PEG介导法制备拟南芥原生质体及瞬时表达方法

采用PEG介导拟南芥叶片原生质体瞬时表达法。具体方法如下：

1）在MS培养基上用无菌牙签点种拟南芥种子，萌发后待根长至1-3厘米（2周左右），移栽到营养土:蛭石为1:1的培养土中，置于培养箱，温度22℃，光照16h，湿度70%，培养2-3周；

2）配制酶解液，选10ml酶解体系，置于90mm培养皿中；

3）在长势良好且未抽薹的拟南芥植株上选取鲜嫩叶片10-15片，用洁净的手术刀在培养皿的盖子上将叶片切成1mm宽的细条；

4）将切好的细条均匀铺在含酶解液的培养皿中，可以一边切一边从植株上取；

5）将酶解液和细叶条真空抽滤30 min；

6）将培养皿取出，静置在黑暗中，23℃，酶解3小时；

7）酶解液过100-200目的筛子，将过滤后的绿色混合物置于2.0 ml离心管中，常温，100 g离心1 min；

8）弃上清，沉淀用冰冷的W5溶液轻柔洗涤，4℃，100 g，离心1min；

9）弃上清，沉淀用冰冷的W5溶液轻柔洗涤，冰上放置30min；

10）23℃，100 g，离心1min，弃上清，每管沉淀用0.5ml MaMg重悬（本步骤及以下操作均在23℃）；

11）取约10-20ug质粒于2.0 ml EP管中，加100ul 制备好的原生质体，用剪去前端的200ul 枪头轻柔混匀；

12）加入110ul PEG/Ca溶液，轻柔混匀，23℃静置5-30min；

13）加入800 ul W5 溶液，轻柔的颠倒混匀，23℃，100 g，离心1min；

14）弃上清，加100ul W5，混匀，再次再加100ul W5，混匀；

15）上述混合液体置于恒温加热器中，23℃，避光，孵育6-18小时。

16）荧光观察，观察之前轻柔混匀，吸取观察物所用的枪头必须剪去前端。