Roquefortine类生物碱的研究进展

第３２卷第２期２０１３年４月中国海洋药物ＣＨＩＮＥＳＥ　ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＭＡＲＩＮＥ　ＤＲＵＧＳＶｏｌ．３２　Ｎｏ．２Ａｐｒｉｌ，２０１３Ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉｎｅ类生物碱的研究进展△＊汤枝鹏，朱天骄，顾谦群，李德海＊（海洋药物教育部重点实验室，中国海洋大学医药学院，山东青岛２６６００３）摘　要：Ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉｎｅ是由真菌生产的一类结构复杂生物碱化合物，这类化合物来源于组氨酸和色氨酸，包含由吲哚吡咯二酮哌嗪骈合而成的四环母核，吲哚环的３位有异戊烯基取代，咪唑基通过单双键与四环母核相连。

此类化合物具有抗革兰氏阳性细菌和抗肿瘤活性。

本文主要从化合物的发现，生物活性，生物合成途径以及化学合成这几个方面对这类化合物的研究作全面的回顾。

关键词：Ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉｎｅ；次级代谢产物；真菌中图分类号：Ｒ９３１．６ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２－３４６１（２０１３）０２－０７６－０９ 真菌次级代谢产物是天然产物非常重要的来源之一，它们具有丰富的结构类型和良好的生物活性，如抗菌，免疫抑制，促进生长等，是药物先导化合物的重要来源；同时某些次级代谢产物会对人和动物的健康造成损害，被称为真菌毒素［１］。

Ｒｏｑｕｅｆｏｒ－ｔｉｎｅ类生物碱都是从来源于各种环境下的真菌中分离得到的，ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉｎｅ　Ｃ在高浓度时具有神经毒性，是１种常见的真菌毒素。

该类化合物的结构特征是包含由吲哚吡咯二酮哌嗪骈合而成的四环母核，吲哚环的３位有异戊烯基取代，咪唑基通过单键或双键与四环母核相连。

其复杂的结构特征引起了化学家的广泛兴趣，对于化合物的化学合成和生物合成研究工作正在广泛开展。

１　Ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉｎｅ类化合物的发现Ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉｎｅ　Ｃ（１）是第一个被分离得到具有吲哚吡咯二酮哌嗪骈合而成的四环母核结构的ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉｎｅ类化合物。

１９７５年日本的Ｏｈｍｏｍｏ等人在１株Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ中分离得到３个生物碱类化合物，分别命名ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉｎｅ　Ａ－Ｃ。

其中只有ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉｎｅ　Ｃ的结构符合本文论述的结构类型。

１９７６年法国的Ｓｃｏｔｔ等人在１株青霉中再次分到了化合物（１），并阐明了其化学结构，至此以后ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉｎｅ　Ｃ多次被不同的课题组重复分离［２－５］。

１９７８年Ｏｈｍｏｎｏ再次从上述真菌中分离得到了化合物（２）［６］，它是化合物（１）的３位和１２位双键被还原的产物，被认为是ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ－ｎｅ　Ｃ生物合成的前体。

１９９４年Ｍｕｓｕｋ等从来源于木薯的１株Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｖｅｒｒｕｃｏｓｕｍ　ｖａｒ．ｃｙ－ｃｌｏｐｉｕｍ中分离得到化合物（３），它是化合物（１）６位Ｎ的甲醛基取代物［７］。

化合物（４）是Ｋｏ－ｚｌｏｖｓｋｙ等于１９９６年分离得到的，它是化合物（１）１４位Ｎ的乙基化衍生物［８］。

２００３年Ｋｏｚｌｏｖｓｋｙ等从来源于俄罗斯冻土的Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ａｕｒｅｏｖｉ－ｒｅｎｓ中分离到了化合物（５），它是化合物（２）１６Ｎ的羧乙基衍生物［９］。

化合物（６）是２００５年由ＢｅｎＣｌａｒｋ等人从澳大利亚土壤中的Ｇｙｍｎｏａｓｃｕｓｒｅｅｓｓｉｉ中分离得到，它是该类化合物中唯一从非青霉属的真菌中分离得到的天然产物［１０］，它是化合物（１）１７位Ｃ上发生异戊烯基化的产物。

２００９年Ｄｕ等从１株深海来源的青霉属真菌Ｆ２３－２中分离得到了４个化合物（７～１０）［１１－１２］，其中１６位Ｎ上来源于乙酸甲羟戊酸途径的侧链取代以及１１ａ位的甲氧基取代都是首次报道，也是首次从深海来源样品中发现该类化合物。

化合物（１１）不是天然产物，而是化合物１在酸碱作用或紫外线照射的条件下发生双键异构化生成，其双键构型是Ｚ式［１３］。

＊△基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金（２０１００１３２１２００２６）；山东省优秀中青年科学家科研奖励基金计划（ＢＳ２０１０ＨＺ０２７）；中国海洋大学“青年英才工程”科研支持经费资助　作者简介：汤枝鹏（１９８７－），男，硕士研究生，主要从事海洋微生物活性次级代谢产物研究。

＊通讯作者：李德海，男，副教授Ｔｅｌ．：００８６－５３２－８２０３１６１９；ｆａｘ：００８６－５３２－８２０３３０５４；Ｅ－ｍａｉｌ：ｄｅｈａｉｌｉ＠ｏｕｃ．ｅｄｕ．ｃｎ　收稿日期：２０１２－０９－１８DOI:10.13400/ki.cjmd.2013.02.013２期汤枝鹏，等：Ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉｎｅ类生物碱的研究进展７７　图１　Ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉｎｅ类化合物的结构Ｆｉｇ．１　Ｔｈｅ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ　ｏｆ　ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉｎｅｓ２生物活性２．１　抗菌活性１９７９年Ｂｅｔｔｉｎａ　Ｋｏｐｐ，Ｈ．Ｊ．Ｒｅｈｍ报道了ｒｏ－ｑｕｅｆｏｒｔｉｎｅ　Ｃ的抑菌活性。

实验结果表明，Ｒｏｑｕｅｆｏｒ－ｔｉｎｅ　Ｃ能够抑制具有细胞色素呼吸链和过氧化氢酶的革兰氏阳性细菌的生长，而对于缺乏血红素的革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的生长基本上没有影响［１４］。

由此作者推测该化合物可能是血红素抑制剂。

对革兰氏阴性细菌没有抑制活性，合理的解释是化合物难以转运进入细胞，从而不能发挥作用。

１９８１年Ｂｅｔｔｉｎａ　Ｋｏｐｐ　ａｎｄ　Ｈ．Ｊ．Ｒｅｈｍ的研究发现其能够显著的抑制细菌ＲＮＡ的合成［１５］，而实验中也观察到的ＤＮＡ和蛋白质合成受到抑制，认为这是ＲＮＡ合成被抑制引发的连锁反应。

２００１年Ｃａｒｏｌｉｎｅ　Ａｎｉｎａｔ等研究了ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉｎｅ　Ｃ以及常见的环二肽对细胞色素Ｐ４５０的抑制活性。

研究结果表明ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉｎｅ　Ｃ对小鼠的微粒体显示出了很强的亲和力，其Ｋｓ值在０．２～８μｍｏｌ／Ｌ的范围变化。

对于人类Ｐ４５０酶的１Ａ１，１Ａ２，２Ｄ６和３Ａ４亚型也显示出很强的亲和力，但是对ＮＡＤＰＨ细胞色素ｃ还原酶没有作用［１６］。

文章中提到含氮的咪唑基能够与与血红素铁相连接，从而发挥作用，另外ｒｏｑｕｅ－ｆｏｒｔｉｎｅ　Ｃ的脱氢组氨酸基团和稠合的三环结构对其抑制活性有重要的影响。

对于该化合物抑菌机制研究一直在进行，但是没有得到确定的结论。

２．２　抗肿瘤活性研究者们还对该类化合物进行了抗肿瘤活性筛选，例如对从深海菌株Ｆ２３－２中分离得到的ｒｏ－ｑｕｅｆｏｒｔｉｎｅ　Ｆ－Ｉ分别进行了Ａ－５４９，ＨＬ－６０，ＢＥＬ－７４０２，ＭＯＬＴ－４肿瘤细胞株的抑制活性筛选［８－９］。

测试结果表明ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉｎｅ　Ｆ对４个细胞株有中等强度的抑制活性ＩＣ５０值分别为１４，３３．６，１３和２１．２μｇ／ｍＬ，ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉｎｅ　Ｇ只对Ａ－５４９，ＨＬ－６０有微弱的抑制活性，ＩＣ５０值分别为４２．５μｇ／ｍＬ和３３．６μｇ／ｍＬ，ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉｎｅ　Ｈ和ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉｎｅ　Ｉ并没有显示出明显的肿瘤抑制活性。

Ｂｅｎ　Ｃｌａｒｋ等对ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉｎｅ　Ｅ进行了抗肿瘤活性测试仅发现对小鼠细胞ＮＳ－１具有微弱的细胞毒活性，ＬＤ５０为２４μｇ／ｍＬ［７］。

３　生物合成研究３．１　生物合成相关机制的研究关于ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉｎｅ　Ｃ的生物合成途径研究开展地比较早也比较多。

这类物质的生物合成前体是色氨酸，组氨酸和甲戊羟酸（生物体内以二甲基丙烯焦磷酸酯的形式存在），并通过同位素标记实验得到了验证。

Ｂａｒｒｏｗ等曾报道过在Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉ－７８　中　国　海　洋　药　物３２卷ｕｍ　ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ培养基里分别添加［２－１４　Ｃ］标记的甲戊羟酸，［亚甲基－１４Ｃ］标记的色氨酸和［２－１４Ｃ］标记的组氨酸，检测出产物ｒｏｑｕｅｆｏｒｉｎｅ　Ｃ中掺入标记前体的比率分别为０．０８％，０．１５％和１．１２％［１７］。

此后，Ｇｏｒｓｔ－Ａｌｌｍａｎ等也通过添加［１，２－１３Ｃ２］标记的乙酸盐证明了化合物中的异戊烯基来源于甲戊羟酸。

研究者们还对异戊烯基引入的机制和组氨酸的脱氢化学机制进行了研究。

对异戊烯基的引入机制存在分歧，Ｂａｒｒｏｗ认为异戊烯基首先加在吲哚的１位或者２位，然后通过各种重排机制最终加到吲哚的３位上；另一种意见认为异戊烯基是直接加到吲哚的３位上。

目前第二种机制更被接受。

Ｂｈａｔ等［１８－１９］在Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ培养物中添加Ｌ－［２，４，５，６，７－２　Ｈ５］色氨酸，通过１　Ｈ－ＮＭＲ可以明显的检测到产物中存在着６位氚标记的ｒｏｑｕｅｆｏｒｉｎｅ　Ｃ，进一步联合质谱分析检测到产物中存在五氚代化合物（比例为８％）。

这一实验现象与之前Ｂａｒｒｏｗ等预测的中间体Ａ和Ｂｙ－ｃｒｏｆｔａｎｄ　Ｌａｎｄｏｎ［２０］预测酶偶联的中间体Ｂ相矛盾，之后Ｂｈａｔ等推断异戊烯基的引入方式是二甲丙烯基焦磷酸酯以ＳＮ２的机制直接进攻吲哚的Ｃ３位而来。

图２　预测生合成中间体结构Ｆｉｇ．２　Ｔｈｅ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ　ｏｆ　ｐｏｓｔｕｌａｔｅｄｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ Ｖｌｅｇｇａａｒ和Ｗｅｓｓｅｌｓ［２１］对ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉｎｅ　Ｃ中脱氢组氨酸部分脱氢作用的立体化学进行了研究。

实验方法分别对相同的青霉菌株添加（２Ｓ，３Ｓ）－［３－３Ｈ］组氨酸和（２Ｓ，３Ｒ）－［３－３　Ｈ］组氨酸前体，同时添加（２Ｓ）－［ｒｉｎｇ－２￠－１４Ｃ］组氨酸作为内标，然后比较产物ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉｎｅ中３　Ｈ∶１４　Ｃ的比例。

研究者观察到标记的组氨酸很好的掺入到产物中，比例达到了１％～４％，并且得出结论ｐｒｏ－Ｓ－氢在此过程中消除了，因此产物中双键都是Ｅ式构型。

３．２　Ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉｎｅ类的可能生物合成途径具体的生合成步骤首先是组氨酸和色氨酸在酶的催化下生成环二肽的结构（１２），然后是异戊烯基的引入，甲羟戊酸通过ＳＮ２的机制从吲哚环的背面进攻，然后是一步环合的反应生成了ｒｏ－ｑｕｅｆｏｒｔｉｎｅ　Ｄ；Ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉｎｅ　Ｄ在氧化酶的作用下发生脱氢作用就生成了ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉｎｅ　Ｃ，Ｒｏｑｕｅｆｏｒ－ｔｉｎｅ　Ｃ继续衍生化依次能得到其它的该类化合物。

图３　推测的ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉｎｅ的生合成途径Ｆｉｇ．３　Ｐｏｓｔｕｌａｔｅｄ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｐａｔｈｗａｙ　ｏｆ　ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉｎｅｓ２期汤枝鹏，等：Ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉｎｅ类生物碱的研究进展７９　４　化学合成这类化合物特异的结构特征引起了化学家们广泛的兴趣，其中Ｍａｄｅｌｅｉｎｅ　Ｍ．Ｊｏｕｌｌｉé小组已完成了ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉｎｅ　Ｃ，ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉｎｅ　Ｄ，ｉｓｏｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉｎｅ　Ｃ和ｉｓｏｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉｎｅ　Ｅ这４个化合物全合成研究。

４．１　Ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉｎｅ　Ｄ的全合成在１９９８年，为了确定ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉｎｅ　Ｄ的绝对构型，Ｗｅｉ－Ｃｈｕａｎ　Ｃｈｅｎ等人第一次完成了该化合物的全合成。