原生质体制备

原生质体的制备：

1、选取3-4周长势良好的植株的展开叶片（通常选取第5~7片真叶）。

2、用新的锋利的刀子从叶片的中部切0.5-1 mm叶条，比较理想的情况下，每克新鲜叶片中大约含有107个原生质体（大约100-150个叶条在5-10 ml酶溶液中消化）。对于常规实验，10-20个叶条消化在5-10 ml酶溶液中将得到0.5-1×106个原生质体，足够25-100个样品使用。

3、快速而温柔的转移叶条到准备好的酶溶液中（10-20叶条在5-10 ml酶液中），用平头镊子将叶条完全淹没。

4、用真空泵将叶条在黑暗中真空30 min。

5、室温下在黑暗中至少消化3 h（继续消化，不要摇晃）。经过轻微转动后酶溶液应该变成绿色，这表明原生质体已经被释放。

6、用显微镜检查原生质体的释放（拟南芥叶肉的原生质体的大小大约为30-50μm）。

7、用等体积的W5溶液稀释酶溶液，通过过滤去除没有消化的叶片组织。

8、用水洗去75 μm尼龙过滤器中的酒精（通常浸泡在95%乙醇中）并去除过量的水，用W5溶液润洗过滤器后过滤原生质体。

9、将原生质体溶液转移到30 mL圆底离心管中，100×g离心5 min，尽可能的去除上清液。

10、用计数板进行细胞计数，每2×105个原生质体加入1 mL W5溶液，在冰，上静置30 min。

11、室温下沉降原生质体15 min，去除W5溶液，每2×105个原生质体加入1 mL MMG溶液重悬浮。

12、在2 mL离心管中分别加入10 mL DNA（5-10 kb的质粒DNA 10-20 mg）和100 mL原生质体（2×104个原生质体细胞），轻轻混匀。

13、加入110 mL PEG溶液，轻弹试管完全混匀。

14、室温下孵育转染混合物15 min（反应5 min足够）。

15、室温下，用400-440 mL W5溶液稀释转染混合物，轻轻摇动或倒置离心管混匀来停止转染过程。

16、室温下，100×g离心2 min，去除上清液。

17、在六孔板中，每孔用1 mL WI溶液重悬浮原生质体。

18、室温下（20-25℃）孵育原生质体一段时间。

19、重悬浮，通过100×g离心2 min收获原生质体。

20、去除上清液并观察GFP成像。