酵母原生质体的制备方法
南阳酵母原生质体制备与再生条件研究
摘 要 ： 究南 阳酵 母原 生 质 体形 成 与 再 生 的最 佳条 件 。获 取原 生 质体 采 用 酶法 ， 生 采 用双 层 高 渗平 板 法 ， 素 重要 性 分析 采 用正 交 研 再 因 试验 。结果 表 明 ： 龄 ｌｈ 以 ２ ％蜗 牛 酶加 ０ ％纤 维 素酶 的混合 酶 液 进行 酶 解 破壁 ， 解 温 度 ３ ￣ 酶 解 时 间 ２ ｈ 以 ０６ ｌＬ 菌 Ｏ， ． ０ ． ５ 酶 ０Ｃ， ．， ． ５ ｍｏ・－蔗 糖做 再 生 培养 基 的 渗 透压 稳 定剂 ， 生 质 体形 成 率 ９ ． ％， 原 １ ０ 再生 率 １ ． ％ 。 进 行 预 处理 ， 试 验 条件 下 ， 南 阳酵 母 原 生质 体形 成 ４ ０５ ６ 不 在 对
Байду номын сангаас
Ｐｒ ｐ ｒ ｔｏ ｎ ｇ ｎ ｒ ｔ ｎ ｏ ｏ ｏ ｌ ｓｓ ｏ ａ ｃ ａ ｏ ｃ ｓ ｅ ｅ Ｂｉ ｅ ｅ ａ ａ ｉ ｎ ａ ｄ Ｒｅ ｅ ｅ ａ ｉ ｆ Ｐｒ ｔ ｐ ａ ｔ ｆ Ｓ ｃ ｈ ｒ ｍｙ ｅ Ｃ ｒ ｒ ａ ｏ
ＷＡ Ｇ Ｙｎ ，ＬＵ Ｃ ａｇｊ ｎｔ Ｈ Ｎ ｅ ｇ ｌｎｍ Ｉ ｕ ｚｅｈ Ｚ Ｎ ｉ — ｉｈ Ｎ ｉｇ Ｉ ｈ ｎ－ｉ ｇ，Ｚ Ａ Ｇ Ｆ ｎ －ｏ ｇ，Ｊ Ｒ －ｈ ｎ ， ＨＡ Ｇ Ｘａ ｘａ ａ ￣ Ａ ｏ
１ ｈ ｔ ｏ ａ ｉ ｍｉ ｇｏ ｈ ｈ ｓ ．Ｅ ｉ ｎ ｔｄ ｅｌ ａ ｌ ｙ ｏ ｉ ｅ ｅ ｚ ｍｅ ｏｕ ｉ ｎ ｏ ．％ ｈ ｌ ａ ｅ ａ ｄ ． ％ ｃ ｌ ｌｓ ａ ３ ａ ｌｇ ｒｔ ｃ ｒ ｗｔ ｐ ａ ｅ ｌ ｈ ｍｉ ａｅ ｃ ｌ ｗ ｌ ｂ ｃ ｍｂ ｎ ｄ ｎ ｙ ｓ ｌ ｔ ｆ ２ ０ ｏ ｅｉ ｓ ｎ ０５ ｃ ｅｌ ａ ｅ ｔ ｕ ３ ￣ ｒ ２ ５ ｉ ｏ ｔ ｐ ｅｒ ａ ｍｅ ｔ ｎ ｕ ｕ ｅ ｏ ｅ ｅ ｅ ａ ｉｎ ｃ ｈ ｒ ｄ ｕ ０ Ｃ ｆ ． ｈ ｗ ｔ ｕ ｒ ｔ ｔ ｎ 。ａ ｄ ｃ ｈ ｒ ｄ ｎ ｒ ｇ ｎ ｒ ｔ ｕ ｕ ｅ ｍｅ ｉｍ ｃ ｎ ａｎ ｎ ． ｌ Ｌ ｓ ｃ ｏ ｅ９ ．０ ｏ ｈ ｅ ｏ ｏ ｔ ｉ ｇ ０ ６ ｍｏ ・ ～ ｕ ｒｓ ， １４ ％ ｐ ｅ ａ ｉ ｒｐ － ｒ ｔ ｎ ｒ ｔ ｆ ｐ ｏ ｏｌ ｓ ｓ ｏ ｔ ｉ ｅ ａｉ ａｅ ｏ ｒ ｔ ｌ ａ ｔ ｗａ ｂ ａｎ ｄ．ａ ｄ ｔ ｅ ｅ ｅ ｅ ａｉｎ ｒ ｔ ｅ ｃ ｅ １ ．６ ｏ ｃ ｓ ｌ ｎ ｈ ｒｇ ｎ ｒ ｔ ａｅ ｒ ａ ｈ ｄ ０ ５ ％．Ｕｎ ｅ ｅｔ ｉ ｏ ｄ ｔ ｎ ，ｖ ｔｌ ｆ ｃｏ ｓ ｉ ｆ ｅ － ｏ ｄ ｒ ｃ ｒａｎ ｃ ｎ ｉ ｏ ｓ ｉ ｌ ｔｒ ｎ ｕ ｎ ｉ ａ ａ ｌ
利用原生质体育种技术获得优良酵母菌设计实验路线
利用原生质体育种技术获得优良酵母菌设计实验路线1. 引言原生质体育种技术是一种用于获得优良酵母菌的重要方法。
本文将探讨如何设计一个实验路线，利用原生质体育种技术获得优良酵母菌。
2. 实验目的本实验的目的是通过原生质体育种技术，获得具有优良性状的酵母菌株。
具体目标包括： - 提高酵母菌的产酒能力 - 提高酵母菌对环境胁迫的适应能力 - 提高酵母菌的耐受性和稳定性3. 实验设计3.1 材料准备•酵母菌菌株：选择适合的酵母菌菌株，如Saccharomyces cerevisiae•培养基：准备适当的培养基，如YPD培养基•原生质体提取试剂盒：选择合适的试剂盒，用于提取酵母菌的原生质体3.2 实验步骤3.2.1 酵母菌培养1.从酵母菌冻存管中取出适量的酵母菌菌株，接种到含有YPD培养基的琼脂糖平板上。
2.在30℃的恒温培养箱中培养酵母菌菌株，直到菌落生长到适当大小。
3.2.2 原生质体提取1.从培养好的酵母菌菌落中，挑取一些菌落放入离心管中。
2.加入适量的原生质体提取试剂盒中的试剂，按照试剂盒说明书的操作步骤进行原生质体提取。
3.2.3 原生质体融合1.准备两个含有原生质体的酵母菌株。
2.将两个酵母菌株的原生质体混合在一起，并进行电融合或化学融合。
3.2.4 原生质体育种1.将融合后的酵母菌菌株接种到含有YPD培养基的琼脂糖平板上。
2.在适当的温度下培养酵母菌菌株，直到菌落生长到适当大小。
3.重复以上步骤，进行多次原生质体育种。
3.2.5 优良酵母菌筛选1.从原生质体育种的酵母菌菌落中，挑取一些菌落放入含有YPD培养基的琼脂糖平板上。
2.在适当的温度下培养酵母菌菌株，观察其生长情况和产酒能力。
3.选择生长良好且产酒能力较高的菌落，进行进一步鉴定和培养。
4. 结果分析通过上述实验步骤，我们可以获得经过原生质体育种的酵母菌菌株。
这些菌株可能具有更好的产酒能力、环境适应能力、耐受性和稳定性。
进一步的鉴定和培养可以确定这些菌株的优良性状，并用于相关应用。
耐高糖酿酒酵母原生质体制备与再生过程研究
耐高糖酿酒酵母原生质体制备与再生过程研究俞志敏;栾静;徐鹏;王继花;赵长新【期刊名称】《酿酒科技》【年(卷),期】2008(000)004【摘要】对1株耐高糖酿酒酵母的原生质体制备和再生条件进行了研究.结果表明,发酵7h后为对数生长中期,适宜原生质体化;L16(5)确定制备原生质体的最佳条件为蜗牛酶浓度(1.0%)、KCI高渗缓冲液(O.7mol/L)、酶解时间(1.5h)、预处理剂(0.1%B-巯基乙醇)和酶解温度(26℃),在此条件下原生质体形成率和再生率分别为80.84%和36.03%;原生质体形成后在7%蔗糖高渗培养基上夹层培养再生率较高(39.78%).【总页数】4页(P45-48)【作者】俞志敏;栾静;徐鹏;王继花;赵长新【作者单位】大连工业大学辽宁省发酵丁程重点实验室,辽宁,大连,116034;大连工业大学辽宁省发酵丁程重点实验室,辽宁,大连,116034;大连工业大学辽宁省发酵丁程重点实验室,辽宁,大连,116034;大连工业大学辽宁省发酵丁程重点实验室,辽宁,大连,116034;大连工业大学辽宁省发酵丁程重点实验室,辽宁,大连,116034【正文语种】中文【中图分类】TS261.1;T0925;TS262.2【相关文献】1.酿酒酵母和马克斯克鲁维酵母原生质体制备与再生研究 [J], 包伟霞;王静洁;王晓斐;陈由强;许旭萍2.酿酒酵母和酒类酒球菌原生质体制备与再生的条件优化 [J], 高年发;张颖3.安琪酿酒酵母与管囊酵母原生质体制备和再生 [J], 郑州;田辉;程金花;赵儒铭;李志军;姚娟;龚大春4.安琪超级酿酒酵母原生质体制备与再生条件研究 [J], 赵悦茗;杜跃超;罗晨5.酿酒酵母W5原生质体制备及再生条件的初步研究 [J], 孙红兵;宋刚;平文祥;葛菁萍因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
一种酵母原生质体的制备方法
一种酵母原生质体的制备方法
酵母原生质体是指从酵母细胞内部提取出来的膜包裹的细胞质部分，它是细胞质膜结构和功能的重要载体，可以用于进行酵母细胞的功能研究和酵母基因工程。
酵母原生质体的制备方法主要包括以下几个步骤：
1.酵母培养
首先，选择合适的酵母菌株进行培养，培养条件包括适宜的培养基、温度和营养条件。
常见的酵母菌株包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和模式酵母(Schizosaccharomyces pombe)等。
2.酵母细胞收获
当酵母菌培养到合适的生长阶段时，可以通过离心的方法将酵母细胞从培养液中分离出来。
离心一般使用低速(1000g)离心5-10分钟，沉淀下的酵母细胞就是我们需要的起始材料。
3.细胞破碎
将收获的酵母细胞重悬于适量的缓冲液中，如Tris-HCl缓冲液。
加入几滴苯甲酸醛溶液，使酵母细胞变性，同时加入玻璃珠或砂石进行机械破碎。
破碎条件可以根据不同的酵母菌株进行优化，一般破碎时间为5-15分钟。
4.细胞裂解
5.膜分离
将第二次离心得到的沉淀进行再次重悬于适量的缓冲液中，加入适量的D-葡萄糖和抗生素等，使其在37摄氏度下进行孵育。
由于酵母细胞的膜是整个原生质体的重要组成部分，通过孵育使得母细胞膜融合，形成完整的原生质体。
孵育时间一般为30-60分钟。
6.原生质体提取
需要注意的是，上述制备方法中的条件和步骤可以根据不同的实验目的进行优化和调整。
此外，酵母原生质体的制备是一个相对复杂的过程，对实验技术要求较高，需要注意避免样品污染和抗体交叉反应等问题。
酵母原生质体融合
酵母原生质体融合生态学院生物11 20号李香酿酒酵母，又称面包酵母或出芽酵母。
酿酒酵母是与人类关系最广泛的一种酵母，广泛的用于制作面包和馒头等食品及酿酒，是发酵中最常用的生物种类。
酿酒酵母的细胞为球形或者卵形，直径5–10μm。
其繁殖的方法为出芽生殖。
酵母菌种优劣直接影响发酵产品的价值，在自然界中菌种大多不具有较高的价值，因而对菌种的选育和改良显得尤为重要。
原生质体融合是一项应用广泛的菌种改良技术。
原生质体融合 (protoplast fusion)是将双亲株的微生物细胞分别通过酶解脱壁，使之形成原生质体，然后在高渗的条件下混合，并加入物理的或化学的或生物的助融条件，使双亲株的原生质体间发生相互凝集，通过细胞质融合，核融合，进而发生基因组间的交换重组，可以在适宜的条件下再生出微生物的细胞壁来。
从而获得带有双亲性状的、遗传性能稳定的融合子(fusant)的过程[1]。
目前常用的融合方法有化学融合、生物融合、电融合以及激光诱导融合等。
本实验用酿酒酵母2.339与酿酒酵母2.70作为融合双亲，进行融合，旨在计算两种菌原生质体的形成率、再生率及融合率。
望能将融合后的原生质体应用于酿酒生产中以获得较高的经济效益。
1材料1.1样品菌种：酿酒酵母(Saccharomgces cerevisiae)的两种营养缺陷型菌株(如met-、lys-)。
1.2 培养基和试剂(1)马铃薯培养基：马铃薯(去皮) 200g，葡萄糖20g，水1000 mL。
配制方法下：将马铃薯去皮，切成约2cm2的小块，放入1500mL的烧杯中煮沸30min，注意用玻棒搅拌以防糊底，然后用双层纱布过滤，取其滤液加糖，在补足水分1000 Ml,自然pH。
(2)YEPD培养基(用于酵母原生质体融合)：酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄20g蒸馏水1000 mL，pH6.0。
(3)YEPD高渗培养基(含0.6 mol/L NaCl的YEPD)：在YEPD培养基中0.6mol/L NaCl，3％琼脂。
酵母原生质体制作方案
1. 将酵母菌接种于YPD培养基（100 ml 到20 L），剧烈摇动或强制通气条件下培养至对数中期（OD600≈1~5）。
培养物在预称重的离心瓶中于4℃，1 500g 离心5 min。
2. 确定酵母细胞的湿重，它与压紧的细胞体积大致相同。
在所有的后续步骤中菌体的量将当作1体积来考虑。
3. 细胞用2~4体积冰水重悬，并立即于4℃，1 500 g 离心5 min，加入1体积含30 mmol/l DTT的酵母消解酶缓冲液重悬细胞、室温放置15 min。
4. 于4℃，1 500 g 离心5 min，菌体用3体积的酵母消解酶缓冲液重悬。
5. 在每毫升原压紧细胞中加入2 mg（200 U）酵母消解酶-100T，于30℃水平摇床以大约50 r/min 的转速温育40 min，通过水渗破法确定菌体是否完全转变为原生质体，如果原生质体化不完全，应继续温育直到完全。
6. 1 500 g 离心原生质体5 min，小心弃上清，原生质体球沉淀块不如细胞沉淀块般紧密。
7. 用2体积冰冷的酵母消解酶缓冲液轻轻重悬沉淀，原生质体1 500 g 离心5 min，重复2次。
8. 用2体枳酵母消解酶缓冲液轻轻重悬沉淀，不要试图得到均一的悬液，只需将沉淀物从管壁上洗下来，悬转10~20次，于1 500 g 离心10 min回收原生质体。
9. 用玻璃棒仔细将原生质体沉淀重悬于1体积裂解缓冲液中。
10. 在Dounce 匀浆器中用最紧密的研杵，冲击15~20次以裂解原生质体。
11. 往超离心管中加入一半管体积原生质体裂解液，再加等体积的抽提缓冲液，将离心管封口。
于4℃在旋转轮或摇床上轻轻倒转离心管15~30 min。
12. 于4℃，45Ti 转子上100 000 g 离心90 min。
收集上清，在100体积贮存缓冲液中透析2~4 h。
将透析袋转移到100体积新鲜的贮存缓冲液中，再透析2~4 h。
13. 取出几微升透析液，用水作1 ：1 000稀释，测定电导率。
微生物学题(周德庆版本带答案)
第一章绪论一、填空题1．世界上第一个看见并描述微生物的人是荷兰商人安东•列文虎克，他的最大贡献不在商界，而是利用自制的____显微镜___发现了微生物世界。
2．微生物学发展的奠基者是法国的巴斯德，他对微生物学的建立和发展作出卓越的贡献，主要集中体现__彻底否定了“自生说”学说___、__免疫学——预防接种__和__证实发酵是由微生物引起的___；而被称为细菌学奠基者是_德__国的_____柯赫____，他也对微生物学建立和发展作出卓越贡献，主要集中体现____建立了细菌纯培养技术___和__提出了柯赫法则____。
3．微生物学发展史可分为5期，其分别为史前期、初创期、___奠基期____、______发展期和成熟期；我国人民在史前期期曾有过重大贡献，其为制曲酿酒技术。
4．微生物学与___数___、___理____、___化___、信息科学和技术科学进一步交叉、渗透和融合，至今已分化出一系列基础性学科和应用性学科，如化学微生物学、分析微生物学、生物生物工程学、微生物化学分类学和微生物信息学等。
5．微生物的五大共性是指体积小，面积大、吸收多，转化快、生长旺，繁殖快、适应性强，易变异、分布广、种类多。
二、问答题：1．“微生物对人类的重要性，你怎么强调都不过分。
”试用具体事例来说明这句话的深刻意义。
(从四个方面具体的事例来说明人类与微生物的关系。
)(1) 物质和能量循环(2)人体生理屏障(3)提供必需物质(4)现代生物技术等方面。
2．简述科赫原则。
(如何判定某种微生物是病原菌？)3．微生物有哪五大共性？其中最基本的是哪一个？为什么？4．什么是微生物，微生物学？学习微生物学的任务是什么？5．简述微生物对生命科学基础理论研究有何重大贡献？答案要点：1）微生物是生命科学研究的理想材料；2）利用酵母菌细胞制剂进行酒精发酵研究，不但阐明了生物体内糖的复杂转化过程，且为近代生物化学领域的酶学奠定了基础；3）比德尔（Beadle）用脉胞菌进行突变试验，阐明了基因和酶的关系，提出了“一个基因一个酶”的假说，开创了生化遗传学新学科；4）遗传的物质基础是用微生物证实的；5）遗传密码的被揭露、中心法则的确定、基因对酶的调节控制在分子生物学的基本原理都与微生物学有密切关系；6）遗传工程的主角：①作为遗传工程中表达DNA所携带的遗传性状的载体，今天依然以大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和酵母菌等微生物为主，基因工程药物的生产几乎都是微生物；②在基因工程的操作中用于切割DNA取得所需基因的“手术刀”的限制性内切酶都来自微生物；③基因的载体是病毒、噬菌体、质粒；④动植物细胞培养和发酵技术；7）微生物技术向微生物科学的整个领域扩散。
真菌原生质体制备技术
真菌原生质体制备技术
1．灭菌物品：
（1）大滤纸:
（2）灭菌针筒（含脱脂棉和玻璃钎维）
（3）脱脂棉
（4）离心管
（5）无菌ddH2O
（6） 0.6M MgSO4
（7）培养基：
A. 等渗培养基（RCM）：麦芽汁1%，酵母膏1%，蛋白胨0.4%，葡萄糖0.4%，pH自然，用0.6M蔗糖配制。
B. 破膜培养基：麦芽汁1%，酵母膏1%，蛋白胨0.4%，葡萄糖0.4%，pH自然，用水配制。
也可以采用含有0.6M蔗糖的PDA作为等渗培养基，破膜培养基不加0.6M蔗糖即可。
（8）溶壁酶酶液：1.5%，用0.6MMgSO4配制，过滤除菌；
（9）培养皿：根据样品个数
2．制备方法：
（1）称取离心管重量并记录；
（2）用接种针挑出菌丝，并用灭菌双蒸水冲洗一次，然后用无菌的0.6M MgSO4冲洗两次，用灭菌的滤纸吸干，放入已知重量的离心管，称重并记录；
（3）计算得到菌丝重量，按0.2（g）：1(mL)加入灭菌酶液，震荡均匀；
（4） 28℃，3~4小时，摇床震荡（轻微），酶解，同时每30min镜检观察原生质体数量；
（5）灭菌注射器（含脱脂棉和玻璃钎维）过滤；
（6）离心：2500rpm,2min
（7）用0.6M MgSO4洗涤沉淀3次；
（8）用用0.6M MgSO4定容至最初的加酶量；
（9）镜检计数；记录；
（10）涂板后再生培养，第7天后每隔1天计数一次。
微生物学专升本习题库与答案
微生物学习题库与答案一、单选题（共60题，每题1分，共60分）1、E. coli在一般液体培养时，细胞浓度可达（）。
A、2×10^10B、2×10^7C、2×10^8D、2×10^9正确答案：D2、筛选营养缺陷型时，为了达到淘汰野生型目的，可将诱变后的细菌培养在含青霉素的（）。
A、限量补充培养基B、补充培养基C、完全培养基D、基本培养基正确答案：D3、污水处理中的生化曝气法是一种（）。
A、生物吸附法B、生物膜法C、活性污泥法D、生物降解法正确答案：C4、在杆状细菌中，假单胞菌以长有（）出名。
A、周生鞭毛B、两端生鞭毛C、侧生鞭毛D、一端生鞭毛正确答案：D5、细菌的呼吸链在( )上。
A、质粒B、细胞壁C、线粒体D、细胞膜正确答案：D6、在金黄色葡萄球菌菌肽聚糖中，四肽尾的结构是（）。
A、L-Ala→D-Glu→L-Lys→L-AlaB、L-Ala→D-Glu→m-DAP→D-AlaC、D-Ala→L-Glu→D-Lys→L-AlaD、L-Ala→D-Glu→L-Lys→D-Ala正确答案：D7、在芽孢的各层结构中，含DPA-Ca量最高的层次是( )。
A、胞外壁B、芽孢衣C、皮层D、芽孢核心正确答案：C8、代时是指（）。
A、细胞分裂繁殖一代所需要的时间B、从对数期结束到稳定期开始的间隔时间C、培养物从接种到开始生长所需要的时间D、培养物的生长时间正确答案：A9、为治疗由于正常菌群失调而引起的腹泻症，常宜应用（）。
A、针对G－菌的抗生素B、广谱抗生素C、一段时间内饥饿D、口服某些活微生物制剂正确答案：D10、制备酵母菌的原生质体可用（）处理。
A、蜗牛消化酶B、几丁质酶C、纤维素酶D、溶酶菌正确答案：A11、在四条产能代谢途径中，有3条途径存在底物水平磷酸化产ATP，它们是（）。
A、EMP、HMP及TCAB、EMP、HMP及EDC、HMP、ED及TCAD、EMP、ED及TCA正确答案：D12、V.P试验的依据来自（）。
菌落PCR法
菌落PCR法
利用PCR分析酵母菌落
1.在一个无菌的0.5ml微量离心管里，依次再加入下列物质：
10×菌落PCR缓冲液2μl
25mmol/L MgCl2 1.2μl
10mmol/L dNTPs 0.4μl
寡核苷酸引物每个引物浓度为10 pmol
Taq聚合酶5单位（0.2μl）
H2O加至总体系为20μl
2.用一个黄色的一次性移液器吸头，吸取少量酵母菌落（0.1-0.25μl），加入反应体
系。
取酵母菌落时切不可过多。
因为细胞壁的成分可抑制PCR反应。
3.将PCR管放进PCR仪内。
进行PCR反应。
4.用琼脂凝胶电泳分析PCR产物。
如果目的序列的扩增条带微弱或者杂乱，将链延伸温度比按AT含量丰富的那条寡核苷酸引物的T m计算值降低2~3℃，重新PCR。
如果PCR结果仍然不十分满意，可在PCR前用酶解酶100T除去细胞壁，使酵母细胞成为原生质体，此步骤仅需1h，通常可以解决问题。
另一种方法是，将待测菌落在10mlYPD培养基中培养，制备少量的酵母DNA用于扩增。
酶解法制备酵母原生质体试验
酶解法制备酵母原生质体试验刘雪芹;吴梦;杨松全;丁玉春;葛良鹏【期刊名称】《上海畜牧兽医通讯》【年(卷),期】2016(000)004【摘要】原生质体融合是现代细胞工程中常用的技术，经过融合，不同原生质体的遗传物质会整合到一起，从而得到所需的具有特定遗传特性的细胞。
获得原生质体是进行融合的关键步骤。
本试验研究了酶解法制备酵母原生质体过程中酵母细胞破壁的最优条件。
结果显示，用STC重悬OD600＝2的酵母菌量取得较好去膜效果的最佳条件为：酶解时间为30 min ，反应温度为37℃，酶量为40μg／m L。
【总页数】2页(P30-31)【作者】刘雪芹;吴梦;杨松全;丁玉春;葛良鹏【作者单位】重庆市畜牧科学院重庆402460;重庆市畜牧科学院重庆402460;重庆市畜牧科学院重庆402460; 农业部养猪科学重点实验室重庆402460;重庆市畜牧科学院重庆402460; 养猪科学重庆市市级重点实验室重庆402460;重庆市畜牧科学院重庆402460; 农业部养猪科学重点实验室重庆402460; 养猪科学重庆市市级重点实验室重庆402460【正文语种】中文【相关文献】1.酿酒酵母和马克斯克鲁维酵母原生质体制备与再生研究 [J], 包伟霞;王静洁;王晓斐;陈由强;许旭萍2.安琪酿酒酵母与管囊酵母原生质体制备和再生 [J], 郑州;田辉;程金花;赵儒铭;李志军;姚娟;龚大春3.超声波法与酶解法联合制备短刺小克银汉霉原生质体及其活性评价 [J], 谢深霞;欧万倩;张景红4.酿酒酵母W5及休哈塔假丝酵母20335原生质体制备条件的确定 [J], 张麓岩;张梦云;葛菁萍5.两步酶解法制备拟南芥保卫细胞原生质体 [J], 杨瑞楠;赵福宽;于涌鲲;秦勇;孙清鹏因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
一种酵母原生质体的制备方法(一)
一种酵母原生质体的制备方法(一)
一种酵母原生质体的制备方法
引言
酵母原生质体是研究酵母生物学和细胞功能的重要工具。
本文将详细介绍一种酵母原生质体的制备方法，包括材料和步骤。
材料
•酵母菌株
•酵母培养基
•液氮
•酶（如裂解酶）
•加压破碎机
步骤
1.酵母菌株的培养
–选取合适的酵母菌株，并在适宜的酵母培养基中培养。
–确保培养条件适宜，包括温度、pH值和营养物质。
2.收获酵母菌细胞
–将培养好的酵母菌细胞收获到离心管中。
–使用低温和高速离心将酵母菌细胞沉淀到管底。
3.冻存酵母细胞
–将收获到的酵母菌细胞用液氮快速冷冻保存。
–这样可以保持细胞的完整性和活力。
4.酵母细胞的裂解
–从冻存酵母菌中取出适量细胞液。
–加入适量的裂解酶，在恰当的温度下孵育制备酵母细胞裂解液。
5.原生质体的制备
–将酵母细胞裂解液加入加压破碎机。
–根据设备要求进行适当压力和时间的制备。
6.分离原生质体
–经过加压破碎机后，从制备好的原生质体悬浮液中轻轻吸取上清液。
–上清液中富集了酵母原生质体。
7.原生质体的储存
–将得到的酵母原生质体储存于低温条件下，如冰箱等。
–注意保持原生质体的稳定性和活性。
结论
本文介绍了一种酵母原生质体的制备方法，该方法可以有效地从酵母菌株中制备出具有活性和稳定性的原生质体。
通过这种方法，可以为酵母生物学和细胞功能的研究提供有力的工具。
以上是详细的酵母原生质体制备方法，我们希望本文能对该领域的研究者和实验室工作者有所帮助。
原生质体制备和转化
将制备好的原生质体溶液3200r/min，4℃离 心10min；
经四层无菌镜头纸过滤，制成孢子浓度约为107个/mL的单 孢子悬浮液
将上述制得的孢子悬浮液每1mL接种于一瓶盛有50mL菌丝 培养基的三角瓶中，于30℃静止培养23~25h
6000r/min，离心10min收集幼嫩的菌丝体 用无菌水洗涤菌丝体，4000r/min，离心5min收集菌丝体
Company Logo
弃上清，沉淀重悬于预冷的STC溶液中，将原 生质体浓度调整为5×106 ~ 5×107个细胞 /mL；
将约2~5µg质粒DNA(体积不超过10µL)与 100µL米曲霉原生质体置冰上轻轻混匀；
加入25µL PTC溶液，冰浴20min；
加入1 mL PTC溶液，室温放置15min；
最后加入2mL STC溶液，混匀。
文献汇报
单击此处添加文ห้องสมุดไป่ตู้具体内容
汇报人姓名
培养基成分 高渗溶液（有机/无机）
缓冲液的pH（5.8-7.4） 酶解条件（时间/各种酶的比例）
酶液用高盐还是高渗缓冲液配 擦镜纸收集菌丝体or离心收集菌丝体
双层or单层培养基
高渗缓冲液：
《微生物学实验教程》 周德庆（酵母）
1、接种于液体培养基上培养。
高渗缓冲液：
蔗糖0.5mol/L, MgCl2 10mmol/L,Tris-HCl(pH 7.4) 10mmol/L
2、取培养液10ml，4000r/min离心5min, 弃上清液，用TrisHCl(pH 7.4)、0.5mol/LEDTA、高渗缓冲液各洗涤一次。
一种酵母菌的原生质体制备方法[发明专利]
![一种酵母菌的原生质体制备方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/b177605d59fafab069dc5022aaea998fcc2240cd.png)
(10)申请公布号 CN 101712934 A(43)申请公布日 2010.05.26C N 101712934 A*CN101712934A*(21)申请号 200910228483.X(22)申请日 2009.11.18C12N 1/16(2006.01)(71)申请人天津市畜牧兽医研究所地址300112 天津市西青区外环西线38公里处(72)发明人范寰 廖伟(74)专利代理机构天津盛理知识产权代理有限公司 12209代理人王融生(54)发明名称一种酵母菌的原生质体制备方法(57)摘要一种酵母菌的原生质体的制备方法，在YEPD 液体培养基上培养14-18h 的酵母菌，用0.1％-0.2％β-巯基乙醇预处理10-20min ，用0.6mol/LKCl 做渗透压稳定剂时，采用2％蜗牛酶，在28-30℃酶解1-2h ，原生质体形成率达到90％-96％。
本发明效果是：采用本酵母菌的原生质体制备方法：制备工艺简单，易操作。
原生质体的形成率可达90-96％。
(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书 1 页 说明书 2 页权 利 要 求 书CN 101712934 A1/1页1.一种酵母菌的原生质体的制备方法，其特征在于：在YEPD液体培养基上培养14-18h 的酵母菌，用0.1％-0.2％β-巯基乙醇预处理10-20min，用0.6mol/LKCl做渗透压稳定剂时，采用2％蜗牛酶，在28-30℃酶解1-2h，原生质体形成率达到90％-96％。
2.根据权利要求1所述的白腐真菌的原生质体的制备方法，其特征在于：在YEPD液体培养基上培养16h的酵母菌，用0.2％β-巯基乙醇预处理20min，用0.6mol/LKCl做渗透压稳定剂时，采用2％蜗牛酶，在30℃酶解1h，原生质体形成率达到90-96％。
一种酵母菌的原生质体制备方法技术领域[0001] 本发明属于生物工程中微生物育种的方法，特别涉及一种酵母菌的原生质体制备方法。
原生质体制备和再生的影响因素
原生质体制备和再生的影响因素【摘要】以酿酒酵母YS5为出发菌株，经蜗牛酶酶解获得原生质体后，用紫外线进行诱变处理，通过一级筛选得到了61株诱变菌株，将这些诱变株直接进行发酵，利用气相色谱对发酵液酒精产量进行分析。
结果表明，经过紫外线照射30s后，通过筛选获得了一株酒精发酵较高产菌株，酒精产率达到了10.36%（v/v），比出发菌株提高了3.6%。
【关键词】酿酒酵母；原生质体；紫外诱变；甘蔗汁发酵酵母细胞的融合及酵母原生质体的诱变的一个重要前提就是如何制备大量的原生质体，原生质体制备率受到各种条件的影响，如菌龄、酶浓度、温度、预处理等的影响，因此确定不同因素对酵母原生质体的影响及优化不同因素，可以大大提高产率。
1.菌体菌龄对原生质体制备的影响微生物的生理状态是决定原生质体产量的主要因素之一，特别是菌龄，明显影响原生质体释放的频率。
不同时期的菌体，对各种溶壁酶的敏感性不同，原生质体的形成率与再生率也有很大差异。
较年轻的菌体细胞制备原生质体较为容易，而且此阶段的原生质体再生率也较高。
处于对数生长期的菌体代谢活性高而稳定、细胞壁对酶的作用较为敏感，且大小比较一致，生长适应能力强，故通常取处于对数生长期的菌体制备原生质体。
有研究表明对数生长早期形成率最高，对数生长中期时再生率最高，对数生长晚期的再生率也比对数生长中期的低。
这是由于细胞壁越稚嫩，越易被酶破坏，对数生长早期菌体幼小，代谢活性高而稳定、细胞壁对酶的作用较为敏感，且大小比较一致，故生活适应能力强；对数生长中期幼小菌体对不利因素抵抗能力差，一旦失去细胞壁，较难恢复；对数生长晚期的原生质体存在着很大比例的非活性个体。
菌体如果进入稳定期，细胞壁结构趋于稳定和老化，不易去壁形成原生质体，原生质体形成率显著降低，而且再生率也有所下降。
微生物的菌龄是随着菌种和培养条件而异，酵母菌菌液中加入β-巯基乙醇可以破坏细胞壁组分中的二巯基，处于对数生长期的酵母菌菌体代谢极为旺盛，细胞壁易被瓦解，其细胞壁对蜗牛酶较为敏感，易于酶解脱壁，且酵母菌制备原生质体时，要使菌体同步化才能大幅度的提高制备率。
微生物部分思考题
1、为什么说Koch等建立的微生物纯培养技术是微生物学建立与发展的基石？一般可用哪些方法获得微生物的纯培养？不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征，可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。
大多数细菌、酵母菌，以及许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落，采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养。
所谓平板，即培养平板(culture plate)的简称，它是指熔化的固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛有固体培养基的平皿。
这方法包括将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面。
固体培养基是用琼脂或其他凝胶物质固化的培养基，每个孤立的活微生物体生长、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。
最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。
这种由Koch建立的采用平板分离微生物纯培养的技术简便易行，100多年来一直是各种菌种分离的最常用手段。
常用固体培养基分离纯培养：1、稀释倒平板法(pour plate method)2、涂布平板法(spread platemethod)3、平板划线分离法(streak plate method)4、稀释摇管法(dilutlon shake culture method)此外还有液体培养基分离纯培养。
通常采用的液体培养基分离纯化法是稀释法。
接种物在液体培养基中进行顺序稀释，以得到高度稀释的效果，使一支试管中分配不到一个微生物。
如果经稀释后的大多数试管中没有微生物生长，那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就是纯培养物。
如果经稀释后的试管中有微生物生长的比例提高了，得到纯培养物的概率就会急剧下降。
因此，采用稀释法进行液体分离，必须在同一个稀释度的许多平行试管中，大多数(一般应超过95%)表现为不生长。
单细胞（孢子）分离：采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养。
单细胞分离法的难度与细胞或个体的大小成反比。
根霉_酵母原生质体的制备与融合探讨
中图分类号：TS26；文献标识码：A；文章篇号:1007-2764(2006)01-0026-009根霉、酵母原生质体的制备与融合探讨陈冬纯，周传云（湖南农业大学食品科技学院，湖南长沙410128）摘要：利用分离的根霉、假丝酵母菌种，首先各自进行菌体活化，原生质体制备，然后将两菌进行杂交融合。
实验发现根霉和酵母有获得糖化力高，又能发酵产生酒香味的融合子的可能。
关键词：根霉；假丝酵母；原生质体；原生质融合Extraction and Merge of Protoplast from Rhizopus and Y eastChen Dong-chun，Zhou Quang-yun(Scientific and technological institute of food of agricultural university of Hunan, Changsha 410128, China)Abstract: This paper at first separated the protoplast from rhizopus and yeast respectively, and then merged the protoplasts of them. The result showed that the protoplast of rhizopus and candida can merge each other.Keywords:Rhizopus; Candida; Protoplast; Protoplast fusion微生物原生质体融合起源起源于20世纪50年代，经历了一个逐步改进和完善的过程，原生质体的融合方法有：NaNO3、高钙高pH值、PEG法等，PEG法是采用聚乙二醇为融合剂的一种化学方法，使用简便、经济、可重复性强。
根霉是霉菌中一种具有多酶系特征的霉菌，它除了能分泌淀粉酶外，还能分泌酸性蛋白酶、酒化酶及乳酸、琥珀酸等多种有机酸和乙醇等，可以在整个发酵过程中始终边糖化边发酵连锁进行。
《原生质体的制备》课件
选取动物组织
选择健康的动物组织作为制备 原生质体的材料。
酶解消化
将动物组织放入酶液中，在适 宜的温度和pH条件下进行酶 解消化。
洗涤和保存
清洗原生质体去除残留的酶液 和其他杂质，然后进行保存备 用。
微生物原生质体制备的步骤
选取微生物菌株
选择生长旺盛、无污 染的微生物菌株作为 制备原生质体的材料 。
成功案例2
在蓝细菌原生质体制备实验中，通过选择合适的酶种类和浓度，以及优化酶解和再生过程，成功制备 出可用于遗传转化实验的原生质体。
感谢您的观看
THANKS
实验过程中的注意事项
1 操作规范
在操作过程中，要严格遵守无菌操作规程，避免交叉污 染。
2 酶液处理
在操作过程中，要严格遵守无菌操作规程，避免交叉污 染。
3 离心条件
在操作过程中，要严格遵守无菌操作规程，避免交叉污 染。
4 温度控制
在操作过程中，要严格遵守无菌操作规程，避免交叉污 染。
实验后的处理事项
02
原生质体制备的实验材料
植物细胞原生质体制备所需的材料
酶
用于分解细胞壁，常用的酶包括 纤维素酶、果胶酶和离析酶等。
渗透压稳定剂
用于保持原生质体的稳定形态， 常用的渗透压稳定剂包括甘露醇 、山梨醇等。
01
植物组织
用于制备原生质体的材料，通常 选用幼嫩的叶片、茎段或根尖等 部位。
02
03
缓冲液
用于维持细胞内的酸碱平衡，常 用的缓冲液包括Tris-HCl和MES 等。
微生物原生质体制备所需的材料
微生物菌落
用于制备原生质体的材料，可以根据 实验需求选择不同的微生物菌落。
酶
用于分解细胞壁，常用的酶包括溶菌 酶、蜗牛酶等。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
酵母原生质体制备试剂盒
货号：BB-3630 V2.16
试剂盒储存条件：
2-8℃保存。
开盖后组份按要求条件保存。
试剂盒组成：
产品组成 BB-3631-1 BB-3631-2 组份编号
规格 50T 100T
试剂A：酵母原生质体制备液A 20ml 40ml 36300A
试剂B：酵母原生质体制备液B 25ml 50ml 36300B
试剂C：原生质体保存液C 20ml 40ml 36300C 使用说明书 1 1
有效期：
一年。
※ ※ ※ 使用前请仔细阅读产品说明书 ※ ※ ※
使用限制： 本试剂盒仅供科学研究使用，不可用于诊断或治疗。
产品更新： 贝博会更新或升级产品，以优化和增强其使用性能，产品说明书会进行相应的版本更新。
使用产品时，请参照随产品附带的说明书，不要参照网上下载的说
明书，可能是不同的版本。
需要最新电子版说明书时可以在收到产品后发邮件索取。
使用安全： 使用时需要合适的实验室外套，一次性手套。
避免皮肤或粘膜与试剂接触。
如果试剂不小心接触皮肤或眼睛，应立即用水冲洗。
质量控制： 贝博对每批产品进行严格测试以确保产品质量一致。
知识产权： 贝博TM BBproExtra TM系列试剂盒及其使用方法包含专有技术。
注意事项：
1.螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖和管内壁上的液体离心至管
底，避免开盖时试剂损失。
2.禁止与其他品牌的试剂混用，否则会影响使用效果。
3.样品或试剂被细菌或真菌污染或试剂交叉污染可能会导致错误的结果。
4.最好使用一次性吸头、管、瓶或玻璃器皿，可重复使用的玻璃器皿必须在使用前清
洗并彻底清除残留清洁剂。
5.实验后完成后所有样品及接触过的器皿应按照规定程序处理。
技术支持：
产品技术问题可发邮件至bestbio@咨询。
如果您有任何关于产品性能或者新应用和技术的建议，欢迎您随时联系我们。
产品简介：
贝博BBproExtra TM酵母原生质体制备试剂盒提供全套试剂，适用于从各种酵母样本制备原生质体。
此试剂盒提供了一个系统，维持原生质体是分开和完整的。
优化的试剂配方和程序可以快速分离原生质体，而绝少交叉污染。
本试剂盒提取的原生质体组分仍保持其生化功能，适合各种下游分析。
本试剂盒不适用冷冻酵母样本的原生质体制备。
试剂盒以外自备试剂耗材和仪器
● PBS ● 吸头、离心管
● 移液器 ● 冰盒
● 离心机 ● 涡旋振荡器 ● 冰箱
使用方法：
使用注意事项：
●旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
●实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。
整个过程须保持样品处于低温。
1.酵母培养物，在4℃，5000g条件下离心5-10分钟，小心吸取培养基，尽可能
吸干，收集酵母沉淀。
2.用PBS洗涤酵母两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
3.每100ul体积酵母沉淀物中加入400ul酵母线粒体提取液A，混匀后，在30℃
条件下保温15分钟。
【注】：
①酵母数量根据实验情况调整，每次的裂解液用量并不是一定的，请根据实际情况调整。
4.5000g条件下离心5-10分钟，收集酵母沉淀。
5.用PBS缓冲液洗涤酵母一次，离心收集菌体。
6.酵母沉淀物中加入500ul酵母线粒体提取液B，混匀后，在37℃或室温条件下
轻微振荡60分钟-2小时。
【注】：
①不同酵母样品试剂B处理时间不同，一般60分钟即可。
7.在5000g条件下离心5-10分钟，收集沉淀，弃上清。
8.沉淀用PBS缓冲液洗涤一次。
9.离心收集沉淀，即得到酵母原生质体样品。
10.将酵母原生质体样本用试剂C重悬。
【注】：
●也可用其他适当缓冲液重悬或直接用于下游实验。
11.置冰箱备用或直接用于下游实验。
相关产品：
产品 产品号 产品 产品号 总蛋白提取试剂盒BB-3101 磷酸化蛋白富集试剂盒 BB-3108 核蛋白提取试剂盒 BB-3102 膜蛋白提取试剂盒 BB-3103 膜/胞浆/核蛋白分步提取试剂盒 BB-3104 活性蛋白提取试剂盒 BB-3106 Bradford蛋白定量试剂盒 BB-3411 BCA蛋白定量试剂盒 BB-3401 ECL化学发光检测试剂盒 BB-3501 植物核蛋白提取试剂盒 BB-3154 细胞蛋白提取试剂盒 BB-3121 细菌膜蛋白提取试剂盒 BB-3151 组织蛋白提取试剂盒 BB-3122 植物总蛋白提取试剂盒 BB-3124 细菌蛋白提取试剂盒 BB-3123 植物膜蛋白提取试剂盒 BB-3152 酵母蛋白提取试剂盒 BB-3125蛋白酶抑制剂混合物 BB-3301 昆虫蛋白提取试剂盒 BB-3126真菌蛋白提取试剂盒 BB-3127磷酸化蛋白提取试剂盒 BB-3105 磷酸酶抑制剂混合物 BB-3311 总蛋白提取试剂盒（2D电泳用） BB-3181 细菌蛋白提取盒（2D电泳用） BB-3182 植物蛋白提取盒（2D电泳用） BB-3183 酵母蛋白提取盒（2D电泳用） BB-3185 细菌膜蛋白提取盒（2D电泳用） BB-3187 线粒体蛋白提取盒（2D电泳用）BB-3191。