原生质体制备
原生质体的制备
原生质体的制备一、原生质体是什么呢？嗨，小伙伴们！今天咱们来唠唠原生质体的制备。
原生质体啊，就像是细胞的一个小核心部分，它把细胞壁给去掉了，只剩下细胞膜包裹着里面的细胞质和细胞核这些东西呢。
想象一下，就好像给细胞做了个小手术，把外面那层“衣服”（细胞壁）脱掉啦。
这原生质体在很多科学研究里可都是超级重要的呢。
二、原生质体的制备原料要制备原生质体，咱们得先选好原料呀。
一般呢，植物细胞是比较常见的制备原生质体的原料。
不过呢，这植物细胞也不是随便选的哦。
得找那些细胞状态比较好的，就像是挑水果一样，要挑那种新鲜又健康的。
比如说一些嫩叶细胞就比较合适，它们的细胞壁相对薄一些，就比较好处理啦。
当然啦，除了植物细胞，微生物细胞有时候也能用来制备原生质体，不过这就更复杂一些啦。
三、原生质体的制备方法那具体怎么制备原生质体呢？这可有点小复杂呢。
首先得有一种东西能把细胞壁给溶解掉，这个东西就叫酶啦。
就像是用魔法药水把细胞壁这个小城堡的城墙给融化掉一样。
一般会用到纤维素酶和果胶酶，这两种酶就像是一对小搭档，纤维素酶负责分解纤维素，果胶酶负责分解果胶，这样细胞壁就慢慢消失啦。
然后呢，我们还得控制好环境条件。
温度得刚刚好，不能太热也不能太冷，就像我们人感觉最舒服的温度那样，大概25℃到30℃就挺合适的。
还有溶液的酸碱度也很重要呢，pH值一般在5.5到6.5左右比较好。
要是这些条件没控制好，那原生质体可能就制备不出来啦，或者质量不好。
四、原生质体的分离当细胞壁被溶解掉之后呢，原生质体就和其他的细胞碎片混在一起啦，这时候就得把原生质体给分离出来。
可以用过滤的方法，就像我们泡茶的时候用滤网把茶叶渣给过滤掉一样。
用那种很细的滤网，把那些大的细胞碎片给挡住，让原生质体流过去。
还有一种方法就是离心啦，把混合液放在离心机里转一转，原生质体就会因为重量的不同和其他的东西分开啦。
五、原生质体的纯化分离出来的原生质体可能还不是特别纯呢，里面可能还混着一些酶或者其他的杂质。
原生质体制备
拟南芥原生质体制备转化方法选取开花前生长良好情况的拟南芥（Columbia型）叶片，用刀片切成0.5-1 mm宽的叶条；浸于配置好的酶解液中（每5-10 mL酶解液约10-20片叶子）；暗箱抽真空，30 min；转移至室温，继续黑暗酶解3-5 h；当酶解液变绿时轻轻摇晃培养皿促使原生质体释放；加入等量的W5溶液稀释酶解液；用60-100目筛子（W5溶液润湿）过滤酶解液；将滤液转移至30 mL eppendorf管，500-700 g离心1-2 min，弃上清；加入10 mL预冷的W5溶液轻柔重悬原生质体；放于冰上静置30 min；保持室温在23℃以下；500 g离心8-10 min，弃上清；加入1 mL MMG溶液重悬原生质体（使其终浓度约在2×105个/mL）；即得到原生质体溶液。
用移液器吸取100 L的以上原生质体溶液于1.5 mL eppendorf管，加入10L DNA（10-20 g的质粒DNA），轻柔混合后，加入110 L PEG溶液，轻柔拍打eppendorf管使其混合完全；室温下诱导转化5-15 min；加入400-440 L W5溶液稀释转化混合液，轻柔颠倒，使之混合完好以终止转化反应；500 g离心2 min，弃上清；加入1 mL W5溶液悬浮清洗，500 g 离心2 min，弃上清；再用1 mL WI溶液轻柔重悬原生质体；室温（20-25℃）下，诱导载体表达18小时以上。
相关溶液配制PEG4000溶液（现用现配）组分用量PEG4000 1 g1 M CaCl20.25 mL0.8甘露醇0.625 mL水0.75 mL纤维素酶解液试剂15 mL酶液体系1-1.5 % Cellulase R10 (YaKult Honsha) 0.225 g 纤维素酶0.2-0.4 % Mecerozyme R10 (YaKult Honsha) 0.045 g 果胶酶0.4 M 甘露醇 1.09 g甘露醇干粉20 mM KCl 1 mL 0.3 M KCl20 mM MES, pH5.7 1 mL 0.3 M MES，pH5.7加水10 mL55℃水浴加热10 min，冷却至室温后加入以下试剂10 mM CaCl2 1 mL 0.15 M CaCl20.1% BSA 1 mL 1.5 % BSA5 mM β-巯基乙醇1mL 75 mM β-巯基乙醇用0.45 m滤膜过滤后即可使用。
一株内生真菌的原生质体制备及再生过程研究
一株内生真菌的原生质体制备及再生过程研究
材料准备：
内生真菌菌株
无菌工作台和器具（如培养皿、显微镜片、移液器等）无菌培养基（如琼脂、乳糖酸钠琼脂培养基等）
无菌培养液（如培养基溶液）
去离子水或无菌PBS缓冲液
培养基制备：
根据内生真菌的要求配制适宜的无菌培养基。
煮沸溶液中加入琼脂，并搅拌至溶解。
转移至培养器并加盖，进行高压灭菌。
菌种处理：
在无菌条件下，将内生真菌分离出来。
用无菌培养液或去离子水洗涤菌株，去除杂质。
原生质体制备：
将清洗后的菌株转移到含有少量无菌培养液的培养皿中。
用显微镜检查，确保菌株没有受到污染。
在无菌条件下，用移液器将菌株转移到新的培养皿中。
将培养皿置于振荡器中，以帮助分离真菌的原生质体。
过一段时间后，观察原生质体的形成情况。
原生质体再生：
将形成的原生质体转移到含有适宜培养基的培养皿中。
在适宜的温度（一般为25-30摄氏度）下，进行培养。
定期观察并记录原生质体再生的过程。
根据需要，可以进行进一步的培养和分离。
生物药物综合实验----植物原生质体的制备
实验原理
植物原生质体是指包在植物细胞壁内的生活物质， 植物原生质体是指包在植物细胞壁内的生活物质， 可通过混合酶液消化细胞壁而获得。 可通过混合酶液消化细胞壁而获得 。 原生质体经适宜的培 养能合成新壁，并进行细胞分裂， 养能合成新壁 ， 并进行细胞分裂 ， 经特殊诱导可生成完整 植株。 除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞”，是 植株。 除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞” 开展基础研究的理想材料。 开展基础研究的理想材料 。 其中酶解法分离原生质体是一 个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要由纤维素、 个常用的技术 ， 其原理是植物细胞壁主要由纤维素 、 半纤 维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、 维素和果胶质组成 ， 因而使用纤维素酶 、 半纤维素酶和果 胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁。 胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁。
思考题名
1、简述植物原生质体制备的方法步骤； 简述植物原生质体制备的方法步骤； 按镜下观察绘制原生质体。 2、按镜下观察绘制原生质体。
实验结果
注意事项
1、从理论上讲，植物体的任何一部分都可以通过酶解作 从理论上讲， 用去除细胞壁而得到原生质体。但在实际操作中， 用去除细胞壁而得到原生质体。但在实际操作中，只有 幼嫩的组织才能完成去壁的过程。所以， 幼嫩的组织才能完成去壁的过程。所以，为了制备健康 的原生质体，一般选用根尖、茎尖、 的原生质体，一般选用根尖、茎尖、嫩叶及对数生长期 的愈伤组织为材料， 的愈伤组织为材料，一旦细胞具有木质化或次生加厚的 外壁，则不能被酶降解。因此， 外壁，则不能被酶降解。因此，取材成为实验成功与否 的首要问题。 的首要问题。 2、在离心过程中一定要注意转速。 在离心过程中一定要注意转速。
实验方法
1.材料称取与质壁分离 材料称取与质壁分离 称取0.5g材料，撕去叶下表皮，先切成大块， 0.5g材料 称取0.5g材料，撕去叶下表皮，先切成大块，蒸馏水 冲洗4 加入12%甘露醇，质壁分离0.5h 12%甘露醇 0.5h， 冲洗4-5次。加入12%甘露醇，质壁分离0.5h，滤去甘露醇 将材料用镊子夹取转入放有滤纸的培养皿中， ，将材料用镊子夹取转入放有滤纸的培养皿中，吸干叶片 表面水分，将材料切成0.5cm2 0.5cm2小块备用 表面水分，将材料切成0.5cm2小块备用
原生质体制备的方法
原生质体制备的方法嘿，朋友们！今天咱就来唠唠原生质体制备的那些事儿。
你想想看啊，原生质体就像是一个小小的神秘世界，等着我们去探索和解锁呢！要制备它呀，就好像是一场精心策划的冒险。
咱先得选好材料，这就好比是要踏上征途得先选好一匹好马呀！不同的材料就像是不同性格的马，各有各的特点和脾气。
选对了，后面的路就好走多啦。
然后呢，就是处理环节啦。
这可得小心翼翼的，就跟雕刻一件艺术品似的，不能太用力也不能太轻了。
得掌握好那个度，不然可就前功尽弃喽！你说要是不小心给弄砸了，那得多懊恼呀！接着就是酶解啦。
这酶就像是一把神奇的钥匙，能打开原生质体这个神秘世界的大门。
可要选对酶哦，不然门打不开，咱不就白忙活啦！在这个过程中，时间和温度都很关键呢，就好像煮汤一样，火候得把握好。
等酶解完了，就得过滤啦。
这就好像是把沙子和金子分开，要把我们想要的原生质体给筛选出来。
这一步也不能马虎呀，得仔仔细细的。
然后呢，就是洗涤啦。
把那些杂质都洗掉，让原生质体干干净净的。
这就像是给宝贝洗澡一样，得温柔点，可别把它弄疼了。
最后呀，就是培养啦。
给原生质体创造一个舒适的环境，让它能好好地生长发育。
这就像是给小树苗找了个好地方种下去，得精心呵护着。
哎呀呀，制备原生质体可不是一件容易的事儿呀，但只要咱一步一步认真去做，就一定能成功！你说是不是？这过程虽然有点麻烦，但当你看到那一个个可爱的原生质体的时候，你就会觉得一切都值得啦！就像你辛苦种的花终于开了一样，那种喜悦呀，真的是没法形容！所以呀，别害怕困难，大胆去尝试吧！让我们一起在原生质体制备的世界里畅游，去发现更多的惊喜和奥秘！。
李春强PEG原生质体制备
尖孢镰刀菌PEG转化材料与方法质粒：pCT74，含有真菌Pyrenophora triticirepentis的ToxA启动子和潮霉素B磷酸转移酶基因（hygr）。
培养基：LB培养基：酵母提取物5 g、蛋白胨10 g、NaCl 10 g、琼脂15 g、水1000 mL、pH 7.0 ；PDB培养基：马铃薯200 g、蔗糖20 g，水1000 mL；PDA培养基：马铃薯200 g、蔗糖20 g、琼脂粉l5 g、水1000 mL；再生半固体培养基：马铃薯200 g、山梨醇182 g、琼脂9 g、水1000 mL。
酶制剂：崩溃酶 (Drislase，购自Sigma公司)，溶壁酶 (Lysing Enzyme，购自广东微生物所)。
(50)裂解液：0/20 mg·mL-1崩溃酶和20 mg·mL-1溶壁酶，酶液用冷的0.8 mol·L-1的NaCl配置，28 ℃，70 r·min-1轻微振动溶解30 min，用0.22 μm的微孔过滤器过滤，除去杂质稳渗剂：0.8 mol·L-1 NaC1，山梨醇溶液 [STC，含1.2 mol·L-1山梨醇、10 mmol·L-1Tris-HCl (pH 7.5)、50 mmo1·L-1 CaCl2]，PTC溶液 [含40% PEG4000、10mm Tris-HCl (pH 7.5)、50mm CaCl2]抗生素：氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)，潮霉素B(hygromycin B，HmB)。
原生质体制备：（预备实验：50ml离心管中孢子需要多少转才能沉淀下来）从培养皿上挑取少量菌丝于250 mL三角瓶里摇床培养2d（48h）。
三层擦镜纸过滤除去菌丝，获得孢子悬浮液，浓度约为1×107 cfu·mL-1。
(从固体培养平板上挑起菌落，置入灭有无菌蒸馏水的200毫升试剂瓶中（瓶中加玻璃珠），剧烈振荡，把菌块打碎，释放孢子；三层擦镜纸过滤，滤液放在2个菌4个50ml 离心管里，然后离心，把孢子离心下来，倒去一部分无菌水，对孢子悬浮液进行浓缩) 取1-2 mL孢子悬浮液到盛有100 mL PDB培养基的250 mL三角瓶中，28 ℃，120-150 r·min-1摇床培养12-14 h。
原生质体的制备
原生质体的制备
目的要求
掌握植物原生质体的分离制备
技术，观察原生质体的形态。
实验原理
分离原生质体常采用酶解法。其原理是根据由
纤维素酶、果胶酶和半纤维素酶配制而成的溶液对
细胞壁成分的降解作用，而使原生质体释放出来。 原生质体的产率和活力与材料来源、生理状态、酶 液的组成、以及原生质体收集方法有关。酶液通常 需要保持较高的渗透压，以使原生质体在分离前细
胞处于质壁分离状态，分离后不致膨胀破裂。渗透
剂常用甘露醇，山梨醇，葡萄糖或蔗糖。酶液中还 应含一定量的钙离子，来稳定原生质膜。游离出来
的原生质体可用过筛法收集。
实验用品
一、 材料
菠菜 二、器材
显微镜，擦镜纸，剪子，镊子，小平皿，吸管四 支，直式漏斗，300目尼龙网，10ml离心管，载 玻片，盖玻片。
三、试剂 1.洗涤液：甘露醇 0.6 M；CaCl2·2H2O 8 mM
NaH2PO4·H2O 2 Mm，pH 5.6
2.酶液：
实验方法
1、酶液的制备 2、材料准备 3、酶解
4、洗涤
观
察
纯 化 后 的 原 生 质 体
胚性愈伤组织亦是原生 质体分离的主要材料
思考题1、何为原生质体 Nhomakorabea2、分离得到的原生质体可有哪些用途？
3、为什么酶解材料时，酶解液要保持较 高的渗透压？
原生质体的制备
原生质体的制备
稳渗剂：0.6 mol/L甘露醇，121 ℃高温高压灭菌20 min后备用。
2%溶壁酶：在无菌操作台中称取溶壁酶（广东省微生物研究所生产），加入灭菌过的稳渗剂（甘露醇0.6 mol/L），最终使酶液浓度达到2%，再用0.22 µm 滤膜过滤除菌待用。
（观察锁状联合）乳酸石炭酸棉蓝染色液：石炭酸10 g，棉蓝0.02 g，甘油20 mL，乳酸10 mL，蒸馏水10 mL，将石炭酸加入蒸馏水中加热融化，之后加入乳酸和甘油，最后加入棉蓝，溶解备用。
原生质体制备
(1)将杏鲍菇菌丝接种于固体PDA培养基中，25℃培养5-7 d。
(2)活化后的菌丝接入液体PDA培养基中，25℃，120 rmp摇床培养5-6 d。
(3)将菌丝球倒入50 mL离心管中，10000 rpm 离心10 min，倒去上清液，再用无菌水、甘露醇各离心清洗一次。
(4)用灭菌滤纸吸干菌丝水分，称取0.2 g 菌丝放入10 ml 离心管中，再加入2 mL 2％浓度的溶壁酶，30℃水浴2-2.5 h，每隔1 h镜检破壁情况。
(5) 加入6mL甘露醇混匀，终止酶解。
800 rpm离心5 min，用移液枪小心转移上清酶液至新的10毫升离心管，再用0.6 mol/L甘露醇离心离心清洗一次（4000 rpm，15 min），液体再生培养基离心清洗一次（4000 rpm，15 min）。
植物原生质体的制备原理
植物原生质体的制备原理
植物原生质体的制备原理是利用生物学方法将植物细胞的质膜和细胞壁打破，使得细胞质与细胞器分离，获得纯净的细胞质。
具体制备原理如下：
1. 选择新鲜的植物组织，例如嫩叶片、根尖等，并将其切碎。
2. 将切碎的组织置于适当的缓冲液中，缓冲液中含有维持细胞渗透压的某些成分，如蔗糖。
3. 经过一定时间的培养，细胞内的质膜和细胞壁会被渗透液逐渐分解，从而使细胞质暴露在外。
4. 使用过滤纸或细孔滤网将悬浊液过滤，以去除细胞壁碎片和其他杂质。
5. 对滤液进行离心，以分离更纯净的细胞质。
6. 最后，将分离得到的细胞质保存在低温条件下，或进行后续的实验操作。
通过上述步骤，就可以制备得到植物原生质体，供后续的生物学研究和实验使用。
原生质体制备的原理
原生质体制备的原理原生质体啊，简单来说，就是把植物或者微生物细胞外面那层细胞壁给去掉之后剩下的部分。
那为啥要去掉细胞壁来制备原生质体呢？这就像给细胞做了个“脱壳手术”，让细胞变得更“赤裸裸”，这样就方便我们对细胞进行各种研究啦。
对于植物细胞来说，细胞壁是由纤维素、半纤维素和果胶等物质组成的。
就像一个坚固的小房子，把细胞里的原生质给围在里面。
那怎么把这“小房子”拆掉呢？这就用到了一些特殊的酶。
比如说纤维素酶，它就像一个小小的拆迁队队员，专门针对细胞壁里的纤维素，把纤维素的化学键给切断。
还有果胶酶呢，它也没闲着，负责把果胶分解掉。
这俩酶就这么齐心协力，一点一点地把细胞壁给瓦解掉，原生质体就被释放出来啦。
微生物细胞也类似哦。
不过微生物的细胞壁成分和植物不太一样。
像细菌的细胞壁有肽聚糖，这时候就需要用溶菌酶这样的酶来对付它。
溶菌酶就像一个精准的小剪刀，找到肽聚糖里合适的地方，“咔嚓”一下剪断化学键，细胞壁就开始破掉啦。
原生质体的制备啊，还有很多小讲究呢。
比如说酶的浓度很重要。
如果酶的浓度太低，就像拆迁队的人手不够，拆细胞壁拆得慢吞吞的，效率特别低。
可要是酶的浓度太高呢，就有点像一群莽撞的工人，可能会对原生质体本身造成伤害，把原生质体里面的一些重要结构也给破坏掉了，这可就不好了。
温度也是个关键因素。
就像人干活的时候，温度合适干活才舒服。
对于酶来说也是一样的，不同的酶有它最适宜的工作温度。
在这个温度下，酶的活性最高，拆细胞壁的速度最快，效果也最好。
要是温度不合适，酶可能就会偷懒，不好好干活啦。
而且啊，制备原生质体的时候，还得注意渗透压。
细胞里面是有一定渗透压的，当把细胞壁去掉之后，如果外面的渗透压不合适，原生质体就会像一个被捏扁或者胀大的气球一样。
要是外面的溶液浓度太高，原生质体里的水就会被吸出去，原生质体就会皱缩起来；要是外面溶液浓度太低，水就会大量涌进原生质体，原生质体就可能会胀破。
所以得找到合适的渗透压条件，让原生质体能够舒舒服服地待着。
真菌原生质体制备
真菌原生质体制备真菌原生质体是去除了细胞壁的真菌细胞，它在真菌的遗传研究、细胞融合以及基因工程等领域都有着重要的应用。
制备真菌原生质体是一项关键的技术，需要一系列精细的操作和合适的条件。
要制备真菌原生质体，首先得选择合适的真菌菌株。
不同的真菌菌株其细胞壁的组成和结构可能有所差异，这会影响到后续的原生质体制备效果。
一般来说，选取那些生长旺盛、生理状态良好的菌株会更有利于操作。
在准备工作中，培养基的选择也至关重要。
要为真菌提供适宜的生长环境，确保其能良好生长和繁殖。
同时，还需要准备好各种实验器具，如离心管、移液器、显微镜等等，并确保这些器具经过严格的消毒和灭菌处理，以防止杂菌污染影响实验结果。
接下来就是制备原生质体的关键步骤——酶解。
真菌的细胞壁主要由几丁质、葡聚糖等成分组成，因此需要选择合适的酶来分解这些成分。
常用的酶包括纤维素酶、蜗牛酶、溶菌酶等。
酶的浓度、配比以及作用时间都会对原生质体的产量和质量产生影响。
通常需要通过预实验来摸索最佳的酶解条件。
在酶解过程中，反应条件的控制也非常重要。
比如温度，一般会根据所用酶的最适温度来设定，以保证酶的活性和反应效率。
同时，反应体系的 pH 值也需要严格调控，因为 pH 值会影响酶的活性和真菌细胞壁的稳定性。
酶解完成后，需要通过过滤或者离心等方法来收集原生质体。
过滤可以去除未完全酶解的菌丝和杂质，离心则能将原生质体从酶解液中沉淀下来。
在离心时，要注意选择合适的转速和时间，避免对原生质体造成损伤。
收集到的原生质体还需要进行洗涤和纯化。
洗涤可以去除残留的酶和其他杂质，纯化则能提高原生质体的纯度。
常用的纯化方法有蔗糖梯度离心法，利用原生质体和杂质在蔗糖梯度中的不同沉降速度来实现分离。
在整个制备过程中，还需要时刻关注原生质体的活力和状态。
可以通过显微镜观察原生质体的形态、大小和完整性，也可以采用染色法来检测原生质体的活力。
比如使用台盼蓝染色，活的原生质体不能被染色，而死的则会被染成蓝色。
细菌原生质体的制备
细菌原生质体的制备要求：1、写出完整的原生质体的制备的实验操作步骤2、写出分离培养基及相关试剂所需的量、仪器和器皿所需的数量。
说明：通过实验一获得出发菌（细菌）之后，第二周再对该菌进行诱变，第三周再进行该菌的碳源谱、及抗药性测定（链霉素或青霉素），第四周再制备原生质体。
培养基与试剂 (1) 分离培养基采用牛肉膏蛋白胨固体培养基加0.2%可溶性淀粉 即牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、可溶性淀粉2g溶于1000mL蒸馏水中 再加入15g琼脂粉 pH调至7.2 121℃灭菌15min 待冷却至50℃左右时 于超净工作台倒平板。
注: 先将可溶性淀粉加少量蒸馏水调成糊状 再加到溶化好的培养基中 调匀; (2) 分离培养基液体培养基采用牛肉膏蛋白胨固体培养基加0.2%可溶性淀粉,即牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、可溶性淀粉2g溶于1000mL蒸馏水中 pH调至7.2,121℃灭菌15min。
(3) 检测试剂, 路戈氏碘液, 碘片1g ,碘化钾2g, 蒸馏水300mL。
配制方法: 先用少量35mL蒸馏水溶解碘化钾 ,再加入碘片 ,待碘片完全溶解后 ,加水稀释至300mL于棕色瓶内备用.实验方法: 1. 微生物的分离; 用梯度稀释法来分离淀粉酶产生菌。
取所采的土样5g加入到三角瓶中,加入无菌水45mL,30℃摇床振荡30min制成土壤悬液 ,此时的稀释度为10-1。
另取7支试管 分别记作10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8共8个梯度 每支试管内加入9mL无菌水。
用无菌移液管从三角瓶中吸取1mL土壤悬液加入到10-2试管中混匀, 再从此试管中吸取1mL加入到10-2试管中, 依此类推直至10-7试管。
分别从10-6、10-7、10-8三个稀释度的试管中吸取100uL悬液, 均匀涂布于分离培养基平板上, 于30℃培养36h 等长出菌落后, 将检测试剂卢戈氏碘液加入到平板中, 菌落周围形成水解圈的菌株即是产淀粉酶的菌株, 因淀粉遇碘变蓝色 ,如菌落周围有无色圈说明该菌能分解淀粉。
植物细胞原生质体的制备与融合
植物细胞原生质体的制备与融合。
1、相关概念：（1）原生质体：是指那些已去除全部细胞壁的细胞。
细胞外仅由细胞膜包裹，呈圆形，要在高渗液中才能维持细胞的相对稳定。
此外，在酶解过程中残存少量细胞壁的原生质体称为原生质球或球状体。
（2）原生质体融合：即体细胞杂交。
用人工的方法，把分离的不同品种或不同种的原生质体诱导成融合细胞，再经离体培养诱导分化和再生完整植株的整个过程。
若取材为体细胞，则成为体细胞杂交。
2、原生质体的制备：在植物组织里，原生质体被坚硬的细胞壁包裹着，而且由于果胶质等使细胞相互紧紧粘连在一起。
在愈伤组织中，这种粘连相对松些；在细胞悬浮培养物中，只有存在细胞团的情况下，有轻度的粘连。
如果破除这种粘连作用，即可使细胞分离开来，进一步去除细胞壁，就能使裸露的原生质体游离出来。
游离效率的高低主要与植物材料和酶混合浓的组成有关。
基本程序如下：取材→除菌→酶解（加酶、渗透压稳定剂）→原生质体的收集与纯化→洗涤→原生质体活力的测定。
（1）取材与除菌：原则上植物任何部位的外植体都可成为制备原生质体的材料。
但人们往往对活跃生长的器官和组织更感兴趣。
因为，由此制得的原生质体一般都生活力较强，再生与分生比例较高。
常用的外植体包括：种子根、子叶、下胚轴、胚细胞、花粉母细胞、悬浮培养细胞和嫩叶。
对外植体的除菌要因材而异，悬浮培养细胞一般无需除菌。
对较脏的外植体往往要先用肥皂水清洗再以清水洗2-3次，然后浸入70%酒精消毒后，再放进3%次氯酸钠处理。
最后用无菌水漂洗数次，并用无菌滤纸吸干。
（2）酶解：现以叶片为例说明如何制备植物原生质体。
①配制酶解反应液:反应液应是一种pH值在5.5-5.8的缓冲液，内含纤维素酶0.3%-3.0%以及渗透压稳定剂，细胞膜保护剂和表面活性剂等。
③酶解：除菌绿。
反应液转绿是酶解成功的一项重要指标，说明已有不少原生质体游离在反应液中。
经镜检确认后应及时终止反应，避免脆弱的原生质体受到更多的损害。
真菌原生质体制备技术
真菌原生质体制备技术
1．灭菌物品：
（1）大滤纸:
（2）灭菌针筒（含脱脂棉和玻璃钎维）
（3）脱脂棉
（4）离心管
（5）无菌ddH2O
（6） 0.6M MgSO4
（7）培养基：
A. 等渗培养基（RCM）：麦芽汁1%，酵母膏1%，蛋白胨0.4%，葡萄糖0.4%，pH自然，用0.6M蔗糖配制。
B. 破膜培养基：麦芽汁1%，酵母膏1%，蛋白胨0.4%，葡萄糖0.4%，pH自然，用水配制。
也可以采用含有0.6M蔗糖的PDA作为等渗培养基，破膜培养基不加0.6M蔗糖即可。
（8）溶壁酶酶液：1.5%，用0.6MMgSO4配制，过滤除菌；
（9）培养皿：根据样品个数
2．制备方法：
（1）称取离心管重量并记录；
（2）用接种针挑出菌丝，并用灭菌双蒸水冲洗一次，然后用无菌的0.6M MgSO4冲洗两次，用灭菌的滤纸吸干，放入已知重量的离心管，称重并记录；
（3）计算得到菌丝重量，按0.2（g）：1(mL)加入灭菌酶液，震荡均匀；
（4） 28℃，3~4小时，摇床震荡（轻微），酶解，同时每30min镜检观察原生质体数量；
（5）灭菌注射器（含脱脂棉和玻璃钎维）过滤；
（6）离心：2500rpm,2min
（7）用0.6M MgSO4洗涤沉淀3次；
（8）用用0.6M MgSO4定容至最初的加酶量；
（9）镜检计数；记录；
（10）涂板后再生培养，第7天后每隔1天计数一次。
原生质体制备和转化
将制备好的原生质体溶液3200r/min，4℃离 心10min；
经四层无菌镜头纸过滤，制成孢子浓度约为107个/mL的单 孢子悬浮液
将上述制得的孢子悬浮液每1mL接种于一瓶盛有50mL菌丝 培养基的三角瓶中，于30℃静止培养23~25h
6000r/min，离心10min收集幼嫩的菌丝体 用无菌水洗涤菌丝体，4000r/min，离心5min收集菌丝体
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弃上清，沉淀重悬于预冷的STC溶液中，将原 生质体浓度调整为5×106 ~ 5×107个细胞 /mL；
将约2~5µg质粒DNA(体积不超过10µL)与 100µL米曲霉原生质体置冰上轻轻混匀；
加入25µL PTC溶液，冰浴20min；
加入1 mL PTC溶液，室温放置15min；
最后加入2mL STC溶液，混匀。
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汇报人姓名
培养基成分 高渗溶液（有机/无机）
缓冲液的pH（5.8-7.4） 酶解条件（时间/各种酶的比例）
酶液用高盐还是高渗缓冲液配 擦镜纸收集菌丝体or离心收集菌丝体
双层or单层培养基
高渗缓冲液：
《微生物学实验教程》 周德庆（酵母）
1、接种于液体培养基上培养。
高渗缓冲液：
蔗糖0.5mol/L, MgCl2 10mmol/L,Tris-HCl(pH 7.4) 10mmol/L
2、取培养液10ml，4000r/min离心5min, 弃上清液，用TrisHCl(pH 7.4)、0.5mol/LEDTA、高渗缓冲液各洗涤一次。
原生质体制备试剂
原生质体制备试剂原生质体是一种无细胞壁的细胞结构，广泛存在于植物和动物细胞中。
由于其具有高度可溶性和膜通透性的特性，原生质体常被用于制备各种试剂。
本文将介绍原生质体制备试剂的方法和应用。
一、原生质体制备方法1. 细胞裂解法：将植物或动物组织加入裂解缓冲液中，通过机械方法（如超声波破碎、搅拌等）或化学方法（如酶解、酸碱处理等）使细胞壁破裂，释放出原生质体。
2. 离心法：将植物或动物组织进行离心分离，分离出含有原生质体的上清液。
3. 渗透法：通过调节渗透压使细胞膜溶胀，从而释放出原生质体。
4. 超滤法：利用超滤膜对细胞组织进行过滤，将原生质体截留在滤液中。
5. 分离培养法：通过细胞培养技术，将细胞分离培养，使原生质体在培养基中自由生长。
1. 酶活性测定：原生质体中含有多种酶，可以用于测定酶的活性。
例如，通过测定原生质体中过氧化物酶的活性，可以评估细胞氧化应激水平。
2. 蛋白质分析：原生质体中富含蛋白质，可以用于蛋白质的纯化和分析。
例如，可以通过原生质体制备试剂提取植物叶片中的叶绿素结合蛋白。
3. 药物筛选：原生质体可以用于药物的筛选和评估。
例如，通过测定原生质体对某种药物的敏感性，可以评估药物的毒性和疗效。
4. 细胞生物学研究：原生质体可以用于细胞生物学研究中的多个方面，如细胞分裂、细胞运动等。
例如，通过观察原生质体在不同条件下的形态变化，可以研究细胞的运动机制。
5. 基因工程：原生质体可以用于基因工程中的多个方面，如基因转染、基因表达等。
例如，可以利用原生质体制备试剂将外源基因导入植物细胞，实现基因的转染。
三、原生质体制备试剂的优势1. 高度可溶性：原生质体中的物质具有高度可溶性，便于提取和分析。
2. 膜通透性：原生质体的细胞膜具有较好的通透性，便于物质的进出。
3. 多功能性：原生质体中含有多种生物大分子，如蛋白质、核酸等，适用于多个领域的研究。
4. 细胞完整性：原生质体制备试剂可以保持细胞的完整性，不会破坏细胞内部结构。
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原生质体的制备：
1、选取3-4周长势良好的植株的展开叶片（通常选取第5~7片真叶）。
2、用新的锋利的刀子从叶片的中部切0.5-1 mm叶条，比较理想的情况下，每克新鲜叶片中大约含有107个原生质体（大约100-150个叶条在5-10 ml酶溶液中消化）。
对于常规实验，10-20个叶条消化在5-10 ml酶溶液中将得到0.5-1×106个原生质体，足够25-100个样品使用。
3、快速而温柔的转移叶条到准备好的酶溶液中（10-20叶条在5-10 ml酶液中），用平头镊子将叶条完全淹没。
4、用真空泵将叶条在黑暗中真空30 min。
5、室温下在黑暗中至少消化3 h（继续消化，不要摇晃）。
经过轻微转动后酶溶液应该变成绿色，这表明原生质体已经被释放。
6、用显微镜检查原生质体的释放（拟南芥叶肉的原生质体的大小大约为30-50μm）。
7、用等体积的W5溶液稀释酶溶液，通过过滤去除没有消化的叶片组织。
8、用水洗去75 μm尼龙过滤器中的酒精（通常浸泡在95%乙醇中）并去除过量的水，用W5溶液润洗过滤器后过滤原生质体。
9、将原生质体溶液转移到30 mL圆底离心管中，100×g离心5 min，尽可能的去除上清液。
10、用计数板进行细胞计数，每2×105个原生质体加入1 mL W5溶液，在冰，上静置30 min。
11、室温下沉降原生质体15 min，去除W5溶液，每2×105个原生质体加入1 mL MMG溶液重悬浮。
12、在2 mL离心管中分别加入10 mL DNA（5-10 kb的质粒DNA 10-20 mg）和100 mL原生质体（2×104个原生质体细胞），轻轻混匀。
13、加入110 mL PEG溶液，轻弹试管完全混匀。
14、室温下孵育转染混合物15 min（反应5 min足够）。
15、室温下，用400-440 mL W5溶液稀释转染混合物，轻轻摇动或倒置离心管混匀来停止转染过程。
16、室温下，100×g离心2 min，去除上清液。
17、在六孔板中，每孔用1 mL WI溶液重悬浮原生质体。
18、室温下（20-25℃）孵育原生质体一段时间。
19、重悬浮，通过100×g离心2 min收获原生质体。
20、去除上清液并观察GFP成像。