水稻原生质体分离及转化

水稻原生质体分离及转化

作者：植物逆境与光合实验室|发表日期：2014-04-11

实验目的：用于做荧光定位、BIFC、Co-IP实验

实验材料和试剂：

生长8-10 d的水稻组培幼苗、酶解液、mmg溶液、PEG-CaCl2溶液、W5溶液、5 mL移液枪、5 mL枪头、12 mL BD管、1.5 mL EP管、100 mL锥形瓶、圆形培养皿、滤网（20 mm×20 mm）、离心机、摇床等。

溶液的配制：

母液的配制：

1、0.2 M MES(pH 5.7)

2、0.8 M Mannitol(甘露醇)

3、1 M CaCl2

4、2 M KCl

5、2 M MgCl2

6、10% BSA

[Fluka PEG 4000 81240]

以下如有上述母液，则都是使用的母液

酶解液：20 mL ×2

MES 0.5

mL 1 mL

Mannitol 7.5

mL 15 mL

Cellucose（纤维素酶）0.15

g 0.3 g

Macerozyme（离析酶）0.075

g 0.15 g

ddH2O 1.8

mL 3.6 mL

55℃10 min

冷却至RT后加入200 uL CaCl2

加入200 uL 10% BSA

Mmg: 20 mL ×2 MES 0.2

mL 0.4 mL

Mannitol 5

mL 10 mL

MgCl2 0.075

mL 0.15 mL

ddH2O 4.725

mL 9.45 mL

PEG-CaCl2: 20 mL ×2

Mannitol 2.5

mL 5 mL

CaCl2 1

mL 2 mL

PEG4000 4

g 8 g

ddH2O 3

mL 6 mL

W5: 200 mL

MES 2 mL

NaCl 1.8 g

CaCl2•2H2O 3.67525 g

KCl 0.5 mL

ddH2O 197.5 mL

具体实验步骤：

1、从培养基上切取培养8-10 d的水稻幼苗，去除幼苗外层包裹的叶子。

2、用干净的刀片将幼苗切成很细的粉末状碎片（越细越好，有利于酶解），大概切到水稻幼苗茎秆的中间段即可（剩余未切割的部分可以扔掉）。

3、将酶解液（约20 mL）倒入100 mL锥形瓶中，然后轻轻地将细碎的幼苗倒入锥形瓶中（注意不要撒到锥形瓶壁上），然后轻轻地摇晃，使其均匀分散。

4、黑暗条件下（用不透光的黑色塑料袋包裹即可，下同）置于摇床中（60 rpm/ min）摇晃5 h，使细胞充分酶解。此时也可以将PEG-CaCl2溶液一同置于摇床上摇晃，使溶质充分溶解。

5、从摇床中取下已经酶解好原生质体的锥形瓶，用手轻轻摇匀后，再用移液枪吸取锥形瓶中已经酶解好的液体，让其经过过滤网（20 mm×20 mm）过滤后流入到BD管中。

6、接着用W5溶液来洗涤锥形瓶中剩余的残渣，然后同样用移液枪将其吸出，经过过滤网后流入到BD管中，此步骤按照需要重复2-3次（尽量收集到更多的原生质体），所需要收集原生质体的BD管数按照需要来决定。

7、收集完后，将含有原生质体的BD管置于离心机中，1200 rpm离心3 min。

8、去掉BD管中的上清后，用W5溶液（约6 mL）洗涤沉淀，然后1200 rpm离心3 min。

9、重复步骤8一到两次。

10、去掉BD管中的上清，再在含有沉淀的BD管中加入mmg（加入的量根据液体的颜色来自行判断），然后将其混匀。

11、Mmg加入完毕并混匀后，可吸取其中少量液体到计数板上，然后置于显微镜下观察（主要是查看原生质体是否完整、浓度是否达到和是否还含有大量的杂质），有时候凭经验而可以省去这一步。

12、接着将BD管中的液体转移到事先已经装有质粒的另外的BD管中（加入的量根据每100 uL原生质体中加入10-20 ug质粒来确定，如果是双转，则每一种质粒都要加入这么多的样，即双倍的质粒），在这里可以转小量GFP对照来测定原生质体的转化效率。

13、再加入等体积（原生质体+质粒）的PEG-CaCl2溶液（溶液比较粘稠，注意慢慢吸取），

轻轻混匀。

14、黑暗条件下静置15 min（让质粒转入原生质体中）。

15、然后加入1-2倍体积的W5溶液（终止反应）。

16、混匀后，1200 rpm离心3 min，倒去上清。

17、在沉淀中加入少量W5(约1 mL)混匀。

18、最后将其吸取倒入事先加有6 mL W5的培养皿(事先经过胎牛血清润洗，以便原生质体均匀分散在培养皿中)中，并混匀。

19、黑暗条件下静置培养16 h（让质粒在原生质体中表达出蛋白）。

20、从黑暗中取出培养的原生质体，待吸去培养皿中一部分清澈的液体后，再用枪头将培养皿中剩余的液体和原生质体打匀，然后用移液枪将其吸取至新的BD管中。

21、接着将BD管中的原生质体分装到1.5 mL的EP管中（分装的管数按需求决定）。

22、此时可在EP管中加入不溶的PGN和Chitin进行处理，处理浓度为200 ug/mL,处理时间为10 min，处理时可上下颠倒摇晃EP管，这能让PGN和Chitin充分处理到原生质体。

23、然后将EP管置于离心机中，12000 rpm，离心1 min。

24、吸去EP管中的上清液，然后迅速将其置于液氮中，最后置于-80 ℃中冻存，待需要使用时再取出。

注意：

1、配制溶液前需配制相关试剂母液，而且需要过滤除菌。

2、溶液配制好后也需要过滤除菌。

3、所用的器具最好是平时专门使用的，防止交叉污染。

4、由于原生质体容易破裂，所以摇晃、打匀和转移原生质体的时候动作必须要轻。