠杆菌营养缺陷型的筛选
实验六大肠杆菌营养缺陷型的筛选一、实验目的•1、学习掌握培养基的配制方法•2、学习掌握消毒灭菌的原理与方法•3、学习掌握紫外线诱变育种的方法•4、学习掌握营养缺陷型的筛选方法•5、学习掌握微生物接种及划线分离等基本技术，巩固加强无菌操作技术.二、实验原理•（一）培养基•培养基（culture medium）：人工配制的供微生物生长或产生代谢产物的营养基质。
1、制备培养基的原则•目的明确、营养协调、理化适宜、经济节约•1 ）根据营养类型设计培养基•2 ）注意培养基中各种营养物质的浓度及比例•3 ）适宜PH、氧化还原电位、水的活化度•4 ）营养物质廉价易得•5 ）灭菌：高温灭菌对营养物质的破坏及pH变化2、培养基类型•1）物理状态：固体、液体、半固体•2 ）、化学组份：天然或合成培养基•3 ）、根据用途：•A、加富培养基（enrichment medium）•B、选择培养基（selective medium）•C、鉴别培养基（differential medium）（二）消毒与灭菌•1、消毒、灭菌的概念•2、灭菌的方法(1)高温灭菌火焰灼烧法：干热灭菌高烘箱热空气法：150—170℃，2h;温灭菌巴氏消毒法：60—85 ℃，20min.煮沸消毒法：100℃湿热灭菌间歇灭菌法(丁达尔灭菌法)：高压蒸汽灭菌：＞110℃超高温瞬间灭菌135-150 ℃ 2-6S高压蒸汽灭菌相同温度下，湿热比干热灭菌效果好•蒸汽存在潜热；•蛋白质更易变性；•湿热蒸汽穿透力比干热空气强；微生物耐热性能细菌内生孢子＞真菌孢子＞营养体影响灭菌的因素温度微生物种类；微生物的数量；培养基的体积；培养基的性质:浓度、PH（2）辐射灭菌(radiation sterilization) 利用电磁辐射产生的电磁波进行灭菌的方法紫外线：260nm效果最好；电离辐射：X射线，γ射线；可见光长时照射（3）过滤除菌（4）高渗作用（5）干燥（6）超声波（三）诱变育种•1、基因突变的概念•2、自发突变与诱发突变•3、常用诱变剂（四）营养缺陷型•营养缺陷型是由基因突变而丧失合成某种其生长所必需的营养物质的能力，必须在培养基中添加相应的营养成分才能正常生长的突变型。
营养缺陷型菌株的检出方法
营养缺陷型菌株的检出方法
营养缺陷型菌株是指由于缺乏一定的营养物质而在培养基上无法生长的微生物菌株。
营养缺陷型菌株通常需要添加特定的营养物质才能够在培养基上生长，因此对这类菌株的检出是非常重要的。
下面将介绍一些常见的营养缺陷型菌株的检出方法。
1.培养基筛选法
培养基筛选法是最常用的检出营养缺陷型菌株的方法之一。
该方法通过设计特定的培养基，只有符合特定营养要求的菌株才能够生长。
例如，对于缺乏特定氨基酸的菌株，可以设计一种缺乏该氨基酸的培养基，只有含有相应营养物质的菌株才能在该培养基上生长。
2.生化特性检测法
生化特性检测法是通过检测菌株的生化特性来区分不同类型的菌株。
对于营养缺陷型菌株，可以通过检测其在缺乏特定营养物质的条件下的代谢特性来确定其是否为营养缺陷型菌株。
例如，缺乏一种氨基酸的菌株在培养基上生长会产生特定的代谢产物，通过检测这些产物就可以确定该菌株是否为营养缺陷型菌株。
3.分子生物学方法
分子生物学方法在检出营养缺陷型菌株方面也具有重要的应用价值。
通过对菌株的基因组进行测序分析，可以发现其缺乏特定代谢途径的基因或者具有特定缺陷型基因的特征。
通过分析这些基因的表达情况可以确定菌株是否为营养缺陷型菌株。
总的来说，对于营养缺陷型菌株的检出需要综合运用培养基筛选法、生化特性检测法和分子生物学方法的手段。
通过综合应用这些方法可以快速、准确地检出营养缺陷型菌株，为菌株的鉴定和分类提供重要的帮助。
同时，对于一些工业应用、食品安全和环境监测等领域也有重要的意义。
营养缺陷型菌株的筛选
营养缺陷型菌株的筛选采用辐射，化学试剂等因素处理细菌，以提高其变异几率，关键步骤是进行营养缺陷型微生物的筛选工作，营养缺陷型是指通过诱变产生的，由于发生了丧失某酶合成能力的突变，因而只能在加有该酶合成产物的培养基中才能生长的突变株。
营养缺陷型的筛选与鉴定涉及下列几种培养基：基本培养基（MM，符号为[-]）是指仅能满足某微生物的野生型菌株生长所需的最低成分的合成培养基。
完全培养基(CM，符号为[+])是指可满足某种微生物的一切营养缺陷型菌株的营养需要的天然或半合成培养基。
补充培养基（SM，符号为[A]或[B]等）是指在基本培养基中添加某种营养物质以满足该营养物质缺陷型菌株生长需求的合成或半合成培养基。
营养缺陷型菌株不仅在生产中可直接作发酵生产核苷酸、氨基酸等中间产物的生产菌，而且在科学实验中也是研究代谢途径的好材料和研究杂交、转化、转导、原生质融合等遗传规律必不可少的遗传标记菌种。
营养缺陷型的筛选一般要经过诱变、淘汰野生型、检出和鉴定营养缺陷型四个环节。
现分述如下：第一步，诱变剂处理：与上述一般诱变处理相同。
第二步，淘汰野生型：在诱变后的存活个体中，营养缺陷型的比例一般较低。
通过以下的抗生素法或菌丝过滤法就可淘汰为数众多的野生型菌株即浓缩了营养缺陷型。
抗生素法有青霉素法和制霉菌素法等数种。
青霉素法适用于细菌，青霉素能抑制细菌细胞壁的生物合成，杀死正在繁殖的野生型细菌，但无法杀死正处于休止状态的营养缺陷型细菌。
制霉菌素法则适合于真菌，制霉菌素可与真菌细胞膜上的甾醇作用，从而引起膜的损伤，也是只能杀死生长繁殖着的酵母菌或霉菌。
在基本培养基中加入抗生素，野生型生长被杀死，营养缺陷型不能在基本培养基中生长而被保留下来。
菌丝过滤法适用于进行丝状生长的真菌和放线菌。
其原理是：在基本培养基中，野生型菌株的孢子能发芽成菌丝，而营养缺陷型的孢子则不能。
通过过滤就可除去大部分野生型，保留下营养缺陷型。
第三步，检出缺陷型：具体方法很多。
营养缺陷型菌株筛选课件
在环境保护领域的应用
环境保护领域中，营养缺陷型菌株可用于污染物的降解和 治理。通过基因工程技术，将污染物降解酶编码基因导入 营养缺陷型菌株中，使其在缺乏特定营养物质的情况下仍 能降解污染物，从而实现对环境污染的治理和修复。
例如，在生产乙醇、丁醇等生物燃料时，可以通过营养缺陷型菌株的筛选，找到 在缺乏某种特定营养物质的情况下仍能高效发酵的菌株，从而提高生产效率和降 低成本。
在生物制药领域的应用
生物制药领域中，营养缺陷型菌株可用于药物的筛选和优化。 通过基因工程技术，将药物合成酶编码基因导入营养缺陷型 菌株中，使其在缺乏特定营养物质的情况下仍能合成药物， 从而实现对药物合成的精确调控。
营养缺陷型菌株的保存与扩增
保存方法
选择适当的保存方法，如冷冻干燥法、液氮冷冻法等，确保营养缺陷型菌株长 期保存不失活。
扩增培养
对筛选得到的营养缺陷型菌株进行扩增培养，获得大量用于后续实验的菌体。
03 实验操作与注意事项
实验材料准备
培养基
选择适当的培养基配方，以满足 营养缺陷型菌株的生长需求。
菌种
此外，随着合成生物学和进化工程等领域的不断发展，未来对营养缺陷型菌株的应用将更加广泛和深入。通过合成生物学技 术，可以设计和构建具有特定功能的微生物细胞工厂；通过进化工程技术，可以定向进化菌株的适应性和代谢能力，从而为 解决能源、环境、医疗等领域的问题提供更多可能。
THANKS
化学诱变
使用化学诱变剂如硫酸二 乙酯、甲基磺酸乙酯等处 理菌株，促使基因突变。Fra bibliotek生物诱变
大肠杆菌营养缺陷型菌株的筛选
三、实验过程
1 菌液制备：实验前14－16小时开始在肉汤 培养基中培养－离心取沉淀－用生理盐水 制成菌液。 2 诱变处理：将菌液置于培养皿中，紫外线 照射处理，再用肉汤培养基培养12小时。 3 青霉素淘汰野生型：离心洗涤洗去培养基 －制成菌液－无N培养12小时－在2N培养基 中用青霉素淘汰野生型－分别接入肉汤培 养基和基本培养基。实验十Biblioteka 大肠杆菌营养缺陷型 的筛选
一、实验原理
大肠杆菌因受到紫外线强烈照射而发生突 变，其中有一些突变类型是营养缺陷型， 通过特定的方法，可将有关的营养突变型 筛选出来。然后在通过对这些性氧缺陷型 进行营养生长谱法，可以鉴定有关突变的 营养缺陷种类。
实验材料
1 菌种：大肠杆菌K12SF+ 2 工具：培养皿，三角烧瓶，吸管，离心管 3 培养基：肉汤液体培养基，肉汤液体培养 基ZE，基本液体培养基，基本固体培养基， 无N基本液体培养基，2N基本液体培养基， 混合氨基酸，混合维生素和核酸 4 生理盐水
营养缺陷型的检出
1 取差异最大的一组，在完全培养基上选取 80个菌落，分别对应接种在完全培养基和基 本培养基上。 2 37℃培养12小时。 3 选在基本培养基上不长，完全培养基上生 长的菌落，即是营养缺陷型。
细菌营养缺陷型的诱变和筛选
微生物大实验细菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选细菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选摘要用某些物理因素或是化学因素，使基因发生突变，丧失合成某一物质的能力，因而它们在基本培养基上不能生长，必须补充某些物质才能生长，这样从野生菌经诱变筛选到的菌株，称为营养缺陷型。
紫外线可以诱导细菌发生突变，产生营养缺陷型菌株。
筛选营养缺陷型菌株必须经过如下几个步骤：诱变处理、营养缺陷型的检出、划线复证、生长谱鉴定、缺陷型菌株纯化。
又因处理的细菌所得到的突变菌仍然是很少的部分，因此必须采用有效的筛选方法，才能分离到突变型。
关键词紫外诱变营养缺陷型营养缺陷型的检出划线复证生长谱鉴定引言营养缺陷型：需要在基本培养基中补加某种营养成分（如氨基酸、维生素、核苷酸等）才能生长的微生物突变体，通过基因突变产生。
微生物细胞本身能吸收周围环境中的简单营养物，经过自身代谢合成生长所需的各类营养物质。
如果发生基因突变，则细胞失去合成与这些基因有关营养物质的能力，只有在培养基中补加这类营养物质后，突变细胞才能生长，故又名营养缺陷型突变体。
此类突变体在理论研究和生产实践中都有重要意义，是研究代谢途径和遗传规律必不可少的标记菌种，亦可直接用于生产氨基酸、核苷酸等代谢产物。
为了获得营养缺陷型菌株，需从诱变处理后的菌液中认真筛选，以便检出突变体，常用的方法有：影印接种法、夹层培养法和青霉素浓缩法等。
影印接种法：将待测的浓缩菌悬液涂在完全培养基平板上，待其长好后作为母平板。
用一小块灭菌的丝绒固定在直径较平板略小的圆柱形木块上，作为接种工具。
用它在母平板上轻轻印一下，再在基本培养基平板上印一下，经培养后，影印平板上长出的菌落与母平板上的菌落位置对应，比较二个平板上菌落的生长状况，即可从相应位置的母平板上选出待测的营养缺陷型菌株。
夹层培养法：先在培养皿中倒一层不含菌的基本培养基，待冷凝后，加一层含菌的基本培养基，冷凝后，再加一层不含菌的基本培养基，经培养出现菌落后，在培养皿底的相应位置做上标记，然后再加一层完全培养基。
大肠杆菌营养缺陷型菌株的诱变及筛选 山大微生物大实验
山东大学实验名称：大肠杆菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选作者：姚健(201000140136)同组者：刘新强指导老师：林建群(教授)实验日期：2013年5月22日-6月1日微生物大实验报告大肠杆菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选山东大学生命基地班姚健 201000140136摘要：营养缺陷型菌株或称异养型（auxotroph）菌株是许多微生物生理生化以及遗传研究的重要菌株材料。
此类菌株不仅在生物研究方面有着很重要的作用，而且在生物工程和生物技术上都有很重要的作用。
营养缺陷型菌株的筛选也成为了微生物科学工作者必备的基本实验技能之一。
实验采用物理诱变非电离辐射紫外线（15W）为诱变剂，来对大肠杆菌诱发突变，并用抗青霉素法淘汰野生型（富集营养缺陷型），采用点植对照法检出营养缺陷型，划线复证后得到两株营养缺陷型菌，进行生长谱法鉴定，两个平板都长满了菌落，即没有预期的营养缺陷型菌株出现。
Abstract:Auxotrophic bacterias are very important materials in the microbial biochemical and genetical research.Auxotrophic bacterias are important to not only bioresearch but also biotechnology.The screening of auxotrophic bacterias has become one of scientists’ primary experimental skills.We use the ultravioley light as the mutagen to induce the mutation of the E.coli,then weed out the wild type by Penicillin resistance method to gather auxotrophic bacterias,next we check out the auxotrophic bacterias by spot planting.We get two auxotrophic bacterias by marking out，finally we test the type of auxotroph by auxanography.Each bacteria grew well everywhere in the plate indicating that t here’s no auxotrophic bacteria.关键词：大肠杆菌；营养缺陷型菌株；紫外线诱变；划线复证；生长谱测定；筛选Key words:Escherichia;auxotrophic bacteria；ultravioley mutation;marking out;auxanography;screening1引言筛选营养缺陷型菌株一般具有四个环节：诱变处理、营养缺陷性的浓缩、检出、鉴定缺陷型。
实验七 营养缺陷型菌株的筛选
3、淘汰野生型，浓缩缺陷型 （第三天）
（4）培养24小时后，按1∶1加入2N基本培 养液5毫升（含青霉素钠盐2000单位/毫 升），使青霉素钠在菌液中的最终浓度约 为1000单位/毫升，再放入37℃温箱中培 养。——利用青霉素只作用于生长的细胞， 杀死在基本培养基中生长的野生型，留下 休眠不生长的缺陷型。 （5）培养24小时后， 3500转/分离心10分 钟，用基本液体培养基重复离心洗涤三次， 悬浮于5mL基本培养液，备用。——去除 青霉素钠（第四天内容）
逐个检出法（点接）
用接种针或牙签将诱变处理后CM上长出的 菌落在 MM 和 CM 两副平板上接种（先 MM 后 CM ， 操 作 时 要 避 免 带 入 CM 培 养 基 成 分），依次在相应位置点种，然后一起培 养，观察其生长情况。 此法结果明确，但工作量大。
CM
MM
影印平板法
（ 1 ）将一较培养皿直径小1cm 的金属圆筒蒙上一层 灭菌的丝绒，用金属夹夹住，灭菌。 （2）完全培养基上长出的全部菌落在丝绒上轻轻一 压，使之成为印模，标记方位。 （3）将基本培养基平皿和完全培养基平皿在标记的 同一方位上先后轻轻一压，此菌印模即复印于上。 （4）将CM和MM在恒温培养箱中培养。 （5）二平皿相同方位进行比较，即可发现在MM平皿 上长出的菌落少于 CM 平板上的。 MM 上未长而相应 于CM上长出的那几个菌落就可能是缺陷型。 此法要求平皿上菌落不能太多，菌落之间应有一 定间隔。
附：检出营养缺陷型的方法介绍
夹层培养法——四层培养基（三基本一完 全） 限量补充培养法——微量富（限）营养物 逐个检出法——灭菌接种针或牙签，分别 接种于基本培养基和完全培养基 影印平板法——分别转印于基本培养基和 完全培养基上
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实验六大肠杆菌营养缺陷型的筛选
一、实验目的
•1、学习掌握培养基的配制方法
•2、学习掌握消毒灭菌的原理与方法
•3、学习掌握紫外线诱变育种的方法
•4、学习掌握营养缺陷型的筛选方法
•5、学习掌握微生物接种及划线分离等基本技术，巩固加强无菌操作技术.
二、实验原理
•（一）培养基
•培养基（culture medium）：人工配制的供微生物生长或产生代谢产物的营养基质。
1、制备培养基的原则
•目的明确、营养协调、理化适宜、经济节约
•1 ）根据营养类型设计培养基
•2 ）注意培养基中各种营养物质的浓度及比例
•3 ）适宜PH、氧化还原电位、水的活化度
•4 ）营养物质廉价易得
•5 ）灭菌：高温灭菌对营养物质的破坏及pH变化
2、培养基类型
•1）物理状态：固体、液体、半固体
•2 ）、化学组份：天然或合成培养基
•3 ）、根据用途：
•A、加富培养基（enrichment medium）
•B、选择培养基（selective medium）
•C、鉴别培养基（differential medium）
（二）消毒与灭菌
•1、消毒、灭菌的概念
•2、灭菌的方法
(1)高温灭菌
火焰灼烧法：
干热灭菌
高烘箱热空气法：150—170℃，2h;
温
灭
菌巴氏消毒法：60—85 ℃，20min.
煮沸消毒法：100℃
湿热灭菌间歇灭菌法(丁达尔灭菌法)：
高压蒸汽灭菌：＞110℃
超高温瞬间灭菌135-150 ℃ 2-6S
高压蒸汽灭菌
相同温度下，湿热比干热灭菌效果好
•蒸汽存在潜热；
•蛋白质更易变性；
•湿热蒸汽穿透力比干热空气强；
微生物耐热性能
细菌内生孢子＞真菌孢子＞营养体
影响灭菌的因素
温度微生物种类；微生物的数量；培养基的体积；培养基的性质:浓度、PH
（2）辐射灭菌(radiation sterilization) 利用电磁辐射产生的电磁波进行灭菌的方法
紫外线：260nm效果最好；
电离辐射：X射线，γ射线；
可见光长时照射
（3）过滤除菌
（4）高渗作用
（5）干燥
（6）超声波
（三）诱变育种
•1、基因突变的概念
•2、自发突变与诱发突变
•3、常用诱变剂
（四）营养缺陷型
•营养缺陷型是由基因突变而丧失合成某种其生长所必需的营养物质的能力，必须在培养基中添加相应的营养成分才能正常生长的突变型。
它的基因型表示方法为：his C－his C＋，表型的表示方法为：HisC •营养缺陷型是一种负选择性标记（在选择培养基中不能生长），常用影印平板法进行分离
三、实验材料
• E.coli斜面菌种6支
•LB固体平板100个、基本培养基平板40个
•装有13.5ml PB的大试管3支、装有9ml PB的大试管3支
•装有50ml LB的250 ml三角瓶3支
•装有50ml 含有氨苄青霉素基本培养基的250 ml三角瓶1支
•装有4ml LB液体培养基的试管2支
•1ml移液管1支、10ml移液管6支、5ml移液管7支
•50ml离心管3支、15ml离心管2支
•培养皿2套、镊子2把、滴管2支、枪头60个、涂布器10支、牙签若干
•计数板、计数器、移液枪
四、实验内容及操作步骤
•（一）培养基的配制及材料灭菌
•LB培养基
•细菌基本培养基
•PB缓冲液
•氨基酸溶液（滤纸片）
•双蒸馏水950ml，胰蛋白胨10g，NaCL10g，酵母提取物5g，用1mol/LNaOH调节pH至7.0，加双蒸馏水至总体积
1000ml，121℃高压蒸汽灭菌30min
基本培养基
•NH4H2PO4 1g，MgSO4 ·7H2O 0.2g，葡萄糖5g，NaCL 5g，
K2HPO4 1g，水1000ml，pH7.0, 115 ℃灭菌20min
•含青霉素基本培养基：待LB培养基灭菌后冷却至50 ℃左右加入抗生素，至终浓度2000单位/ml
PB 缓冲液
•0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）：秤取Na2HPO4·12H2O 35.82g，溶于1000ml蒸馏水中，为A液；秤取NaH2PO4·2H2O 15.605g，溶于1000ml蒸馏水中，为B液。
取A液61ml，B 液39ml，可得100ml0.1 mol/L pH7.0的磷酸缓冲液
（二）营养缺陷型的筛选。