原生质体制备方法
原生质体制备
拟南芥原生质体制备转化方法选取开花前生长良好情况的拟南芥（Columbia型）叶片，用刀片切成0.5-1 mm宽的叶条；浸于配置好的酶解液中（每5-10 mL酶解液约10-20片叶子）；暗箱抽真空，30 min；转移至室温，继续黑暗酶解3-5 h；当酶解液变绿时轻轻摇晃培养皿促使原生质体释放；加入等量的W5溶液稀释酶解液；用60-100目筛子（W5溶液润湿）过滤酶解液；将滤液转移至30 mL eppendorf管，500-700 g离心1-2 min，弃上清；加入10 mL预冷的W5溶液轻柔重悬原生质体；放于冰上静置30 min；保持室温在23℃以下；500 g离心8-10 min，弃上清；加入1 mL MMG溶液重悬原生质体（使其终浓度约在2×105个/mL）；即得到原生质体溶液。
用移液器吸取100 L的以上原生质体溶液于1.5 mL eppendorf管，加入10L DNA（10-20 g的质粒DNA），轻柔混合后，加入110 L PEG溶液，轻柔拍打eppendorf管使其混合完全；室温下诱导转化5-15 min；加入400-440 L W5溶液稀释转化混合液，轻柔颠倒，使之混合完好以终止转化反应；500 g离心2 min，弃上清；加入1 mL W5溶液悬浮清洗，500 g 离心2 min，弃上清；再用1 mL WI溶液轻柔重悬原生质体；室温（20-25℃）下，诱导载体表达18小时以上。
相关溶液配制PEG4000溶液（现用现配）组分用量PEG4000 1 g1 M CaCl20.25 mL0.8甘露醇0.625 mL水0.75 mL纤维素酶解液试剂15 mL酶液体系1-1.5 % Cellulase R10 (YaKult Honsha) 0.225 g 纤维素酶0.2-0.4 % Mecerozyme R10 (YaKult Honsha) 0.045 g 果胶酶0.4 M 甘露醇 1.09 g甘露醇干粉20 mM KCl 1 mL 0.3 M KCl20 mM MES, pH5.7 1 mL 0.3 M MES，pH5.7加水10 mL55℃水浴加热10 min，冷却至室温后加入以下试剂10 mM CaCl2 1 mL 0.15 M CaCl20.1% BSA 1 mL 1.5 % BSA5 mM β-巯基乙醇1mL 75 mM β-巯基乙醇用0.45 m滤膜过滤后即可使用。
一株内生真菌的原生质体制备及再生过程研究
一株内生真菌的原生质体制备及再生过程研究
材料准备：
内生真菌菌株
无菌工作台和器具（如培养皿、显微镜片、移液器等）无菌培养基（如琼脂、乳糖酸钠琼脂培养基等）
无菌培养液（如培养基溶液）
去离子水或无菌PBS缓冲液
培养基制备：
根据内生真菌的要求配制适宜的无菌培养基。
煮沸溶液中加入琼脂，并搅拌至溶解。
转移至培养器并加盖，进行高压灭菌。
菌种处理：
在无菌条件下，将内生真菌分离出来。
用无菌培养液或去离子水洗涤菌株，去除杂质。
原生质体制备：
将清洗后的菌株转移到含有少量无菌培养液的培养皿中。
用显微镜检查，确保菌株没有受到污染。
在无菌条件下，用移液器将菌株转移到新的培养皿中。
将培养皿置于振荡器中，以帮助分离真菌的原生质体。
过一段时间后，观察原生质体的形成情况。
原生质体再生：
将形成的原生质体转移到含有适宜培养基的培养皿中。
在适宜的温度（一般为25-30摄氏度）下，进行培养。
定期观察并记录原生质体再生的过程。
根据需要，可以进行进一步的培养和分离。
水稻原生质体制备及转化方法
原生质体制备及转化1.去皮的日本晴种子在75%的酒精中消毒1 min。
然后用2.5%的次氯酸钠消毒20 min。
用无菌水洗至少5次，然后在1/2 MS培养基上，12 h光照（大约150umol m-1 s-1）十二小时黑暗，26 ℃培养7-10天，提前一天烧好去尖的黄蓝枪头备用。
2.取40-60棵水稻幼苗的茎和叶鞘的绿色组织。
3.将一捆水稻植株（大概10棵幼苗）用剃刀一起切成大约0.5 mm的小段。
4.将小片段立刻放进0.6 M的甘露醇中，黑暗中放置10 min。
5.用100目钢制滤网去掉甘露醇，将小片段放在加入15mL酶液的25mL锥形瓶中，（1.5% Cellulase RS，0.75% Macerozyme R-10，0.6 M甘露醇，pH5.7的10mM MES，10mM CaCl2，0.1% BSA），28℃摇床中轻轻摇晃（50rpm），黑暗孵育4-6 h。
6.此时配置40%的PEG4000，酶消化后，分三次加入等体积15mL的W5溶液（154 mM NaCl，125mM CaCl2,5 mM KCl，pH 5.7的2mM MES）。
用手充分摇晃10s。
7.用400目钢制滤网过滤得到原生质体在圆底管中。
8.80g离心（升降速度设为1档）5min，缓慢吸走上清液。
9.沿壁缓慢加入4mL W5溶液，轻轻悬浮，再离心80g，5min，弃上清10.沿壁缓慢加入4mL Mmg溶液，离心80g，5min，弃上清11.再加Mmg溶液，补至每个样品100μl原生质体12.分装2mL离心管，每100μl原生质体，加入20μl质粒和120μl新鲜制备的40%的PEG4000，混匀13.28℃避光静置转化20--25min14.加1.5 mL W5溶液混匀，80g离心3min，弃上清。
15.重复步骤1416.加2mL W5溶液重悬，轻轻混匀，移到细胞培养板，锡箔纸包裹避光28℃避光静置培养15-20小时17.培养完成后，将培养板中沉淀的原生质体轻轻混匀，吸到2 mL离心管中，80g离心3min，弃上清，保留100μl上清液18.共聚焦显微镜观察拍照配制溶液方法：酶液W5溶液MMG溶液PEG(5mL)。
原生质体制备
原生质体的制备：1、选取3-4周长势良好的植株的展开叶片（通常选取第5~7片真叶）。
2、用新的锋利的刀子从叶片的中部切0.5-1 mm叶条，比较理想的情况下，每克新鲜叶片中大约含有107个原生质体（大约100-150个叶条在5-10 ml酶溶液中消化）。
对于常规实验，10-20个叶条消化在5-10 ml酶溶液中将得到0.5-1×106个原生质体，足够25-100个样品使用。
3、快速而温柔的转移叶条到准备好的酶溶液中（10-20叶条在5-10 ml酶液中），用平头镊子将叶条完全淹没。
4、用真空泵将叶条在黑暗中真空30 min。
5、室温下在黑暗中至少消化3 h（继续消化，不要摇晃）。
经过轻微转动后酶溶液应该变成绿色，这表明原生质体已经被释放。
6、用显微镜检查原生质体的释放（拟南芥叶肉的原生质体的大小大约为30-50μm）。
7、用等体积的W5溶液稀释酶溶液，通过过滤去除没有消化的叶片组织。
8、用水洗去75 μm尼龙过滤器中的酒精（通常浸泡在95%乙醇中）并去除过量的水，用W5溶液润洗过滤器后过滤原生质体。
9、将原生质体溶液转移到30 mL圆底离心管中，100×g离心5 min，尽可能的去除上清液。
10、用计数板进行细胞计数，每2×105个原生质体加入1 mL W5溶液，在冰，上静置30 min。
11、室温下沉降原生质体15 min，去除W5溶液，每2×105个原生质体加入1 mL MMG溶液重悬浮。
12、在2 mL离心管中分别加入10 mL DNA（5-10 kb的质粒DNA 10-20 mg）和100 mL原生质体（2×104个原生质体细胞），轻轻混匀。
13、加入110 mL PEG溶液，轻弹试管完全混匀。
14、室温下孵育转染混合物15 min（反应5 min足够）。
15、室温下，用400-440 mL W5溶液稀释转染混合物，轻轻摇动或倒置离心管混匀来停止转染过程。
原生质体的制备
原生质体的制备
稳渗剂：0.6 mol/L甘露醇，121 ℃高温高压灭菌20 min后备用。
2%溶壁酶：在无菌操作台中称取溶壁酶（广东省微生物研究所生产），加入灭菌过的稳渗剂（甘露醇0.6 mol/L），最终使酶液浓度达到2%，再用0.22 µm 滤膜过滤除菌待用。
（观察锁状联合）乳酸石炭酸棉蓝染色液：石炭酸10 g，棉蓝0.02 g，甘油20 mL，乳酸10 mL，蒸馏水10 mL，将石炭酸加入蒸馏水中加热融化，之后加入乳酸和甘油，最后加入棉蓝，溶解备用。
原生质体制备
(1)将杏鲍菇菌丝接种于固体PDA培养基中，25℃培养5-7 d。
(2)活化后的菌丝接入液体PDA培养基中，25℃，120 rmp摇床培养5-6 d。
(3)将菌丝球倒入50 mL离心管中，10000 rpm 离心10 min，倒去上清液，再用无菌水、甘露醇各离心清洗一次。
(4)用灭菌滤纸吸干菌丝水分，称取0.2 g 菌丝放入10 ml 离心管中，再加入2 mL 2％浓度的溶壁酶，30℃水浴2-2.5 h，每隔1 h镜检破壁情况。
(5) 加入6mL甘露醇混匀，终止酶解。
800 rpm离心5 min，用移液枪小心转移上清酶液至新的10毫升离心管，再用0.6 mol/L甘露醇离心离心清洗一次（4000 rpm，15 min），液体再生培养基离心清洗一次（4000 rpm，15 min）。
植物原生质体的制备原理
植物原生质体的制备原理
植物原生质体的制备原理是利用生物学方法将植物细胞的质膜和细胞壁打破，使得细胞质与细胞器分离，获得纯净的细胞质。
具体制备原理如下：
1. 选择新鲜的植物组织，例如嫩叶片、根尖等，并将其切碎。
2. 将切碎的组织置于适当的缓冲液中，缓冲液中含有维持细胞渗透压的某些成分，如蔗糖。
3. 经过一定时间的培养，细胞内的质膜和细胞壁会被渗透液逐渐分解，从而使细胞质暴露在外。
4. 使用过滤纸或细孔滤网将悬浊液过滤，以去除细胞壁碎片和其他杂质。
5. 对滤液进行离心，以分离更纯净的细胞质。
6. 最后，将分离得到的细胞质保存在低温条件下，或进行后续的实验操作。
通过上述步骤，就可以制备得到植物原生质体，供后续的生物学研究和实验使用。
一种酵母原生质体的制备方法
一种酵母原生质体的制备方法
酵母原生质体是指从酵母细胞内部提取出来的膜包裹的细胞质部分，它是细胞质膜结构和功能的重要载体，可以用于进行酵母细胞的功能研究和酵母基因工程。
酵母原生质体的制备方法主要包括以下几个步骤：
1.酵母培养
首先，选择合适的酵母菌株进行培养，培养条件包括适宜的培养基、温度和营养条件。
常见的酵母菌株包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和模式酵母(Schizosaccharomyces pombe)等。
2.酵母细胞收获
当酵母菌培养到合适的生长阶段时，可以通过离心的方法将酵母细胞从培养液中分离出来。
离心一般使用低速(1000g)离心5-10分钟，沉淀下的酵母细胞就是我们需要的起始材料。
3.细胞破碎
将收获的酵母细胞重悬于适量的缓冲液中，如Tris-HCl缓冲液。
加入几滴苯甲酸醛溶液，使酵母细胞变性，同时加入玻璃珠或砂石进行机械破碎。
破碎条件可以根据不同的酵母菌株进行优化，一般破碎时间为5-15分钟。
4.细胞裂解
5.膜分离
将第二次离心得到的沉淀进行再次重悬于适量的缓冲液中，加入适量的D-葡萄糖和抗生素等，使其在37摄氏度下进行孵育。
由于酵母细胞的膜是整个原生质体的重要组成部分，通过孵育使得母细胞膜融合，形成完整的原生质体。
孵育时间一般为30-60分钟。
6.原生质体提取
需要注意的是，上述制备方法中的条件和步骤可以根据不同的实验目的进行优化和调整。
此外，酵母原生质体的制备是一个相对复杂的过程，对实验技术要求较高，需要注意避免样品污染和抗体交叉反应等问题。
植物原生质体的制备
在分离原生质体的酶溶液内，需加入一定量的渗透稳定剂，其作用是保持原生质体膜的稳定，避免破裂。
常用的两种系统为：①糖溶液系统：包括甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等，浓度约在0．40～0．80mol／L。
本系统还可促进分离的原生质体再生细胞壁并继续分裂；②盐溶液系统：包括KCL、MgSO4和KH2PO4等。
其优点是获得的原生质体不受生理状态的影响，因而材料不必在严格的控制条件下栽培，不受植株年龄的影响，使某些酶有较大的活性使原生质体稳定。
另外，添加牛血清蛋白可减少或防止降解壁过程中对细胞器的破坏。
近年来多采用在盐溶液内进行原生质体分离，然后再用糖溶液作渗透稳定剂的培养基中培养。
通常在酶液中使用的等渗剂为0．55～0．6mol甘露醇。
原始pH值提高到7．0时生活的原生质体数量进一步增加，损伤的原生质体也少得多。
原生质体纯化常用过滤和离心相结合的方法，步骤大致如下：
1．将原生质体混合液经筛孔大小为40－100um的滤网过滤，以除去未消化的细胞团块和筛管、导管等杂质，收集滤液。
2．将收集到的滤液离心，转速以将原生质体沉淀而碎片等仍悬浮在上清液中为准，一般以500r／min离心15min。
用吸管谨慎地吸会上清液。
3．将离心下来的原生质体重新悬浮在洗液中（除不含酶外，其他成分和酶液相同），再次离心，去上清液，如此重复三次。
4．用培养基清洗一次，最后用培养基将原生质调到一定密度进行培养。
一般原生质体的培养密度为104～106／ml。
灵芝原生质体制备与再生方案
灵芝原生质体制备与再生方案
1.菌种活化5-7d。
2.活化的菌种摇瓶发酵培养4-5d(可溶性淀粉培养基，or PDA)。
3.发酵液转至30 mL离心管内，4000rpm离心10 min，弃上清，用
0.6 M甘露醇清洗3次后，分装至2 mL离心管内，同时取少量菌
丝体进行镜检。
4.按每30 mg 湿菌丝加l mL 酶液（2%溶壁酶）, 于30 ℃酶解1.5h，
2h，2.5h（每个样品重复3次）。
5.酶解后，滤液500rpm离心2次，去除菌丝段；3000rpm离心10 min,
沉淀用0.6 M甘露醇清洗离心2次，并用血球计数板计算原生质体数。
6.取制备好的原生质体涂皿（1mL/皿）。
再生培养基（纤维二糖）：
纤维二糖1.5% , 蛋白胨0.2% , 酵母粉0.4% , 溶于0.6 M甘露醇中。
准备工作：
1.配置0.6M和2 M甘露醇
2.酶解液：2%溶壁酶（用无菌水溶解后，加入2 M甘露醇使其终浓度达到0.6 M）
3.可溶性淀粉培养基
4.纤维二糖再生培养基
5.用具：2 mL离心管，30 mL圆底离心管，1mL及5mL枪头，血球计数板。
植物细胞原生质体的制备与融合
植物细胞原生质体的制备与融合。
1、相关概念：（1）原生质体：是指那些已去除全部细胞壁的细胞。
细胞外仅由细胞膜包裹，呈圆形，要在高渗液中才能维持细胞的相对稳定。
此外，在酶解过程中残存少量细胞壁的原生质体称为原生质球或球状体。
（2）原生质体融合：即体细胞杂交。
用人工的方法，把分离的不同品种或不同种的原生质体诱导成融合细胞，再经离体培养诱导分化和再生完整植株的整个过程。
若取材为体细胞，则成为体细胞杂交。
2、原生质体的制备：在植物组织里，原生质体被坚硬的细胞壁包裹着，而且由于果胶质等使细胞相互紧紧粘连在一起。
在愈伤组织中，这种粘连相对松些；在细胞悬浮培养物中，只有存在细胞团的情况下，有轻度的粘连。
如果破除这种粘连作用，即可使细胞分离开来，进一步去除细胞壁，就能使裸露的原生质体游离出来。
游离效率的高低主要与植物材料和酶混合浓的组成有关。
基本程序如下：取材→除菌→酶解（加酶、渗透压稳定剂）→原生质体的收集与纯化→洗涤→原生质体活力的测定。
（1）取材与除菌：原则上植物任何部位的外植体都可成为制备原生质体的材料。
但人们往往对活跃生长的器官和组织更感兴趣。
因为，由此制得的原生质体一般都生活力较强，再生与分生比例较高。
常用的外植体包括：种子根、子叶、下胚轴、胚细胞、花粉母细胞、悬浮培养细胞和嫩叶。
对外植体的除菌要因材而异，悬浮培养细胞一般无需除菌。
对较脏的外植体往往要先用肥皂水清洗再以清水洗2-3次，然后浸入70%酒精消毒后，再放进3%次氯酸钠处理。
最后用无菌水漂洗数次，并用无菌滤纸吸干。
（2）酶解：现以叶片为例说明如何制备植物原生质体。
①配制酶解反应液:反应液应是一种pH值在5.5-5.8的缓冲液，内含纤维素酶0.3%-3.0%以及渗透压稳定剂，细胞膜保护剂和表面活性剂等。
③酶解：除菌绿。
反应液转绿是酶解成功的一项重要指标，说明已有不少原生质体游离在反应液中。
经镜检确认后应及时终止反应，避免脆弱的原生质体受到更多的损害。
真菌原生质体制备技术
真菌原生质体制备技术
1．灭菌物品：
（1）大滤纸:
（2）灭菌针筒（含脱脂棉和玻璃钎维）
（3）脱脂棉
（4）离心管
（5）无菌ddH2O
（6） 0.6M MgSO4
（7）培养基：
A. 等渗培养基（RCM）：麦芽汁1%，酵母膏1%，蛋白胨0.4%，葡萄糖0.4%，pH自然，用0.6M蔗糖配制。
B. 破膜培养基：麦芽汁1%，酵母膏1%，蛋白胨0.4%，葡萄糖0.4%，pH自然，用水配制。
也可以采用含有0.6M蔗糖的PDA作为等渗培养基，破膜培养基不加0.6M蔗糖即可。
（8）溶壁酶酶液：1.5%，用0.6MMgSO4配制，过滤除菌；
（9）培养皿：根据样品个数
2．制备方法：
（1）称取离心管重量并记录；
（2）用接种针挑出菌丝，并用灭菌双蒸水冲洗一次，然后用无菌的0.6M MgSO4冲洗两次，用灭菌的滤纸吸干，放入已知重量的离心管，称重并记录；
（3）计算得到菌丝重量，按0.2（g）：1(mL)加入灭菌酶液，震荡均匀；
（4） 28℃，3~4小时，摇床震荡（轻微），酶解，同时每30min镜检观察原生质体数量；
（5）灭菌注射器（含脱脂棉和玻璃钎维）过滤；
（6）离心：2500rpm,2min
（7）用0.6M MgSO4洗涤沉淀3次；
（8）用用0.6M MgSO4定容至最初的加酶量；
（9）镜检计数；记录；
（10）涂板后再生培养，第7天后每隔1天计数一次。
一种酵母原生质体的制备方法(一)
一种酵母原生质体的制备方法(一)
一种酵母原生质体的制备方法
引言
酵母原生质体是研究酵母生物学和细胞功能的重要工具。
本文将详细介绍一种酵母原生质体的制备方法，包括材料和步骤。
材料
•酵母菌株
•酵母培养基
•液氮
•酶（如裂解酶）
•加压破碎机
步骤
1.酵母菌株的培养
–选取合适的酵母菌株，并在适宜的酵母培养基中培养。
–确保培养条件适宜，包括温度、pH值和营养物质。
2.收获酵母菌细胞
–将培养好的酵母菌细胞收获到离心管中。
–使用低温和高速离心将酵母菌细胞沉淀到管底。
3.冻存酵母细胞
–将收获到的酵母菌细胞用液氮快速冷冻保存。
–这样可以保持细胞的完整性和活力。
4.酵母细胞的裂解
–从冻存酵母菌中取出适量细胞液。
–加入适量的裂解酶，在恰当的温度下孵育制备酵母细胞裂解液。
5.原生质体的制备
–将酵母细胞裂解液加入加压破碎机。
–根据设备要求进行适当压力和时间的制备。
6.分离原生质体
–经过加压破碎机后，从制备好的原生质体悬浮液中轻轻吸取上清液。
–上清液中富集了酵母原生质体。
7.原生质体的储存
–将得到的酵母原生质体储存于低温条件下，如冰箱等。
–注意保持原生质体的稳定性和活性。
结论
本文介绍了一种酵母原生质体的制备方法，该方法可以有效地从酵母菌株中制备出具有活性和稳定性的原生质体。
通过这种方法，可以为酵母生物学和细胞功能的研究提供有力的工具。
以上是详细的酵母原生质体制备方法，我们希望本文能对该领域的研究者和实验室工作者有所帮助。
制备原生质体+细胞裂解
1、酶解将撕去下表皮的叶片剪成小块，放在盛有5mL酶液的小培养皿中，让去除下表皮
的一面接触酶液，辅满一层，在25~28℃下酶解60~90分钟。
2、酶液配制为：1.5%(w/v)纤维素酶，0.3%(w/v)果胶酶，5mmol/LMES，0.6mol/L甘露醇，
5mmol/L氯化钙；pH 5.8。
离心浓缩细胞悬浮液，将细胞放到培养皿中进行酶解。
材料和酶液体积是1：10，时间3~6小时，因为是细胞所以酶解3小时怎么样？或者让它过个夜，温度25摄氏度。
在暗光或避光条件下进行。
还要用到你的小摇床…
3、收集纯化
（1）用吸管将酶解液吸至5mL离心管中，以600rpm离心5分钟以上，使原生质体沉降
（2）将上清（酶解液）回收，剩下原生质体及残渣于管底
（3）加氯化钙液约2mL，轻轻吹打均匀
4、A.用液氮冻融三四次，细胞冻住后，37摄氏度水浴。
溶解后震荡再冻。
B.至少三次以上冻融。
C.-20摄氏度一下冻融再室温溶解，反复几次，细胞结构破裂。
2 植物原生质体制备
实验二、植物原生质体制备
实验二、植物原生质体制备
1 材料与方法
1.1 材料
前一周培养的海藻籽发芽嫩叶及实验室准备的百合或者大花萱草花瓣。
实验在北京市北京科技大学理化楼120进行。
1.2 方法
1.2.1 试剂配制
将0.6mM 甘露醇、8m MCaCl2、7mM NaH2PO4•H2O、3mM MES加于干净的锥形瓶中，调节pH至5.6，配制成原生质体分离的母液。
在对实验材料进行酶解前，加入1.0%纤维素酶及0.6%离析酶。
去离子水处理材料作为对照。
1.2.2 材料酶解及观察
先将幼嫩的海藻叶片取下至小培养皿中，并尽量剪碎；用镊子尖头撕去花瓣表皮，另一小培养皿中尽量剪碎花肉。
取1ml加入酶的母液于离心管中，取少许剪碎的实验材料在室温下摇床振荡（40rpm）酶解2小时，每隔30min取少许溶液制片，显微镜观察原生质体的细胞形态并拍照（要注明放大倍数，以目镜×物镜倍数表示，如10×40）。
同时进行对照的观察，注意与对照进行比较。
2 结果与讨论
1。
水稻原生质体制备及转化实验方法
单子植物叶片原生质体分离与转化水稻原生质体分离及转化1.需要准备的器材名称名称名称剃须刀片40um尼龙膜0.45um滤膜玻璃皿血球计数板真空泵及适配器70mm培养皿或100ml锥形瓶离心机（水平转子）滤布圆周摇床2ml圆底管10/50ml注射器50ml圆底离心管六孔板2.材料准备水稻种子，先用75%乙醇漂洗1分钟，再用30%次氯酸钠处理20分钟，无菌水洗涤5次以上。
放在1/2 MS培养基上培养2周左右，26℃，12h光照（150 umol m-2s-1）。
使用大玻璃培养杯培养，每瓶可放15粒种子。
40~60株幼苗可以做一次实验，分离出的原生质体量可以转化大约6个质粒。
3.原生质体分离（1）选取幼苗茎干和叶鞘部分分离原生质体，去除水稻顶部的叶子和茎干小的叶鞘，用锋利的刀片切成大约0.5mm宽的条块，可以20~30个放在一起切开；比例大约15ml酶解液/1g材料；（2）切开后立刻转移到0.6M Mannitol溶液中，避光放置10分钟；（3）过滤掉Mannitol溶液，将其转移到配好的酶解液中，避光，真空泵-15~-20 (inHg)抽真空30分钟；（3）再避光酶解5-6小时，同时缓慢摇动（圆周摇床，速度40）；（5）酶解结束后，加入等体积的W5溶液，稍有力地用手水平摇动10秒钟，释放原生质体；（6）使用40um尼龙膜过滤原生质体到50ml的圆底离心管中，再加W5溶液冲洗条块；（7）250 g水平离心3分钟沉淀原生质体，用5 ml移液器吸出上清；（注：离心机需采用水平转子，且升降速不可超过3，否则细胞可能破碎，以下所有离心步骤均需采用此设置。
）（8）加10ml W5重悬原生质体，250g离心3分钟，弃上清；（9）加适量MMG溶液重悬，原生质体浓度为2*106/ml，血球计数器计数。
（注：1、吸取原生质体所用枪头均需剪去枪头尖以防其对细胞造成伤害；2、以上所有步骤在室温进行。
）4.原生质体转化（1）加入10~20ug质粒到2ml离心管中，加入200ul原生质体（大约4*105细胞），再加入220ul新配的PEG溶液，混匀，室温避光放置10~20分钟诱导转化；（2）诱导转化结束后缓慢加880ul W5溶液，轻轻颠倒混匀，250g水平离心3分钟，弃上清；（3）加1ml WI溶液重悬，转移到六孔板中（已预先加入1ml WI溶液）室温（或28℃）暗处培养6~16小时，若用于提取原生质体基因组DNA，需培养48小时。
原生质体制备试剂
原生质体制备试剂原生质体是一种无细胞壁的细胞结构，广泛存在于植物和动物细胞中。
由于其具有高度可溶性和膜通透性的特性，原生质体常被用于制备各种试剂。
本文将介绍原生质体制备试剂的方法和应用。
一、原生质体制备方法1. 细胞裂解法：将植物或动物组织加入裂解缓冲液中，通过机械方法（如超声波破碎、搅拌等）或化学方法（如酶解、酸碱处理等）使细胞壁破裂，释放出原生质体。
2. 离心法：将植物或动物组织进行离心分离，分离出含有原生质体的上清液。
3. 渗透法：通过调节渗透压使细胞膜溶胀，从而释放出原生质体。
4. 超滤法：利用超滤膜对细胞组织进行过滤，将原生质体截留在滤液中。
5. 分离培养法：通过细胞培养技术，将细胞分离培养，使原生质体在培养基中自由生长。
1. 酶活性测定：原生质体中含有多种酶，可以用于测定酶的活性。
例如，通过测定原生质体中过氧化物酶的活性，可以评估细胞氧化应激水平。
2. 蛋白质分析：原生质体中富含蛋白质，可以用于蛋白质的纯化和分析。
例如，可以通过原生质体制备试剂提取植物叶片中的叶绿素结合蛋白。
3. 药物筛选：原生质体可以用于药物的筛选和评估。
例如，通过测定原生质体对某种药物的敏感性，可以评估药物的毒性和疗效。
4. 细胞生物学研究：原生质体可以用于细胞生物学研究中的多个方面，如细胞分裂、细胞运动等。
例如，通过观察原生质体在不同条件下的形态变化，可以研究细胞的运动机制。
5. 基因工程：原生质体可以用于基因工程中的多个方面，如基因转染、基因表达等。
例如，可以利用原生质体制备试剂将外源基因导入植物细胞，实现基因的转染。
三、原生质体制备试剂的优势1. 高度可溶性：原生质体中的物质具有高度可溶性，便于提取和分析。
2. 膜通透性：原生质体的细胞膜具有较好的通透性，便于物质的进出。
3. 多功能性：原生质体中含有多种生物大分子，如蛋白质、核酸等，适用于多个领域的研究。
4. 细胞完整性：原生质体制备试剂可以保持细胞的完整性，不会破坏细胞内部结构。
细菌原生质体的制备
细菌原生质体的制备要求：1、写出完整的原生质体的制备的实验操作步骤2、写出分离培养基及相关试剂所需的量、仪器和器皿所需的数量。
说明：通过实验一获得出发菌（细菌）之后，第二周再对该菌进行诱变，第三周再进行该菌的碳源谱、及抗药性测定（链霉素或青霉素），第四周再制备原生质体。
培养基与试剂(1) 分离培养基采用牛肉膏蛋白胨固体培养基加0.2%可溶性淀粉即牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、可溶性淀粉2g溶于1000mL蒸馏水中再加入15g琼脂粉pH调至7.2121℃灭菌15min待冷却至50℃左右时于超净工作台倒平板。
注:先将可溶性淀粉加少量蒸馏水调成糊状再加到溶化好的培养基中调匀; (2) 分离培养基液体培养基采用牛肉膏蛋白胨固体培养基加0.2%可溶性淀粉,即牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、可溶性淀粉2g溶于1000mL蒸馏水中pH调至7.2,121℃灭菌15min。
(3) 检测试剂,路戈氏碘液,碘片1g,碘化钾2g,蒸馏水300mL。
配制方法:先用少量35mL蒸馏水溶解碘化钾,再加入碘片,待碘片完全溶解后,加水稀释至300mL于棕色瓶内备用.实验方法: 1. 微生物的分离; 用梯度稀释法来分离淀粉酶产生菌。
取所采的土样5g加入到三角瓶中,加入无菌水45mL,30℃摇床振荡30min制成土壤悬液,此时的稀释度为10-1。
另取7支试管分别记作10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8共8个梯度每支试管内加入9mL无菌水。
用无菌移液管从三角瓶中吸取1mL土壤悬液加入到10-2试管中混匀,再从此试管中吸取1mL加入到10-2试管中,依此类推直至10-7试管。
分别从10-6、10-7、10-8三个稀释度的试管中吸取100uL悬液,均匀涂布于分离培养基平板上,于30℃培养36h等长出菌落后,将检测试剂卢戈氏碘液加入到平板中,菌落周围形成水解圈的菌株即是产淀粉酶的菌株,因淀粉遇碘变蓝色,如菌落周围有无色圈说明该菌能分解淀粉。
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原生质体制备方法
培养基：
①PDA：200g土豆、20g葡萄糖、20g琼脂、1L水
②MYG液体培养基：5g麦芽糖、5g酵母提取物、10g葡萄糖、1L水、
③MYG液体再生培养基：5g麦芽糖、5g酵母提取物、10g葡萄糖、蔗糖、1L水、
④MYG软再生培养基：5g麦芽糖、5g酵母提取物、10g葡糖糖、8g琼脂粉、蔗糖、试剂：
①1mol/L MgSO4
②L MgSO4
③STC：山梨醇、50mM Tris-Hcl（）、50mM CaCl2
④肝素
⑤SPTC：山梨醇、40% PEG、50mM Tris-Hcl（）、50mM CaCl2
⑥无菌水
操作步骤：
①倒若干PDA平板，将GF-WT接入PDA平板，23℃，活化5-7days
②用无菌黄枪头在GF-WT平板上打孔，用长牙签挑出4个菌饼接入50ml/瓶的MYG
液体培养基中，120rmp，28℃，12h
③以10%的接种量接5瓶以上50ml/瓶的MYG液体培养基中，60rpm，28℃，16h
④混有大量悬浮菌丝的培养基用无菌的带有三层擦镜纸的漏斗过滤下来，用无菌
水和1mol/L MgSO4各冲洗三次，菌丝发白即可，冰上备用
⑤酶解体系的配制：取Dryslase 45mg+Yartlase105mg至无菌量管中，用10ml
1mol/L MgSO4溶解彻底，用无菌滤头和针筒过滤除菌，滤液保存于冰上
⑥1g菌丝加入到10ml酶解体系中，于无菌三角瓶中进行酶解反应，30℃，60rpm，
3h
⑦用带有无菌滤布的漏斗过滤酶解液，滤液用无菌50ml大管收集，用20ml L MgSO4
冲洗三角瓶和漏斗，3500rpm，10min，取上清
⑧沉淀用20ml STC溶解悬浮，3500rpm，10min，取上清
⑨沉淀下来的原生质体用800μL STC溶液悬浮，并加入200μL的SPTC溶液，加
入SPTC时一滴一滴加，混匀后镜检计数，大于107可用，冰上备用。