拟南芥原生质体的制备及转化
拟南芥原生质体的提取和转化
拟南芥原生质体的提取和转化拟南芥原生质体的提取和转化(1)取4周后抽薹前的叶片，切成1mm宽的长条，置于甘露醇溶液（称1.82g D-甘露醇于20ml双蒸水中）；共需叶片约90片；(2)将步骤1中细条捞出，置于酶解液中；避光，23℃,40-50rpm 摇床上酶解3小时；(3)酶解液过100-200目的筛子，收集滤液，置于15ml离心管中，均分为两管；于4℃，60g，离心15min；(4)原生质体用冰冷W5溶液轻柔洗涤，每管4ml；4℃，100g，离心1min；(5)弃上清，沉淀用冰冷的W5溶液轻柔悬浮，每管4ml；冰上放置30min；(6)23℃，100 g离心1min；弃上清，每管沉淀用0.5ml MaMg 重悬；以下操作均在23℃下进行：(7)取约10-20ug 质粒于1.5ml EP管中，加100ul 步骤6中的原生质体；用200ul 枪头（剪去前端）轻柔混匀；(8)加入110ul PEG/Ca 溶液，轻柔混匀；放置20-30min；(9)加入0.44ml W5 溶液，来回颠倒混匀；23℃，100 g，1min，brake 设为4-5；(10)弃上清，加100ul W5，混匀；加900ul W5，混匀；(11)上述混合液体置于六孔板内，23℃，避光，孵育6-18小时。
(1)酶解液：cellulose R10 15%Macerozyme R10 0.3%Mannitol 1.09gKCl 0.3MMES 0.3M调节pH值到5.7，55℃加热10min，冷却到室温再加入下列溶液CaCl20.15Mβ-巯基乙醇0.75mM(2)PEG溶液（40%，v/v）PEG4000 1g0.8M Mannitol 0.625ml1M CaCl2 0.25m(3)W5溶液154mM NaCl 9.0g125mM CaCl218.4g5mM KCl 0.37g5mM glucose 0.9g0.03%MES 0.3g用KOH调pH至5.8，定容至1000ml，高压灭菌(4)MaMg溶液1M MgCl20.5ml0.1%MES 0.1g0.4M Mannitol7.3g用KOH调pH至5.8，定容至1000ml，高压灭菌。
玉米和拟南芥的原生质体制备及瞬时表达体系的研究
玉米和拟南芥的原生质体制备及瞬时表达体系的研究作者：赵苏州卢运明张占路赵杨敏王磊来源：《安徽农业科学》2014年第12期摘要[目的]优化玉米和拟南芥原生质体的制备条件及瞬时表达体系。
[方法]以不同时期玉米叶片和拟南芥为材料分离原生质体，通过对不同酶浓度，解离时间和渗透压的研究，优化最佳分离原生质体体系；原生质体再经PEG介导的转化，通过GFP基因表达百分比鉴定原生质体活性和转化效率。
[结果]玉米和拟南芥原生质分离的最佳条件为：纤维素酶1.5%，离析酶0.5%；拟南芥酶解4 h，甘露醇浓度0.4 mol/L；玉米酶解6 h，甘露醇浓度0.45～0.50 mol/L。
最佳生长时期为：拟南芥6～8片叶；玉米二片叶。
用去内毒素质粒经PEG（玉米30% PEG，拟南芥40% PEG）诱导转化置于黑暗下培养，原生质体活性和转化效率较高，原生质体中可以观察到明显的GFP荧光。
[结论]玉米和拟南芥原生质体的制备受酶浓度，解离时间和渗透压的影响，在原生质体转化过程中，质粒DNA纯度，PEG浓度等是影响转化效率的关键因素，与拟南芥原生质体相比玉米原生质体要稳定性差一些。
关键词玉米；原生质体；拟南芥中图分类号S513；Q819文献标识码A文章编号0517-6611（2014）12-03479-04基金项目国家转基因生物新品种培育重大专项（2011ZX08003-002）。
作者简介赵苏州（1988-），男，山东临沂人，硕士研究生，研究方向：植物转录因子。
*通讯作者，研究员，博士，从事植物基因沉默研究。
植物原生质体是指植物细胞通过机械或酶解等特殊方法脱去细胞壁后，留下的裸露、具有生活力、被细胞膜所包围的原生质团。
原生质体由于没有细胞壁，可相对容易摄取外源DNA、质粒、病毒颗粒等外源遗传物质，是进行遗传转化的理想受体；同时，原生质体也是获得细胞无性系和选育突变体的优良起始材料；还可通过诱导形成杂种细胞，为创造新杂种开辟了途径。
拟南芥原生质体的提取和转化
拟南芥原生质体的提取和转化(1)取4周后抽薹前的叶片，切成1mm宽的长条，置于甘露醇溶液（称1.82g D-甘露醇于20ml双蒸水中）；共需叶片约90片；(2)将步骤1中细条捞出，置于酶解液中；避光，23℃,40-50rpm摇床上酶解3小时；(3)酶解液过100-200目的筛子，收集滤液，置于15ml离心管中，均分为两管；于4℃，60g，离心15min；(4)原生质体用冰冷W5溶液轻柔洗涤，每管4ml；4℃，100g，离心1min；(5)弃上清，沉淀用冰冷的W5溶液轻柔悬浮，每管4ml；冰上放置30min；(6)23℃，100 g离心1min；弃上清，每管沉淀用0.5ml MaMg重悬；以下操作均在23℃下进行：(7)取约10-20ug 质粒于1.5ml EP管中，加100ul 步骤6中的原生质体；用200ul 枪头（剪去前端）轻柔混匀；(8)加入110ul PEG/Ca 溶液，轻柔混匀；放置20-30min；(9)加入0.44ml W5 溶液，来回颠倒混匀；23℃，100 g，1min，brake 设为4-5；(10)弃上清，加100ul W5，混匀；加900ul W5，混匀；(11)上述混合液体置于六孔板内，23℃，避光，孵育6-18小时。
(1)酶解液：cellulose R10 15%Macerozyme R10 0.3%Mannitol 1.09gKCl 0.3MMES 0.3M调节pH值到5.7，55℃加热10min，冷却到室温再加入下列溶液CaCl20.15Mβ-巯基乙醇0.75mM(2)PEG溶液（40%，v/v）PEG4000 1g0.8M Mannitol 0.625ml1M CaCl2 0.25m(3)W5溶液154mM NaCl 9.0g125mM CaCl218.4g5mM KCl 0.37g5mM glucose 0.9g0.03%MES 0.3g用KOH调pH至5.8，定容至1000ml，高压灭菌(4)MaMg溶液1M MgCl20.5ml0.1%MES 0.1g0.4M Mannitol7.3g用KOH调pH至5.8，定容至1000ml，高压灭菌。
模式植物拟南芥
TTG1
正
GL1
调
节
GL3
因 子
负 调 节 因 子
EGL3
GL2
模式植物拟南芥
TRY CPC ETC1
ETC2 ETC3 TCL1 TCL2
表皮毛发生调控机制
R3 MYB
R3 MYB
模式植物拟南芥
(二) 植物激素
Gibberellin
GA
Salicylic acid
SA
Cytokinin
CTK
jasmonic acid
/
ABRC: The Arabidopsis Biological Resource Center NASC: European Arabidopsis Stock Center
模式植物拟南芥
实验技术-原生质体转化
模式植物拟南芥
• 拟南芥原生质体瞬时转化
原生质体是一种常用的植物瞬时表达系统，结合一些报告 基因使用，它具有检测速度快、操作简单等优点。
2. bHLH类转录因子：
GLABRA3 (GL3), ENHANCER OF GLABRA3 (EGL3)
3. 含WD40重复序列的转录因子：
TRANSPARENT TESTA GLABRA1 (TTG1)
模式植物拟南芥
4. C2H2类转录因子：
GLABROUS INFLORESCENCE STEMS (GIS) ,GIS2, Zinc Finger Protein 5 (ZFP5), ZFP6, ZFP8
模式植物—拟南芥
模式植物拟南芥
• 拟南芥简介 • 实验技术-原生质体转化
模式植物拟南芥
• 所谓模式生物是指生物的一个物种，它在人们研 究生命现象的过程中长期、反复的被作为研究材 料，并且，从这个物种的研究中得出的许多生命 活动规律往往代表了许多物种共同的规律。于是 人们在对该物种的形态、解剖、生理、生化、细 胞及遗传进行全面分析和归纳的基础上，把它作 为典范，将对其研究中得出的规律，推演到相关 的生物物种中，从而加快了对其它各种生物研究 的步伐。
拟南芥拟南芥四倍体质体的构建和表型分析
拟南芥拟南芥四倍体质体的构建和表型分析近年来，拟南芥作为模式植物，成为了植物学研究的重要对象之一。
在拟南芥的研究中，常常会运用到拟南芥四倍体质体，以便更好地理解植物的生长发育和分子机制。
本文将会介绍拟南芥四倍体质体的构建方法以及表型分析。
一、拟南芥四倍体质体的构建方法拟南芥四倍体质体可以通过紫杆菌介导的水平基因转移（Agrobacterium-mediated transformation）或者冷冻冷冻法（cryopreservation）构建。
其中，Agrobacterium介导的转化法是最常用的方法之一。
1. Agrobacterium介导的转化法首先，从拟南芥中提取悬浮细胞，并培养在适合它们生长的培养基上。
然后，制备含有农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）的载体，在它们的T-DNA区域中加入四倍体质量质（4C genomic DNA）。
悬浮培养的拟南芥细胞和Agrobacterium共同孵育，让植物吸收农杆菌。
最后，将受到转化的拟南芥细胞放置在无人参孔的培养基上，培养出植株。
2. 冷冻冷冻法首先，从四倍体拟南芥的根茎切片中取出小芽，将它们培养在含有地衣酸（DMSO）和甘油（glycerol）的冷冻浸入液中进行冷冻，获取单个芽。
然后，处理恢复的植株不断地进行经过筛选和验证，以得到合适的四倍体拟南芥植物品种。
二、拟南芥四倍体质体的表型分析由于四倍体质体包含了两倍的染色体数，会对植物的生长发育及表型产生较大影响。
下面将介绍在形态、生理等方面的一些表型变化。
1. 形态表型拟南芥四倍体质体的茎轴直径比二倍体要大，呈现矮胖型生长状态，而且叶子也较为宽大。
同时，花朵和花粉也会受到影响，四倍体拟南芥植株的花朵虽然比二倍体的要大，但数量却减少了，花瓣颜色如红色、紫色等也会发生明显的变化。
2. 生理表型四倍体拟南芥对环境的适应性较强，不容易受到温度、湿度等环境因素的影响。
同时，其生长期限也会相应延长。
拟南芥培养及遗传转化
拟南芥待转化植株培养及遗传转化一实验目的：获得待转化拟南芥植株并进行花序浸润转化植株。
二实验材料：拟南芥种子（拟南芥的生态型最好是Col-0或者Ws-O，Nd-O，No-O），25cm3花盆，15ml离心管，10ml吸管，Agar，乙醇，次氯酸钠，利福平，Silwet L-77，营养液配方所需试剂，营养土，蛭石，塑料薄膜，托盘等。
三实验步骤：1 待转化植株培养⑴种子消毒：20μl种子装入1.5ml离心管内，加1ml 75% 乙醇消毒1分钟；吸去乙醇，加入1ml 1%次氯酸钠，震荡洗涤15-20分钟；稍离心使种子沉于下部，吸去次氯酸钠，加入无菌蒸馏水清洗（清洗3次，每次洗完后稍离心，吸净水分）；均匀撒播于MS培养基平板上，注意每次洗脱用V ortxe充分混匀。
⑵春化作用：将MS培养基放到4℃冰箱中放置2天。
⑶将MS培养基放置在23 0 C/20 0 C光照培养箱16h/8h培养，在有3~5片成熟叶片后，移栽生长良好的拟南芥幼苗至用营养液浇灌过的营养土和蛭石（4:6）中生长，营养土和蛭石分装在25cm3的小培养皿中，保湿7天左右，湿度为60%~80%。
在生长期间适当浇灌营养液，按需要没3-4周一次（或者时间更长）。
⑷为了在每个植株上得到较多的花芽，当大多数植株第一个花序形成后剪去第一个花序，解除顶端优势，促使多个次生花序的同步出现。
当大多数花序约1~10cm高（剪主序后4~8d）时准备浸润。
表1 MS培养基注意事项：①溶化琼脂：用粗天平分别称取琼脂5.5g、蔗糖20 g，放入1 000 mL的搪瓷量杯中，再加入750 mL蒸馏水，用电炉加热，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状。
然后再将配好的混合培养液加入到煮沸的琼脂中，最后加蒸馏水定容至1000 mL，搅拌均匀。
②调节PH至5.7~5.8。
表2 营养液配方（无需调节PH）成分含量（mol/L）Ca(NO3)2·4H2O 1.01×10-3NH4H2PO4 1.30×10-4KNO3 5.10×10-3MgSO4·7H2O 4.98×10-4NaOH 3.13×10-5Fe-EDTA 2.24×10-5H3BO39.68×10-6Mncl2·4H2O 2.03×10-6CuSO4·5H2O 2.1×10-7MoO3 1.39×10-7Co（NO3）2·6H2O 8.59×10-8NH4NO3 2.93×10-52 农杆菌的培养取出保种的农杆菌菌液活化后，挑取农杆菌单菌落接入10mL无菌LB液体培养基中（一般含75mg/ L利福平、100mg/ L链霉素和100mg/ L卡那霉素），28℃恒温下250r/ min 振摇过夜培养。
转基因拟南芥步骤
转基因拟南芥步骤
转基因拟南芥啊，这可是个挺有意思的事儿呢！咱就一步步来瞧瞧。
首先呢，你得有拟南芥，这就好比做饭得有食材呀。
得挑那些长得
健康、精神的拟南芥植株。
然后呢，你得想好要转进去啥基因，这就
跟你决定给菜加啥调料一样重要。
接下来就是关键步骤啦！得把你想要的基因给弄出来，这可不是随
随便便就能做到的哦。
就好像从一堆宝贝里精准地挑出你最想要的那
一个。
挑出来基因后，还得找个合适的载体，让这个基因能跟着载体一起
进入拟南芥里。
这载体就像是一辆小车子，载着基因去它该去的地方。
然后呢，就是把带着基因的载体和拟南芥凑到一块儿啦。
这可不是
简单地放一起就行，得用一些特别的方法，就好像要把钥匙插进锁孔里，得找对角度和力度。
等基因进去了，还得让拟南芥好好长一长，看看基因是不是真的转
进去了。
这就跟等菜做好了，尝尝味道对不对一样。
哎呀，你说这过程是不是挺复杂的？但这也是科学的魅力所在呀！
每一步都得小心翼翼，就跟走钢丝似的。
要是有一步出了错，那可能
就前功尽弃啦。
你想想，要是能成功地把想要的基因转到拟南芥里，那多有成就感啊！就好像你自己创造了一个小小的奇迹。
而且这转基因拟南芥用处可大啦！可以帮助我们研究基因的功能，可以让我们更好地了解植物的生长发育，还能为农业生产带来新的希望呢！
总之呢，转基因拟南芥虽然步骤多，过程复杂，但只要你有耐心，有细心，就一定能做好。
你说是不是呢？可别小瞧了这小小的拟南芥哦，它里面蕴含着大大的科学奥秘呢！。
拟南芥转化简易操作
拟南芥转化简易操作（滴染）热带农科院热带生物所的庞永奇向我们介绍了一种拟南芥转化的简易操作。
背景：拟南芥转化大体分为浸花、喷洒及滴染几种，主要是将农杆菌菌液重悬至一定浓度进行侵染，使用中各有优缺。
本人在研究中感觉滴染效果较好，并在实践中做了些简略与细化。
方法改进：摇菌3～5mL过夜，1.5mL管集3mL菌，以1mL渗入缓冲液（1/2MS大量、5%（W/V）蔗糖、0.02～0.05%silwet L-77）重悬，吸取调好的农杆菌菌液滴于每一簇刚露白的花蕾处。
做好标记后直接放回光照培养。
一周内对所转植株进行二次重复侵染转化。
约两三周会有第一批几个荚成熟，直接取了进行筛选，效果好的话一般可以筛到几株至几十株阳性苗。
后续的种子当然也要收着。
结果：一般情况下只需转化2～8株即可筛选获得十几或几十个转基因阳性株系。
单株可以分不同侧枝进行，效果也还不错。
一定要注意苗的生长状况，温度失控、虫害以及打药都可能造成不得影响。
新配的悬浮液浸润效果要好些，浸花时要保证溶液浸入。
http:/newsf/2010-8/2010820173025393.htm拟南芥转化（浸泡）1.准备工作：250mL LB（装锥形瓶中）500mL 5%蔗糖50mL离心管5-6个灭菌转化一般在剪花后一周左右烧杯（500mL）、玻璃棒2.（1）农杆菌活化 5 mL LB +15uL Rif(20mg/mL)+3.75uL Kan(100mg/mL)+200uL菌液。
即：5 mL LB液中（含Rif 60ug/mL;Kan 50ug/L）。
28℃摇床过夜。
（2）将活化的农杆菌液转至250uL LB液中。
LB（250mL）+750uL Rif +187.5uL Kan +5mL预培养的菌液，28℃摇1-2d,至色。
（3）5000rpm;10min. 去上清，加5%蔗糖悬浮沉淀（剩一两管）加至烧杯，混匀，调OD值为0.5—0.8之间（0.7—0.8为最佳）加150uL表面活性剂silwet，混匀浸泡花90s包上保鲜膜，倒放16—24h,保湿正常培养，收种种子的筛选：MS板加入50uL/mL Kan 即可。
拟南芥转化
拟南芥的遗传转化（花序浸泡法）
1.培养基
YEP培养基：蛋白胨10g/L 酵母提取物10g/L
NaCl 5g/L 固体琼脂粉15g/L
2.拟南芥材料
培养拟南芥直到它们开始抽苔并产生花序（为了让植株产生更多不成熟的花序，需要推迟转化实验，将抽出的第一个苔剪去，以便于莲花座上腋芽分化出的第二花序的增值）。
3.拟南芥的遗传转化
1)含有目的基因的双元载体转化农杆菌，并接种当菌斑到5ml含有
适当抗生素的YEP液体培养基中，28℃培养2天。
2)再将这一培养基内注入500ml带有适当抗生素的YEP液体培养
基，并在28℃条件下培养16-24小时，使用生长达到稳定期的细胞（OD=1.0-1.6）
3)室温下4000rpm离心10分钟，收集农杆菌细胞，然后加入新制的
5%蔗糖，轻轻悬浮细胞，使OD =0.6-0.8
加入Silwet L-77至浓度0.05%，立刻混匀。
将农杆菌悬浮细胞转移到大的平皿中，用于侵染。
注：Silwet L-77可能有毒，腰带手套保护皮肤。
4)倾斜植株，使所有的花序都浸泡在农杆菌溶液中，浸泡时间1.5-2
分钟，取出后轻轻煽动10秒，控干3-5秒，将植株横放，暗处培养16小时，再恢复光照。
5)为了提高转化效率，可以浸泡植株两次，中间相隔7天。
6)分株收种子，并在含有合适抗生素的MS培养基上萌发，筛选得
到T1转基因拟南芥。
拟南芥原生质体的制备及转化
拟南芥原生质体制备转化操作流程主要试剂1. 纤维素酶解液：试剂15ml酶液体系1．1-1.5﹪Cellulase R10 (YaKult Honsha)0.225g干粉2．0.2-0.4﹪Mecerozyme R10 (YaKult Honsha)0.045g干粉3．0.4M mannitol1.09g干粉4．20mM KCl1 ml 0.3 M KCl母液5．20mM MES,pH5.7，1 ml 0.3 M MES,pH5.7母液6．加入10ml 水7．55℃水浴加热10分钟（钝化酶，提高酶的可溶性），冷却至室温后加入以下试剂8．10mM CaCl，1 ml 0.15M CaCl29．5 mM β-Mercaptoethanol（可选用）1ml 75mM β-Mercaptoethanol母液(Sigma A-6793) 10．0.1﹪BSA，1 ml 1.5﹪BSA（4℃保存）11．用0.45μm滤膜过滤后使用，酶液是淡棕色的澄清溶液。
2. PEG溶液（40%, v/v）（一次配置可以保存五天，但是最好现用现配，每个样品需100ul PEG4000溶液，可根据实验样品量调整溶液配置总量）PEG4000( Fluka, #81240)……………1g………………………………….4g 水…………………………………………………0.75ml…………………………..3g0.8 M Mannitol…………………………..0.625ml…………………………2.5ml1 M CaCl2或Ca(NO3)2………………..0.25ml………………………….1ml约1.2ml3. W5 溶液（1000ml）154mM NaCl, NaCl9g125mM CaCl2, CaCl2.H2O18.4g5mM KCl, KCl0.37g2mM MES（PH 5.7），MES0.39gpH to 5.8 with KOH，高温高压灭菌20分钟，室温保存。
拟南芥原生质体转化
2.2.7 拟南芥原生质体制备制备酶解液10 ml1．取幼嫩拟南芥叶片，使用新的单面刀片将叶片切为0.5 mm-1 mm大小。
（用胶带把下表皮沾掉，效果更好。
放一小培养皿里面降解）2．材料侵入10 ml酶解液中，暗培养3 h-4 h，至原生质体完全从叶片上解离下来。
3．酶解结束后轻轻晃动溶液，镜检酶解结果。
4．使用200目不锈钢网筛过滤原生质体至新离心管中10ml。
（冰上）5．100×g，4℃，离心2 min，收集原生质体。
6．重悬原生质体于等体积预冷的W5液体培养基中，100×g离心2 min，收集原生质体，（重复三次）。
（重悬时，先加入少些W5轻轻悬起原生质体，随后再轻轻加入剩W5）7．重悬原生质体于等体积预冷的W5液体培养基中，冰浴30 min。
8．100×g离心2 min，收集原生质体，重悬原生质体于1/10体积MMg中。
（看细胞浓度而定）9．取少量重悬原生质体镜检，其余用于转化或4℃保存一周内使用。
2.2.8 原生质体转化1．在2 ml离心管中一次加入10 µl质粒DNA(10-20 µl，大小在5 Kb之内)，100 µl原生质体，充分混匀后加入110 µl PEG4000溶液。
（3=1+2）2．上述混合物室温放置10-30 min。
3．反应结束后加入440 µl W5液体培养基，充分混匀。
4．100×g离心2 min，收集原生质体，移除上清。
5．加入500 µl W5溶液培养基，100×g离心2 min，收集原生质体，（重复一次,可以重复两次）。
6．重悬原生质体于1 ml W5液体培养基中，在细胞培养板中，24℃黑暗培养。
7．取黑暗培养18 h后的原生质体，加入荧光素底物，使用CCD照相成像保存。
2. 酶解液10ml在一个10ml试管中分别加入下列组分Cellulase R10 0.15 gMacerozyme R10 0.04 g200mM MES pH5.7 1 ml200mM KCl 1 mlD- Mannitol 0.728 g1 M CaCl2100 µl加ddH2O至10 ml（0.45um过滤）Cellulase R10 , Macerozyme R10 :Yakault of Japan 都是经科宏达买的能买到sigma 最好了，其他药品都是sigma3. W5培养基50 ml在一个100 ml三角瓶中分别加入下列组分2M NaCl 3.85 ml200mM KCl 1.25 ml200mM MES 0.5 ml1M CaCl2 6.25 ml加ddH2O至50 ml4. MMg培养基10 ml在一个50 ml三角瓶中分别加入下列组分D-Mannitol 0.728 g150mM MgCl2 1 ml200mM MES pH5.7 200 µl加ddH2O至10 ml5. PEG/Ca2+溶液在一个10 ml离心管中分别加入下列组分PEG4000 4 gD-Mannitol 0.364 g1M CaCl2 1 ml加ddH2O至10 ml。
两步酶解法制备拟南芥保卫细胞原生质体
植 物气 孔 由一 对 保 卫 细胞 包 围而 成 ， 控 制 着 它
先 决条 件 。常见 的提 取保卫 细胞 原生质 体方 法分为
一
自身 与外界 环境 气 体 和水 分 的交 换 ， 植 物 生 命 活 在 动 中发 挥作 用 ｌ 。保 卫细 胞 能 对 多 种 刺 激 如 光 （ １ ］ 红
ｓ ５℃ ，１ ０ｒｍｉ 水 浴 振荡 ３ ｎ ｉ２ ｎ ２ ／ ｎ ０ｍｉ，促 使 原 生 质 体 游 离 出 来 ；然 后 再 使 用 １ ５ 的 纤 维 素 酶 Ｃ ｌ ｌｓ Ｓ和 ． ｅｌ ａｅＲ ｕ ０ ０ ％的 果 胶 酶 Ｙ一３组 成 的酶 解 液 ，２ ．２ ２ ２℃ ，６ ～７ ／ ｎ 酶 解 ４ ～ ６ ｎ Ｏ ０ｒｍｉ， Ｏ ０ｍｉ，制 备 拟 南 芥 保 卫 细 胞 原 生 质 体 。 结 果 表 明 ，两 步 酶 解 法 可 以制 备 出 活性 较 高 、适 于 进 行 膜 片 钳 等 后 续 试 验 的原 生 质 体 。 关 键 词 ：两 步 酶 解 法 ；拟 南 芥 ；保 卫 细胞 ；原 生 质 体 制 备 文 献标 志 码 ：Ａ 文 章编 号 ：１０ —１ ６ ２０ ）４０ ６—３ ０ ２３ ８ （０ ８ ０ —０ ７０
（ ． ｌ ｇ ｆＨｏ ｔ ｕ ｔｒ ， ｎ ａ ｇ Ａｇ ｉｕｔ ｒｌＵｎｖ ｒｉ Ｕｒ ｍｃ ｉ ３ ０ ２， ｉａ ２ ｐ ｒｍｅ ｔｏ ｏ ｅｈ ｏｏ ｙ， １ Ｃｏｌ ｅｏ ｒｉ ｌｕ ｅ Ｘｉｆ ｎ ｒｃ ｌｕａ ｉｅ ｓｔ ｅ ｃ ｉ ｙ， ｕ ｈ ０ ５ Ｃｈｎ ； ａＤｅ ａ ｔ ｎ ｆ ｔｃ ｎ ｌｇ ８ Ｂｉ ２ ． ｎｅ ｆＴｉｓ ｅＣｕｔ ｒ ，Ｂ ｉｎ ｉｅｓｔ ｆＡｇ ｉｕｔ ｒ ，Ｂ ｉｎ ０ ２ ６ Ｃｈｎ ） ｂ Ｃｅ ｔｒｏ ｓ ｕ ｌｕ ｅ ｅｊ ｇ Ｕｎｖ ｒｉ ｏ ｒｃ ｌｕ ｅ ｅｊ ｇ １ ２ ０ ， ｉａ ｉ ｙ ｉ
拟南芥转化
1农杆菌感受态细胞的制备挑取根癌农杆菌GV3101单菌落于 5 ml含100 µg/ml利福平(Rifampicin)，50 µg/ml卡那霉素(Kanmycin)和50 µg/ml庆大霉素(Genmycin)的LB液体培养基中，28℃振荡培养过夜；取过夜培养菌液500 µl接种于50 ml LB(含相应抗生素)液体培养基中，28℃振荡培养4-8小时(OD600为0.5-0.8)；冰浴30分钟，4,000 rpm，4℃离心10分钟，加入10 ml预冷的20 mM CaCI2悬浮农杆菌细胞，4000 rpm，4℃离心10分钟；加入2 ml预冷的20 mM CaCl2悬浮细胞，冰浴，分装成每管100 µl，液氮中速冻后，置-80℃保存备用。
2.质粒转化农杆菌GV3101将构建的带有目的基因的质粒pCAMBIA-1304-plc转化(冻融法) 根癌农杆菌GV3101，步骤如下：1) 从-80℃冰箱中取出GV3101 感受态细胞(100 μl)，置于冰上解冻；2) 加入5 μl 含目的基因的质粒，轻轻混匀；冰水浴5 min；3) 液氮冷冻8 min；4) 37℃水浴热激5 min；5) 加入900 μl LB/ (Gen + Kan + Rif) 液体培养基后于28℃，160 r/min 振荡培养3－5 h 复苏；6) 复苏结束后于4000 r/min 室温离心5 min；7) 吸去800 μL 上清，然后重悬菌体，将菌体涂布于LB/ (Gen + Kan + Rif) 固体平板上；8) 28℃倒置培养2 d 直至长出阳性菌落；9) 挑取单克隆菌落，经LB/ (Gen + Kan + Rif) 液体培养，通过菌落(液) PCR验证，以确认是否成功转化。
经验证转化成功的农杆菌经即可用于后期拟南芥转化用。
（3拟南芥的转化在拟南芥抽苔4-5厘米时剪去主枝顶端，促进侧枝生长，约4-5天后进行转化，转化前要使土壤充分湿透，拟南芥苗要打药杀虫。
拟南芥原生质体分离及转化实验方法
拟南芥原生质体的分离与转化1．需要准备的器材名称名称名称剃须刀片75um尼龙膜0.45um滤膜玻璃皿血球计数板真空泵及适配器70mm培养皿或100ml锥形离心机（水平转子）滤布瓶圆周摇床2ml圆底管10/50ml注射器50ml圆底离心管六孔板2材料准备拟南芥品种为哥伦比亚，培养条件23°，10-13小时光照；20°，11-14小时黑暗培养3-4周左右。
3原生质体分离（1）选取开花前3-4周的拟南芥（5-7片真叶时）分离原生质体，用锋利的刀片切成大约0.5-1mm宽的细丝；10-15片叶子需要5-10ml的酶解液；切开后立刻转移到酶解液中，叶片充分浸没在酶解液中（3）避光，真空泵-15~-20 (inHg)抽真空30分钟；（3）再避光室温酶解至少3小时，同时缓慢摇动（圆周摇床，速度40）,用显微镜观察释放的原生质体状态；（5）酶解结束后，加入等体积的W5溶液，稍有力地用手水平摇动10秒钟，释放原生质体；（6）使用75um尼龙膜过滤原生质体到50ml的圆底离心管中，再加W5溶液冲洗条块；（7）100g水平离心3分钟沉淀原生质体，用5 ml移液器吸出上清。
（注：离心机需采用水平转子，且升降速不可超过3，否则细胞可能破碎，以下所有离心步骤均需采用此设置。
）（8）加入适量W5重悬，冰浴30min；（9）弃上清，加适量MMG溶液重悬。
原生质体浓度为2*106/ml，血球计数器计数。
（注：1、吸取原生质体所用枪头均需剪去枪头尖以防其对细胞造成伤害；2、以上所有步骤在室温进行。
）4原生质体转化（1）加入10~20ug质粒到2ml离心管中，加入200ul原生质体（大约4*105细胞），再加入220ul新配的20% PEG溶液，混匀，室温避光放置5-7分钟诱导转化；（2）诱导转化结束后缓慢加880ul W5溶液，轻轻颠倒混匀，100水平离心3分钟，弃上清；（3）加1ml WI溶液重悬，转移到六孔板中（已预先加入1ml WI溶液）室温（或22℃）暗处培养6~16小时，若用于提取原生质体基因组DNA，需培养48小时。
北方地区拟南芥栽培技术及基因转化体系的构建
试验研究北方地区拟南芥栽培技术及基因转化体系的构建摘要：从基质的配制、播种方法、栽培管理、基因转化及转化植株筛选等方面对北方地区拟南芥的栽培技术和基因转化体系的构建方法进行了介绍，旨在为拟南芥在北方种植和利用拟南芥展开植物的分子研究提供依据。
关键词：拟南芥；栽培技术；转化体系拟南芥(Arabidopsis thaliana)属十字花科植物，又名鼠耳芥、阿拉伯芥、阿拉伯草。
它具有植株小、每代时间短、结籽多、生活力强等特点，是研究有花植物的遗传、细胞、发育、分子生物学的模式植物，被誉为植物界的“果蝇”。
现在发现的拟南芥生态型共有750多个，其中最常用的三种是Landsberg erecta(Ler)、Columbia (Col)、Wassilewskija(Ws)，其中Col生态型用于拟南芥的全基因组测序。
为了充分发挥这一模式植物的优点，掌握拟南芥在北方地区的培养技术就显得非常重要。
结合本地的试验条件和气候特点及实践经验，笔者着重在拟南芥的培养介质、播种方法、温湿度、光照条件及基因转化的常用方法等方面进行了概述。
1栽培基质的配制为了保证提供充足的营养与良好的通气透水性，将蛭石、草炭土按1∶1的比例混匀，180℃高温灭菌3h。
将灭菌的基质装入花盆中，然后将花盆放入盛有清水的托盘中，待水渗透到土壤表面后，将托盘中的水倒掉。
2拟南芥的播种播种前低温4℃处理2~3d(有助于种子萌发)。
由于拟南芥种子很小，一般采用蒸馏水悬浮种子，牙签点播的方法播种。
我们创新采用0.1%的琼脂粉溶液悬浮拟南芥种子，用200μl的移液枪配200μl枪头(将枪头剪掉0.5cm)反复吹吸几次，种子即可较均匀的悬浮且不沉降，调种子浓度为1~3粒/滴，用移液枪播入花盆。
每盘采用四周点播，中央一处的播种法，每点1滴。
播种后花盆覆保鲜膜，保持基质表面湿润，出苗后撤掉保鲜膜。
播种后的花盆放入人工气候箱。
3拟南芥的栽培管理拟南芥不耐旱，应及时浇水。
花序浸染法转化拟南芥
花序浸染法转化拟南芥1 种植或者移栽拟南芥之前都需要提前一天泡土，泡土过程中要加足量的水。
营养土和蛭石1：1比例混合。
2 可以采取两种方法种植野生型拟南芥：一种是直接在大钵子里种八、九颗，小钵子里种四、五颗，等它稍微长大以后去掉长势不好的或者不能成活的，大钵子保留四颗，小钵子保留两颗，这种方法不用移栽；另一种是现在大钵子里种上几十颗（小钵子里相应的减少），等它们长成小苗后移栽（千万不要等它们长大了再移栽，因为这时它们的根会缠绕在一起，很不好移栽，而且还容易伤根），这种方法移栽比较麻烦，但是在移栽过程中能保证你要移栽的每一颗都是长势良好的拟南芥。
不管你采取哪种方法，在种下拟南芥后都需要浇水并盖膜，盖膜的目的是为了保持水分。
注意：移栽拟南芥后还需要盖3到4天的膜，因为刚移栽的苗子比较小。
总之盖膜时间自己灵活掌握。
3 转拟南芥一般用GV3101这个农杆菌，在你电转农杆菌，挑取阳性克隆检测后，先用2ml离心管少量摇菌，每管装1ml的LB，分装2管，摇8—10小时（时间灵活掌握，有时候需要摇更长的时间才能浑浊）待浑浊后再转移到500ml三角瓶（按1：100的比例装有200ml的LB）中大量摇菌8—10小时直到浑浊为止（有时候需要摇更长的时间才能浑浊）。
浑浊的标准是OD值为0.8，但是现在基本都不测OD值。
（在摇菌过程中所用的离心管和LB要灭菌，另外还要注意添加抗生素利福平，最好选用利福平和另外一种到两种抗生素以达到双抗或者三抗的效果，实际上双抗就可以了，理论上可以添加三种抗生素，一种是利福平，GV3 101农杆菌本身就是抗利福平的；另一种是农杆菌自身所携带的协助Ti质粒载体上的基因所抗的抗生素；还有一种就是T-DNA区内基因所对应的抗生素），接下来就是离心富集农杆菌（用离心瓶或者是50ml的大离心管，这个时候离心瓶或者50ml大离心管可以灭菌也可以不灭菌），然后用100ml的5﹪的蔗糖悬浮，蔗糖溶液中加入20微升表明活性剂，也就是浓度0.02%（此时的蔗糖溶液就不用灭菌了，因为以后的侵染也不在超净工作台操作）。
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拟南芥原生质体制备转化操作流程
主要试剂
1. 纤维素酶解液：
试剂
15ml酶液体系
1．1-1.5﹪Cellulase R10 (YaKult Honsha)0.225g干粉
2．0.2-0.4﹪Mecerozyme R10 (YaKult Honsha)0.045g干粉
3．0.4M mannitol1.09g干粉
4．20mM KCl1 ml 0.3 M KCl母液
5．20mM MES,pH5.7，1 ml 0.3 M MES,pH5.7母液
6．加入10ml 水
7．55℃水浴加热10分钟（钝化酶，提高酶的可溶性），冷却至室温后加入以下试剂8．10mM CaCl，1 ml 0.15M CaCl2
9．5 mM β-Mercaptoethanol（可选用）1ml 75mM β-Mercaptoethanol母液(Sigma A-6793) 10．0.1﹪BSA，1 ml 1.5﹪BSA（4℃保存）
11．用0.45μm滤膜过滤后使用，酶液是淡棕色的澄清溶液。
2. PEG溶液（40%, v/v）（一次配置可以保存五天，但是最好现用现配，每个样品需100ul PEG4000溶液，可根据实验样品量调整溶液配置总量）
PEG4000( Fluka, #81240)……………1g………………………………….4g 水…………………………………………………0.75ml…………………………..3g
0.8 M Mannitol…………………………..0.625ml…………………………2.5ml
1 M CaCl2或Ca(NO3)2………………..0.25ml………………………….1ml
约1.2ml
3. W5 溶液（1000ml）
154mM NaCl, NaCl9g
125mM CaCl2, CaCl2.H2O18.4g
5mM KCl, KCl0.37g
2mM MES（PH 5.7），MES0.39g
pH to 5.8 with KOH，高温高压灭菌20分钟，室温保存。
4. MMG溶液
MaMg溶液（500ml）
15mM MgCl2，MgCl0.71g
4 mM MES(PH5.7)MES0.39g
0.4 M mannitol，Mannitol36.5g
用KOH调pH 5.7，高温高压灭菌20分钟，室温保存。
5. WI溶液
WI(200ml)
0.5M mannitol，mannitol18.217g
4mM MES,pH5.7，MES0.156g
20mM KCl，KCl0.12g
高温高压灭菌，室温保存。
实验步骤
1. 土培室播种种植拟南芥。
2. 生长良好情况下在未开花前用于取材叶片制备原生质体。
3. 剪取中部生长良好的叶片用新的剃须刀片切成0.5 -1 mm宽的叶条。
4. 将切好叶条掷入预先配置好的酶解液（10ml的酶液用125ml 的三角瓶装）中（每5-10 ml 酶解液大约需10-20片叶子（小量））(100 -150 叶片需要40-60ml酶解液（大量）)。
并用镊子帮助使叶子完全浸入酶解液。
5. 用真空泵于黑暗中抽5-30分钟。
6. 或者将叶条至于培养皿中加入酶液放入真空干燥箱里，在黑暗中消化3个小时，此步需要根据你自己的实验经验，通常会延长孵育16-18h。
（此时可配制PEG4000溶液，200和1000 ul枪头去尖使操作时吸打缓和。
）（此时预冷一定量W5溶液）
7. 显微镜下检查溶液中的原生质体，拟南芥叶肉原生质体大小大约30-50 um。
8. 在过滤除去未溶解的叶片前用等量的W5溶液稀释含有原生质体的酶液。
9. 先用W5溶液润湿35-75 um的尼龙膜或60-100目筛子，然后用它过滤含有原生质体的酶解液。
10. 用30毫升的圆底离心管100g，1-2分钟离心沉淀原生质体，如果回收率低可以提高转速或是加入CaCl2（50mM）。
尽量去除上清然后用10ml 冰上预冷的W5溶液轻柔重悬原生质体(电转化用预冷的W1)终浓度为1-2 x 105/ml。
11. 在冰上静至原生质体30分钟。
(在有些实验中原生质体在使用前可以在室温终保存)
以下操作在室温23℃下进行
12. 100g离心1-3分钟使原生质体沉淀在管底。
在不碰触原生质体沉淀的情况下尽量去除W5溶液。
然后用适量MMG溶液（1m）重悬原生质体，使之最终浓度在2X105个/ml。
13. 加入10 ul DNA（10-20微克约5kb的质粒DNA）至2ml离心管中。
14. 加入100 ul原生质体（2x104个），轻柔混合。
15. 加入110 ul PEG/Ca溶液，轻柔拍打离心管完全混合（每次大约可以转化6-10个样品）。
16. 诱导转化混合物5-15分钟（转化时间视实验情况而定，要表达量更高也许需要更高转化时间）。
17. 室温下用440 ul W5溶液稀释转化混合液，然后轻柔颠倒摇动离心管使之混合完好以终止转化反应。
18. 室温下用台式离心机100g离心1-3分钟然后去除上清，将原生质体轻轻吹打稀释至100ul。
再加入1ml W5溶液悬浮清洗一次，100g离心两分钟去上清。
19. 用1ml WI或者W5溶液轻柔重悬原生质体于六孔组织培养皿中。
20. 室温下（20-25℃）诱导原生质体18小时以上。
21. 激光共聚焦显微镜下观察GFP标签表达。
（以上实验可以根据自己实验情况适当调整）。