拟南芥原生质体制备转化操作

10 5 mM β-Mercaptoethanol
1ml 75mM β-Mercaptoethanol 母液
11 用 0.45μm 滤膜过滤后使用
过滤
2. PEG4000 溶液（一次配置可以保存五天，但是最好现用现配，每个样品需 100μl PEG4000 溶液，可根据实验样品量调整溶液 配置总量）
5. WI 溶液
WI(200ml)
0.5M mannitol
mannitol
18.217g
4mM MES,pH5.7 20mM KCl
MES KCl 高温高压灭菌，室温保存。
0.3g 0.12g
实验步骤
1. 土培室播种种植拟南芥。 2. 生长良好情况下在未开花前用于取材叶片制备原生质体。 3. 剪取中部生长良好的叶片用刀片切成 0.5 -1 mm 宽的叶条。 4. 将切好叶条掷入预先配置好的酶解液中（每 5-10 ml 酶解液大约需 10-20 片叶子）。并用镊子帮助使叶子完全浸入酶解液。 5. 用真空泵于黑暗中抽 30 分钟。（此时可配制 PEG4000 溶液，200 和 1000 ul 枪头去尖使操作时吸打缓和。） 6. 在室温中无须摇动继续黑暗条件下酶解至少 3 个小时。当酶解液变绿时轻轻摇晃培养皿促使原生质体释放出来。（此时预冷一定量 W5 溶液） 7. 显微镜下检查溶液中的原生质体，拟南芥叶肉原生质体大小大约 30-50 um。 8. 在过滤除去未溶解的叶片前用等量的 W5 溶液稀释含有原生质体的酶液。 9. 先用 W5 溶液润湿 35-75 um 的尼龙膜或 60-100 目筛子，然后用它过滤含有原生质体的酶解液。 10. 用 30 毫升的圆底离心管 100g，1-2 分钟离心沉淀原生质体。尽量去除上清然后用 10ml 冰上预冷的 W5 溶液轻柔重悬原生质体。 11. 在冰上静至原生质体 30 分钟。 以下操作在室温 23℃下进行 12. 100g 离心八至十分钟使原生质体沉淀在管底。在不碰触原生质体沉淀的情况下尽量去除 W5 溶液。然后用适量 MMG 溶液（1m）重 悬原生质体，使之最终浓度在 2X105 个/ml。 13. 加入 10 ul DNA（10-20 微克约 5-10kb 的质粒 DNA）至 2ml 离心管中。 14. 加入 100 ul 原生质体（2x104 个），轻柔混合。 15. 加入 110 ul PEG 溶液，轻柔拍打离心管完全混合（每次大约可以转化 6-10 个样品）。 16. 诱导转化混合物 5-15 分钟（转化时间视实验情况而定，要表达量更高也许需要更高转化时间）。 17. 室温下用 400-440 ul W5 溶液稀释转化混合液，然后轻柔颠倒摇动离心管使之混合完好以终止转化反应。 18. 室温下用台式离心机 100g 离心 2 分钟然后去除上清。再加入 1ml W5 溶液悬浮清洗一次，100g 离心两分钟去上清。 19. 用 1ml WI 溶液轻柔重悬原生质体于多孔组织培养皿中。 20. 室温下（20-25℃）诱导原生质体 18 小时以上。 21. 激光共聚焦显微镜下观察 GFP 标签表达。 （以上实验可以根据自己实验情况适当调整）
0.9g
0.03﹪ MES
MES
0.3g
pH to 5.8 with KOH，高温高压灭菌 20 分钟，室温保存。
4. MMG 溶液
MaMg 溶液（500ml）
15mM MgCl2 0.1﹪MES
MgCl MES
0.71g 0.5g
0.4 M mannitol
Mannitol
36.5g
用 KOH 调 pH 5.6，高温高压灭菌 20 分钟，室温保存。
1.09g 干粉
4 20mM KCl
1 ml 0.3 M KCl 母液
5 20mM MES,pH5.7
1 ml 0.3 M MES,pH5.7 母液
6
加入 10ml 水
7 55℃水浴加热 10 分钟，冷却至室温后加入以下试剂
8 10mM CaCl
1 ml 0.15M CaCl2
9 0.1﹪ BSA
1 ml 1.5﹪BSA（4℃保存）
(注：以 10 枪/3 mg 计算，具体实验可按比例进行换算，无水乙醇清洗处理好的金粉可继续用无水乙醇中-20℃长时间保存，实验中金粉沾 壁时，最好用超声波处理，不进行无菌培养的材料可以不需要严格的无菌操作)
3) DNA 包裹金粉微粒(具体实验可按比例进行以下操作) a. 取 50ul 金粉悬浮液(已分装好)，在连续涡旋振荡下按顺序加入 5ul 质粒 DNA (1ug/ul) 50 X12.5 M CaCl2 20 ul0.1 M 亚精胺 b. 涡旋振荡 3 min； c. 室温下离心 10，000 rpm 10 sec，尽可能去净上清； d. 加入 250ul 无水乙醇，涡旋振荡 1-2 min； e. 室温下离心 10，000 rpm 10 sec，尽可能去净上清； f. 加入 60ul 无水乙醇(可进行 4-8 次轰击)。
实验材料
洋葱内表皮
实验步骤
1. 瞬时表达载体构建
2. 基因枪轰击洋葱表皮观察 GFP 瞬时表达 1) 实验材料准备
撕取洋葱内表皮，置于高渗培养液(MS 无机盐、40g/L 甘露醇)中，室温 100 rpm 处理 4 hours；然后转入高渗固体培养基(MS 无机盐、40g/L 甘露醇、0.7% agar)。
4) 基因枪轰击操作(无菌条件下进行) a. 超净台紫外灯灭菌 20min； b. 载体膜、可裂膜、阻拦网等事先置于 70%乙醇中 1 min，灭菌滤纸上自然风干；将气瓶调节压力到 1300psi； c. 取 8-9ul 已用 DNA 包裹好的微粒悬浮液加到微粒载体膜中央，稍微晾干后马上进行轰击； d. 将可裂膜、阻拦网、涂有微粒载体膜安装进固体装置中，射击参数为：轰击微粒运行距离为 12cm，压力 1110psi，真空度 25mmHg； e. 轰击结束后的材料，转移到等渗培养基(MS 培养基)中培养一天一夜； f. 使用激光共聚焦显微镜 488nm 波长激发下，观察 GFP 的表达。
主要试剂 1. 纤维素酶解液：
试剂
拟南芥原生质体制备转化操作 15ml 酶液体系
1 1-1.5﹪ Cellulase R10 (YaKult Honsha) 0.225g 干粉
2 0.2-0.4﹪ Mecerozyme R10 (YaKult Honsha) 0.045g 干粉
3 0.4M mannitol
2) 金粉准备 a. 称取 60 mg 金粉放入 1.5 ml Ep 管(最好为烷硅化的进口管，减少金粉沾壁)； b. 加入 1 ml 的无水乙醇，涡旋振荡 1-2 min； c. 冰上静置 5 min 后，10，000 rpm 离心 1 min，去上清； d. 重复 a，b 步骤重新清洗金粉三次； e. 室温，10，000 rpm 离心 1 min，去上清； f. 加入 1 ml 无菌去离子水，涡旋振荡 1-2 min，冰上静置 5 min； g. 室温，10，000 rpm.离心 1 min，去上清； h. 重复 g 步聚两次； i. 加入 1 ml 无菌去离子水，按 50ul 每份分装到己灭菌的 1.5-ml Ep 管中备用(分装时应在无菌条件下边涡旋振荡，以保证分装均匀)
PEG4000
1g
水
0.75ml
0.8 Mannitol
0.625ml
1 M CaCl2
0.25ml
约 1.2ml
3. W5 溶液
W5（1000ml）Biblioteka Baidu
154mM NaCl
NaCl
9g
125mM CaCl2 5mM KCl
CaCl2.H2O KCl
18.4g 0.37g
5 mM glucose
glucose
采用基因枪轰击洋葱表皮观察了 GFP 的瞬时表达。
主要试剂
高渗培养液(MS 无机盐、40g/L 甘露醇)，高渗固体培养基(MS 无机盐、40g/L 甘露醇、0.7% agar)，无水乙醇，无菌去离子水，12.5 M CaCl2， 0.1 M 亚精胺，等渗培养基(MS 培养基)
主要设备
高速离心机，1.5 ml Ep 管，涡旋器，超净台，基因枪，气瓶，激光共聚焦显微镜