植物原生质体培养

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植物原生质体培养(PPT)

植物原生质体培养(PPT)

杨树原生质体培养植株再生
Liquid MS+5 M 2,4-D;
MS+10 M KT or 1 M TDZ.
杨树原生质体培养植株再生
1/2 MS
原生质体的培养方法
•1. 液体浅层培养
将含原生质体的培养液倒入培养皿底部, 使其成一薄层,封口后进行培养。
含原生质体的液体 培养基
特点: 操作简单,对原生质体的损伤小; 容易添加新鲜培养基和转移培养物;
材料与酶解液的比例:2-10g/100ml酶 解液。
一般在25±2℃、黑暗中酶解,期间轻 轻摇动几次,或放在50rpm的摇床上。 酶解时间因材料而异,2小时~十几小时。
苜蓿叶片的酶解法分 离原生质体
三、原生质体的收集与纯化
1. 过滤:酶解结束后,将酶解物通过孔径为2080µm的不锈钢筛网过滤,除去未被酶解的组 织块和细胞团。
苜蓿叶片原 生质体的纯 化
完整的原生质体
5. 收集原生质体:
完整的原生质体
四、原生质体活力的测定
原生质体活力的高低对后来的原生质 体培养和融合影响极大。原生质体分离 过程中的任何一个步骤都会影响到原生 质体的活力,因此,必须十分小心。测 定原生质体活力的方法常用荧光素双醋 酸酯(FDA)染色法。
2. 离 心 : 滤 液 转 到 离 心 管 中 在 50×g 下 离 心 5min。
3. 反复洗涤:离心结束后,弃去上清液,用培 养基和原生质体洗液重新悬浮沉淀的原生质 体,再离心。如此反复2-4次,就可以将残留 的酶液去掉。
4. 纯化:用含高浓度(21%)蔗糖的培养基进 行离心、纯化,完整的原生质体漂浮在上清 液的上部。
一、 材料的选择
用于分离原生质体的植物材料应是细胞分 裂旺盛的材料,如幼嫩小苗的根、胚轴、子

第九章++植物原生质体培养

第九章++植物原生质体培养

(五)复杂有机物
在原生质体培养中,常加入一些复杂有机物, 可以不同程度的提高再生细胞分裂频率,促进细胞 团的形成。 常用的有机物有谷氨酰氨、水解乳蛋白、水解 酪蛋白、肌醇、椰乳、酵母浸出物等。
二、培养方法
原生质体培养一般采用液体培养的方法,因为: (一)液体浅层培养
(二)平板法培养
(三)悬滴法培养 (四)固液结合培养法
的压力。
(一)渗透压保护剂
(二应注意的问题
(一)渗透压保护剂
原生质体分离及培养过程中渗透压的调节通常 利用糖或糖醇来控制, 常用的渗压剂有甘露醇、山梨醇、葡萄糖和蔗 糖,其中甘露醇和山梨醇或其组合最常用。叶原生 质体分离时最常用的为甘露醇(浓度为 0.23~0.90M)。 有效的渗透浓度决定于原生质体分离期间叶细 胞的渗透压。内源细胞渗透压明显地受环境条件的 影响,并且能够用暗处理植株和幼叶组织等措施加 以控制。
三、酶处理
1、原生质体分离在很大程度上取决于所用酶的性质 和浓度 ,因此要做好酶种类、处理浓度的选择。 2、酶处理的适宜条件 (1)pH值 酶的活性与pH有关,用于分离原 生质体的大多数酶适宜的PH为4.7-6.0 。 (2)温度 对用来分离原生质体的酶类来说, 最适温度是40~50℃,但分离原生质体时以25~30℃ 为宜。 (3)光照 通常在黑暗或在低光强下分离原生 质体。
(二)应注意的问题
1、在酶处理液、原生质体清洗介质及原生质体 培养基中必须加入合适的渗透压保护剂。 2、原生质体在轻微高渗溶液中比在等渗溶液中 稳定。较高水平的渗透压虽可阻止原生质体破裂, 但影响细胞的代谢、分裂和生长。 3、在分离原生质体时,可以使用电解质渗压剂, 但在原生质体培养时一般不用。 4、当用非电解质为渗压剂时,在酶液中加入某 些盐类,如Cacl2、KH2PO4、葡聚糖硫酸钾,可以 提高质膜的稳定性。

植物原生质体培养条件

植物原生质体培养条件

植物原生质体培养条件
1. 植物原生质体培养条件很关键啊!就像宝宝需要合适的环境才能茁壮成长一样,原生质体也得有它的“温馨小窝”呀!比如说,合适的培养基不就是它的“营养大餐”嘛!
2. 你知道吗,温度对植物原生质体培养超重要!这就好比我们人在太冷或太热的环境里会不舒服,原生质体也一样啊!想想看,要是温度不合适,那会怎样呢?
3. 光照也是个大问题呀!植物原生质体需要恰到好处的光照呢,这就像是我们需要阳光带来的温暖和能量一样,没有合适的光照,它能长得好吗?
4. 植物原生质体培养的湿度条件可不能忽视!这就跟我们需要适宜的空气湿度一样,太干或太湿都不行呀,这多重要啊!
5. 激素在植物原生质体培养中可是起着大作用呢!就如同我们身体里的某些物质能调节我们的生长发育,激素对原生质体也是如此啊,你说神奇不神奇?
6. 氧气对植物原生质体培养也是必不可少的呀!我们人没了氧气不行,原生质体也需要氧气来“呼吸”呀,这不是很明显的道理嘛!
7. 无菌环境简直太重要啦!这就像我们要生活在干净卫生的地方,原生质体也需要一个无菌的“家”,不然会怎样呢,想想都知道后果很严重啊!
8. 培养器皿的选择也有讲究呢!就好像我们要找一个舒服的房子住,原生质体也得有个合适的“容器房子”呀,这多关键呀!
9. 培养时间也得把握好呀!不能太短也不能太长,这就像做饭要掌握好火候一样,太着急或太磨蹭都不行,是不是这个理儿?
10. 操作技术也是很重要的一环呢!熟练的操作就像是给原生质体培养上了一道保险,要是操作不当,那可就前功尽弃啦,这可不是开玩笑的呀!
我的观点结论:植物原生质体培养条件真的是每一项都不容忽视,都得认真对待,只有这样才能培养出健康的原生质体呀!。

原生质体培养名词解释

原生质体培养名词解释

原生质体培养名词解释原生质体培养是一种常用的植物组织培养技术,用于繁殖植物和研究植物基因转化等问题。

本文将介绍原生质体培养的定义、原理和应用等方面的名词解释。

下面是本店铺为大家精心编写的4篇《原生质体培养名词解释》,供大家借鉴与参考,希望对大家有所帮助。

《原生质体培养名词解释》篇11. 原生质体(Protoplast)原生质体是指从植物细胞中除去细胞壁后剩余的细胞质部分,包括细胞膜、质体、线粒体、质体小体、微管和微丝等细胞器。

原生质体是一个高度液态的细胞质体系,其形态和功能类似于一个微小的细胞。

原生质体可以通过融合实现远缘杂交,从而扩大植物遗传资源的利用范围。

2. 原生质体培养(Protoplast Culture)原生质体培养是指将离体的植物原生质体在适当的培养基上进行培养,以获得再生的植物组织或细胞。

原生质体培养的主要目的是通过原生质体的融合,克服远缘杂交障碍,实现植物遗传资源的利用和改良。

3. 原生质体融合(Protoplast Fusion)原生质体融合是指两个或多个原生质体合并成一个细胞的过程。

原生质体融合可以通过电激、化学处理或生物方法等手段诱导。

融合后的细胞称为杂种细胞,可以用于植物遗传资源的利用和改良。

4. 再生(Regeneration)再生是指通过培养技术,使离体的植物组织或细胞重新分化、再生为新的植株或组织。

再生是原生质体培养的重要应用之一,也是植物组织培养技术的基础。

5. 遗传转化(Genetic Transformation)遗传转化是指将外源基因或基因组导入植物细胞内,并使其表达的过程。

遗传转化是植物基因工程的重要组成部分,也是原生质体培养的应用之一。

通过原生质体培养技术,可以将目的基因导入植物细胞内,并实现植物的遗传转化。

6. 植物组织培养(Plant Tissue Culture)植物组织培养是指将离体的植物组织或细胞在适当的培养基上进行培养,以获得再生的植物组织或细胞。

植物原生质体培养

植物原生质体培养

原生质体的培养1. 原生质体的分离与纯化原生质体培养的意义(1)再生植株由原生质体再生生成植株,不论在进行有关细胞生物学或生物合成和代谢的实验研究上,还是在组织培养实践中,都有一定的优点:①可利用均一的分化细胞群体;②因无细胞壁,试剂对细胞作用更为直接,其反应能直接测量,以使反应产物能较快的分离出来;③在理论和实践中,可极大节省空间,如在一个三角瓶就能培养210个细胞,但在大田种植需要4亩地;④可缩短实验周期,如悬浮培养时仅需1~2个小时。

原生质体培养可在遗传学方面进行基因互补,不亲和性,连锁群和基因鉴定,分析基因的激活和失活水平的研究。

在研究分化问题时,用一个均一的原生质体群体可以筛选数以千计的不同。

营养和激素条件,探索诱导单细胞的分化条件等。

(2)用于远缘体细胞融合,进行体细胞杂交。

这是一种新的远缘杂交方法,为人们提供新的育种方法。

两个亲缘关系较远的植株用一般杂交方法是不容易成功的,而用细胞融合的方法却成为可能。

首先,两个原生质体融合形成异核体,异核体再再生细胞壁,进行有丝分裂,发生核融合,产生杂种细胞,由此可培养新的杂种。

一、原生质体(protoplast)的分离(一)材料来源原生质体是通过质壁分离与细胞壁分开的部分,是能存活的植物细胞的最小单位。

自从1960年用酶法制备大量植物原生质体首次获得成功以来,原生质体培养成为生物技术最重要的进展之一。

通过大量的试验表明,没有细胞壁的原生质体仍然具有"全能性",可以经过离体培养得到再生植株。

原生质体的分离研究较早,1892年Klereker首先用机械的方法分离得到了原生质体,但数量少且易受损伤。

1960年,英国植物生理学家Cocking首先用酶解法从番茄幼苗的根分离原生质体获得成功。

他使用一种由疣孢漆斑菌培养物制备的高浓度的纤维素酶溶液降解细胞壁。

然而,直至1960年纤维素酶和离析酶成为商品酶投入市场以后,植物原生质体研究才成为一个热门的领域。

第八章植物原生质体培养

第八章植物原生质体培养
第八章 植物原生质体培养
一、原生质体的分离 二、原生质体的纯化 三、原生质体的培养方法 四、影响原生质体培养的因素 五、原生质体再生
原生质体: 原生质体:指脱去植物细胞壁 后裸露的、有生活力的原生质团。 后裸露的、有生活力的原生质团。 和植物正常细胞相比,除了没有细 和植物正常细胞相比, 胞壁外,具有活细胞的一切特征。 胞壁外,具有活细胞的一切特征。
封口后,离心, 封口后,离心,原生质体漂浮在上面
用吸管收集原生质体液面, 用吸管收集原生质体液面,放入液体培养基 或甘露醇悬浮洗涤原生质体2-3次 或甘露醇悬浮洗涤原生质体 次
将原生质体悬浮在液体培养基中备用
漂浮法的优点: 漂浮法的优点:原生质体纯度高。 缺点:原生质体收率低。 缺点:
3、不连续梯度法 、
(2)酶分离法 )
两步法: 两步法:
果胶酶处理材料
优点:
所获得的原生质 体均匀一致、 体均匀一致、质 量好; 量好;
游离出单细胞
纤维素酶处理单细胞
缺点:
操作复杂, 操作复杂,已被 淘汰。 淘汰。
分离出原生质体
一步法
外植体
酶液配制:注意纤维素酶、 酶液配制:注意纤维素酶、果胶酶和渗 透压稳定剂(甘露醇)的配比及pH 透压稳定剂(甘露醇)的配比及 酶液离心 过滤灭菌后-20℃ 过滤灭菌后 ℃保存 外植体放入酶液, 外植体放入酶液,真空泵抽引渗透处理 26℃摇床振荡2-8小时 ℃摇床振荡 小时
3、原生质体的分离方法 、
首先对外植体进行预处理,有两种方法: 首先对外植体进行预处理,有两种方法:
低温处理:外植体放在4℃下,黑暗中1-2天。 外植体放在 ℃ 黑暗中 天 等渗溶液处理:外植体放在等渗溶液中数小时。 外植体放在等渗溶液中数小时。

植物原生质体培养的技术流程

植物原生质体培养的技术流程

植物原生质体培养的技术流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成,希望大家下载以后,能够帮助大家解决实际的问题。

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植物原生质体培养名词解释

植物原生质体培养名词解释

植物原生质体培养名词解释嘿,朋友们!今天咱来唠唠植物原生质体培养这档子事儿。

你说这植物原生质体培养啊,就好比是给植物来一场特别的“变身之旅”。

植物细胞大家都知道吧,就像一个小小的城堡,外面有厚厚的城墙,那就是细胞壁啦。

而原生质体呢,就是去掉了这层城墙之后的精华部分。

想象一下,植物就像是一个有好多宝贝的大箱子,细胞壁就是那箱子的外壳。

咱们把外壳去掉,不就能更直接地接触到里面的宝贝啦?原生质体培养就是这么个道理呀。

这原生质体培养有啥用呢?用处可大啦!它能让我们更好地了解植物的秘密呀。

比如说,我们可以通过培养原生质体,看看植物是怎么生长发育的,就像看着一个小娃娃一点点长大一样。

而且啊,这还能帮我们培育出更好的品种呢!就好像是给植物来个大改造,让它们变得更厉害、更优秀。

培养原生质体可不是一件容易的事儿啊,就跟照顾小婴儿似的,得小心翼翼的。

首先得把细胞壁去掉吧,这可得有专门的技术和方法,可不是随随便便就能做到的。

然后呢,还得给它们提供合适的环境,就像给小婴儿准备温暖的小床和充足的食物一样。

培养的过程中还可能会遇到各种各样的问题呢。

哎呀,有时候就像小孩子会生病一样,原生质体也可能会出点小状况。

这时候就得靠我们这些“植物医生”啦,得赶紧想办法解决问题,让它们能健康成长。

你说这植物原生质体培养难不难?当然难啦!但这也是它有趣的地方呀。

就好像爬山,虽然过程很辛苦,但当你爬到山顶,看到那美丽的风景时,一切都值啦!咱们研究植物原生质体培养,不就是为了让植物世界变得更美好嘛。

让那些花儿开得更艳,那些树长得更高更壮。

这多有意思呀!所以啊,朋友们,可别小瞧了这植物原生质体培养。

它就像是一把神奇的钥匙,能打开植物世界的大门,让我们看到更多的奇妙和美好。

让我们一起加油,去探索这个充满神秘和惊喜的植物原生质体培养的世界吧!怎么样,是不是很有意思呢?。

第八章第九章植物原生质体培养与体细胞杂交ppt课件

第八章第九章植物原生质体培养与体细胞杂交ppt课件

烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的 健康皮 肤进行 自体移 植,但 对于大 面积烧 伤病人 来讲, 健康皮 肤很有 限,请 同学们 想一想 如何来 治疗该 病人
第二节 植物原生质体培养的发展与意义
原生质体的培养技术,近年来也有很大改进,特别 值得指出的是单个原生质体培养再生植株的成功 (Spangenberg等,1986)。
利用这一技术,可以在单细胞水平上研究不同类型原 生质体的生理特性,相互之间的作用以及单个原生质体 的遗传操作。对不同亲本单个原生质体进行融合的研究 也是有利的(Schweigo等,1987)。
饲养层培养法可大大提高水稻(Kyozu等,1987)、 玉米(Rhodes等,1988)等作物原生质体的植板率。 已有不少报道说明,琼脂糖能促进原生质体的分裂 (Shillto等,1983),并有利于对原生质体生长过程 的观察。
第一节
植物原生质体的定义及特点
(5)能摄取外来物质,可作遗传转化工具。
外来物质如核酸、蛋白质等高分子物质乃至病毒、 叶绿体、细胞核和细菌等,是进行遗传转化研究的 理想工具。
(6)变异为单细胞,变异性状易纯。
原生质体在培养中会发生变异,由于其是纯粹单 细胞,因此变异原生质体再生植株的变异性状会更 纯。
第三节 植物原生质体培养方法
2、酶法分离原生质体: 即用细胞壁降解酶,脱除植物细胞壁,获得原生
质体的方法(Cocking,1960)。目前多用此法。 常用的细胞壁降解酶种类有:纤维素酶、半纤维
素酶、果胶酶、R-10(日本纤维素酶)、蜗牛酶 胼胝质酶、EA3-867酶等。 国内常用EA3-867酶是一种复合酶,其成分含 纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶(上海植物生化研 究所产)。
特别是一直认为难以培养的禾谷类作物,例如,水 稻(Fujimura等,1985)、玉米(蔡起贵等,1987; Rhodes等,1988)、小麦(Harris等,1988;王海 波等,1989)、谷子(夏镇澳等,1989),以及高粱 的原生质体培养都已相继成功。

植物原生质体提取培养1

植物原生质体提取培养1

实验原理:植物原生质体是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞”,是开展基础研究的理想材料。

其中酶解法分离原生质体是一个常用的技术,其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成,因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分,除去细胞壁。

许多化学、物理学和生物学方法可诱导原主质体融合,现在被广泛采用并证明行之有效的融合方法是聚乙二醇(PEG)法。

高Ca高pH法和电融合法:PEG作为一种高分子化合物,20~50%的浓度能对原生质体产生瞬间冲击效应,原生质体很快发生收缩与粘连,随后用高Ca高pH法进行清洗.使原生质体融合得以完成。

PEG诱导融合的机理:PEG由于含有醚键而具负极性,与水、蛋白质和碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键,当PEG分子足够长时,可阼为邻近原生质表面之间的分子桥而使之粘连。

PEG也能连接Ca2+等阳离子,Ca2+可在一些负极化基团和PEG之间形成桥,因而促进粘连。

在洗涤过程中,连接在原生质体膜上的PEG分子可被洗脱.这样将引起电荷的紊乱和再分布.从而引起原生质体融合:高Ca高pH由于增加了质膜的流动性,因而也大大提高了融合频率,洗涤时的渗透压冲击对融合也可能起作用。

原生质体分离纯化或融合后,在适当的培养基上应用合适的培养方法,能够再生细胞壁,并启动细胞持续分裂,直至形成细胞团,长成愈伤组织或胚状体,再分化发育成苗。

其中,选择合适的培养基及培养方法是原生质体培养中最基础也是最关键的环节。

[实验内容] 1.原生质体分离2.原生质体融合3.原生质体及融合体的培养材料用品:三角瓶、离心管、烧杯、200目滤网、解剖刀、长、短镊子、培养皿、滤纸、0.2μm滤膜、滤器、培养瓶(注:以上用品要进行高压灭菌)、台式离心机、高压灭菌锅、倒置显微镜、超静工作台温度25±2℃,光照度1000Lx,光照14~16h/d 的条件下培养。

培养时间约1周。

实验步骤:1.溶液及培养基的配制(1)酶液(2)PEG融合液(3)13%CPW洗液1%纤维素酶1%果胶酶0.7mol/L甘露醇0.7mmol/LKH2PO410mmol/LCaCl2·2H2O pH6.8—7.040% PEG (MW 1500-6000)0.3 mol/L葡萄糖3.5mmol/L CaCl2·2H2O0.7mm0l/L KH2PO427.2 mg/L KH2PO4101.0 mg/L KNO31480.0 mg/L CaCl2·2H2O246.0 mg/L MgSO40.16 mg/L KI0.025 mg/L CuSO413% W/V甘露醇pH 6.0(4)20%蔗糖溶液(5)黄瓜种子萌发与生根培养基(固体):1/2MS(注:MS无机成份减半,蔗糖0.2%,琼脂0.7%)(6)黄瓜原生质体形成愈伤组织培养基(固体和液体):MS+0.05mg/L NAA+1mg/L BA(MS成份见 )(7)黄瓜原生质体愈伤组织分化培养基(固体):MS+5mg/L NAA(8) 无菌蒸馏水(9) 0.1% HgCl2注:以上(1)-(4)溶液均要用孔径0.2μm滤膜过滤以除去细菌。

植物细胞培养及原生质体培养

植物细胞培养及原生质体培养
•植物细胞培养及原生质体培养
3.单细胞培养:对单离的细胞进行培养的方 法。
(1)平板培养法:分散的植物细胞接种于含薄层固 体培养基的培养皿内的培养过程称为平板培养法。。
方法是将经机械破碎过筛或酶(纤维素酶及果胶酶 等)消化分散的细胞,洗涤离心除酶,细胞浓缩物经 计数及稀释,接种到加热熔化而刚冷却至35℃左有 的固体培养基中充分混匀,倾入培养皿中,石蜡密 封,于25℃含5%CO2空气的培养箱中培养,细胞即 可生长成团。
(3) 悬浮培养特点:
培养过程中细胞总数不断增加,一定时间后产量达 最高点,生长趋于停止。然后进行移植继代培养,其过 程表现出严格可重复周期性变化,细胞增长规律与微生 物相同,有延迟期、对数生长期、减慢期及静止期等阶 段。植物细胞接种时要达到一定细胞浓度,通常为0. 25 x l0‘细胞/ml 一0. 5 x 10‘细胞/m1。
•植物细胞培养及原生质体培养
(四)细胞培养过程: 1. 择适宜的外植体; 2. 诱导疏松愈伤组织; 3. 选择适宜的培养基; 4. 悬浮培养; 5. 悬浮细胞的继代与选择; 6. 悬浮细胞的同步化; 7. 悬浮愈伤组织形成及植株再生。
•植物细胞培养及原生质体培养
水稻细胞悬浮培养及植株再生:
1.愈伤组织的诱导: (1)取水稻种子,人工去皮后用70%酒精表面消毒2 分钟,再用2.5%次氯酸钠水溶液浸泡并轻轻搅动 30分钟。 (2)将种子用无菌蒸馏水冲洗3次,按每瓶3粒接入 附加2mg/L 2,4—D、3%蔗糖、0.3%酵母提取 物的Ms固体培养基中,25℃黑暗下培养、诱导愈伤 组织。 (3) 3周后,将从胚部长出的愈伤组织切割,并转移 到新鲜培养基上继代培养,每2周继代1次。 (4)挑选疏松、易碎的愈伤组织进行继代、增殖.
•植物细胞培养及原生质体培养

植物原生质体培养的技术流程

植物原生质体培养的技术流程

植物原生质体培养的技术流程
内容:
植物原生质体培养是一种重要的植物组织培养技术,主要用于快速培养和大量繁殖目的植物的原生质体。

其技术流程主要包括以下几个步骤:
1. 选择培养原料。

选择健康、无病害的植株作为原生质体的供体,常选择嫩茎、嫩叶等组织。

2. 消毒和预处理。

使用烧瓶或培养皿,在无菌操作台进行表面消毒,然后剪切或撕取原生质体,进行预培养。

3. 建立原生质体悬浮培养系统。

将预培养的原生质体转移到含有培养基的烧瓶或培养皿中,保持液面悬浮状态培养。

4. 原生质体增殖。

在光照培养箱中培养,原生质体进行分裂增殖。

适时传代培养。

5. 原生质体发育。

当原生质体增殖到一定数量后,改变培养基成分,促进原生质体发育为细胞组织块体。

6. 组织块体生长。

继续培养,组织块体继续生长,并通过组织分化形成完整植株。

7. 移栽和驯化。

将组织块体或小植株移植到培养基中生根定植,然后
逐渐转移到土壤中,进行环境驯化,最后完全转入盆栽或野外栽培。

通过上述技术流程,可以实现大量快速培养目标植物的原生质体,并最终获得完整的植株,实现规模化种植。

植物原生质体培养技术

植物原生质体培养技术

植物原生质体培养技术原生质体含义:去掉细胞壁的由质膜包裹、具有生活力的裸露细胞。

植物原生质体培养的意义在真核生物中将遗传物质由一个个体传给另一个个体的传统方法是有性杂交。

但是有时候会存在有性不亲和。

如果通过细胞融合的手段就可以为远缘杂交提供一种可能性。

高等植物原生质体除了可用于细胞融合的研究外,还能通过它们裸露的质膜摄入外源DNA、细胞器、细菌或病毒颗粒。

原生质体的这些特性与植物细胞的全能性结合在一起,已经在遗传工程和体细胞遗传学中开辟了一个理论和应用研究的崭新领域。

一原生质体的分离1 材料来源植物原生质体最方便的来源是叶片,因为叶片中可以分离出大量的比较均一的细胞,而又不致使植物遭到致命的破坏。

由于叶肉细胞排列疏松,酶的作用很容易达到细胞壁。

植株的年龄和生长条件是十分重要的。

来源:①无菌苗②温室培养的苗培养条件:低光照强度(1000lx)、短日照、温度为20~25℃、相对湿度为60%~80% 、以及充足的氮肥供应。

2 前处理要保证酶解能充分的进行,必须促使酶溶液渗入到叶片细胞间隙中。

为此,要做到:撕去叶片的下表皮,以无表皮的一面向下,使叶片漂浮在酶液中。

或把叶片切成小块,结合真空处理效果更好。

或用金刚砂摩擦叶的下表皮。

3提取方法机械法优点:能排除酶的有害影响;缺点:(1)原生质体的产量低;(2)方法繁琐费力;(3)局限性大酶解法纤维素酶类(Cellulase)、果胶酶类(Pectolyase)半纤维素酶类(Hemicellulase)、崩溃酶、蜗牛酶注意事项:⑴酶溶剂及其渗透压酶溶剂:原生质体培养基或特殊配制。

渗透压调节剂:葡萄糖、甘露醇、山梨醇等浓度范围450~800mmol/L⑵酶处理:酶浓度酶解时间酶解温度二原生质体的纯化材料在酶液中一段时间后,轻轻振动容器或挤压叶片,使原来组织中的原生质体释放出来。

此时还有一些亚细胞碎屑,尤其是叶绿体、维管成分、未被消化的细胞和碎裂的原生质体,因此必须除去。

植物原生质体培养的技术流程

植物原生质体培养的技术流程

植物原生质体培养的技术流程一、原生质体的分离解离液的准备:解离液的组成和浓度直接影响原生质体的分离效率。

常用的解离液包含酶类,如纤维素酶和果胶酶,它们能够分解植物细胞壁。

根据不同植物材料的特性,调整酶液的浓度和pH值,确保其能有效地分解细胞壁而不损伤细胞质。

原生质体的分离与纯化:解离后,将混合液通过筛网过滤,以去除未解离的细胞碎片。

然后,将过滤后的液体转移到离心管中,以低速离心收集原生质体。

使用适当的密度梯度离心技术进一步纯化原生质体,去除细胞碎片和其他杂质。

二、原生质体的培养培养基的选择与准备:原生质体的培养需要合适的培养基,通常选择含有碳源、矿质元素、维生素和生长调节剂的培养基。

培养基的配方会根据不同植物物种和实验目的进行调整。

培养基在使用前需要经过高压灭菌,以确保无菌条件。

原生质体的接种:将纯化后的原生质体悬液接种到固体或液体培养基上。

对于固体培养基,可以将原生质体悬液均匀地涂布在培养基表面。

对于液体培养基,则将原生质体悬液直接倒入培养瓶中。

接种后,培养基应保持无菌环境,并在适宜的温度和光照条件下进行培养。

培养环境的控制:原生质体的培养环境包括温度、湿度、光照等。

一般情况下,原生质体的培养温度为2528℃,光照条件则根据植物种类和培养目的进行调整。

保持适宜的环境条件,有助于原生质体的生长和分化。

三、原生质体的再生诱导再生:在适宜的培养条件下,原生质体开始分化成愈伤组织或小芽。

根据不同植物的需求,可能需要在培养基中添加特定的生长调节剂,如细胞分裂素、赤霉素等,以促进愈伤组织或芽的形成。

转化与选择:对于转基因实验,可能需要使用农杆菌介导的转化方法将外源基因导入原生质体中。

转化后的原生质体应在选择培养基上培养,以筛选出成功转化的细胞。

选择培养基通常含有抗生素,以筛选含有抗性基因的细胞。

分化与生根:成功转化的细胞在培养基中继续生长,并开始分化为完整的植物组织。

此阶段通常需要切换到生根培养基,以促使愈伤组织或芽生根。

植物原生质体培养

植物原生质体培养

植物原生质体培养一、目的要求掌握用培养皿进行原生质体的液体浅层培养。

二、基本原理原生质体就是具有细胞质膜而没有细胞壁的植物细胞,具有全能性。

原生质体经过培养后再生出细胞壁就可进行正常的分裂生长与分化。

三、材料、试剂与主要仪器1.仪器与设备培养皿(6cm、9cm)、封口膜、温箱、培养箱、1mL定量移液器、枪头、滴管(近滴头端加入少许脱脂棉)、三角瓶、血球细胞计数器、移液管、洗耳球、无菌滤纸、漏斗、滤器、滤膜、针管(30mL),光学显微镜、酸度计或pH试纸、电子天平等。

2.试剂(1)原生质体液体培养基MS+2,4-D1mg/L+6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L+葡萄糖0.4mol/L,pH 5.8,灭菌。

(2)酚红(0.1%):称酚红2g,先用数滴5.6%的NaHCO3溶液溶解,再加进该5.6% NaHCO3溶液使最终体积为100mL,瓶装保存,备用。

3.材料制备好的菠菜原生质体。

四、实验步骤1.原生质体纯化将菠菜原生质体沉淀重新悬浮于10mL原生质体纯化液中,500rpm 下离心10min,原生质体会在蔗糖溶液的顶部形成一条绿带,用无菌吸管或移液管将原生质体转入另一离心管中。

2.原生质体清洗用原生质体洗涤液(CPW液)重新悬浮原生质体沉淀,1000rpm下离心5min,使原生质体沉淀在试管底,重复清洗一次。

之后加适量原生质体液体培养基悬浮原生质体。

3.活力检查凡具活力的原生质体均呈圆球形,在显微镜下可以观察到明显的胞质环流运动。

在叶肉原生质体中由于叶绿体的阻挡,看不清胞质环流运动。

可取一滴原生质体悬浮液放在载玻片上,加一滴0.1%的酚红染液,凡有活力的原生质体均不着色,而死去的原生质体立即染成红色。

4.密度调整用血球计数板于显微镜下计数,用液体培养基调整使原生质体浓度至105~106个/mL。

5.分装培养将调整密度后的原生质体悬浮液分装到直径6cm的培养皿中,每皿4mL,于28℃下培养,第1d是暗培养,第2~3d光照度为300Lx,以后移至光照度1500~2000Lx 条件下培养。

植物原生质体培养的关键技术

植物原生质体培养的关键技术

植物原生质体培养的关键技术植物原生质体培养是一种重要的植物组织培养技术,它可以用于植物的无性繁殖、基因工程以及育种等研究领域。

下面介绍一些关键的技术步骤和要点。

原生质体的分离和培养1. 原生质体分离:首先从植物中取得组织样本,如叶片、茎段或花器官等,并在无菌条件下进行处理。

通过切细组织样本,加入酶解液,进行酶解反应,最终获得原生质体。

2. 培养基准备:制备培养基,包括基础培养基和添加物质。

基础培养基提供必要的营养物质和能量,而添加物质则供给原生质体特殊的生长因子和激素。

培养基应在无菌条件下配制,用于培养原生质体。

3. 原生质体培养:将分离得到的原生质体放置在培养基上,以适当的温度和光照条件下培养。

培养过程中要定期观察和检查原生质体的生长状态,以及调整培养基的成分和浓度。

原生质体培养的关键因素1. 无菌技术:无菌条件下进行原生质体培养是确保培养过程成功的关键。

在分离、培养和观察过程中,都要保持严格的无菌操作,避免细菌或真菌的污染。

2. 营养物质和激素:培养基中必须提供适当的营养物质和激素,以满足原生质体的生长需求。

营养物质包括碳源、氮源、矿质盐等,而激素会促进细胞分裂和分化。

3. 光照和温度:适当的光照和温度条件对原生质体的生长和发育至关重要。

光照可以提供足够的能量,而温度则影响酶活性和代谢速率。

原生质体培养的应用1. 无性繁殖:通过原生质体培养,可以实现无性繁殖,快速繁殖大量相同的植株。

这对于育种和植物繁殖的研究非常有用。

2. 基因工程:原生质体培养可用于植物的基因工程研究,如基因表达、基因转导和功能验证等。

这为研究植物基因功能和遗传改良提供了有力手段。

3. 药物及次生代谢产物生产:某些植物的次生代谢产物对药物研发具有重要意义。

通过原生质体培养,可以大规模生产这些药物及代谢产物。

结论植物原生质体培养是一项技术复杂但应用广泛的植物组织培养技术。

通过合理控制培养条件和关注关键步骤,可以成功地进行原生质体培养,并应用于植物研究、育种和基因工程等领域。

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叶片漂浮在酶液中。 或把叶片切成小块,结合真空处理效果更好。 或用金刚砂摩擦叶的下表皮。
3 提取方法
①机械分离法(Machanical isolation) ②酶法分离(Enzymatic isolation)
①机械法
早在1892年,克莱若克(Klercker)就已采用机 械法分离原生质体。 方法:细胞放入高渗糖溶液中,质壁分离,剪碎组织, 在这个过程中,有些质壁分离的细胞只被切去了细胞 壁,从而释放出完整的原生质体。 缺点:产量低;方法繁琐费力;局限性大。分生组织 和其他液泡化程度不高的细胞中分离原生质体时不能 用此法。
f cell colonies derived from protoplast,
g proto-calli developed from protoplasts embedded in agarose,
h green shoot formation,
i fertile green plant
Protoplast culture and fertile green plant regeneration of rye.
优点:可获得大量的原生质体,几乎适用 于所有植物的器官、组织和细胞。
缺点:酶制剂由于含有核酸酶、蛋白酶、 酚类等物质,影响原生质体的活力。
注意事项: ⑴酶溶剂及其渗透压 酶溶剂:原生质体培养基或特殊配制。 渗透压调节剂:葡萄糖、甘露醇、山梨醇等 浓度范围450~800mmol/L
⑵酶处理: 酶浓度 酶解时间
界面法
①离心沉淀法
• 原理:原生质体的比重比较大,离心后原生质 体沉于底部。
• 步骤: 第一步原生质体溶液用400目网筛过滤。 第二步离心(500~1000rpm,离心5~6min)。 第三步吸去上清液,沉淀物重新悬浮,再离心 沉淀。如此2~3次。 第四步用原生质体培养液洗1次,收集原生质体。
②漂浮法
原生质体分离常用的商品酶

来源
生产厂家
纤维素酶类
onozuka R–10 绿色木霉
Yakult Honsha Co. Ltd., Tokyo, Japan
Cellulysin
绿色木霉
Calbiochem., San Diego, CA 92037, USA
Driselase 果胶酶类
Irpex lutens Kayowa Hakko Kogyo Co., Tokyo, Japan
①材料准备:植物的幼嫩部分——幼叶、根、下 胚轴,亦可用成熟叶。禾本科用愈伤组织。
②材料预处理:
叶片萎焉处理——日光下2-8小时 叶片预培养——如羽衣甘蓝诱导愈伤组织 培养基 培养7天后 预先质壁分离——糖溶液中质壁分离
③ 酶解
• 纤维素酶类(Cellulase) • 果胶酶类(Pectolyase) • 半纤维素酶类(Hemicellulase) • 崩溃酶 • 蜗牛酶
a
b
c
d
e
f
a: first division, 10 days after protoplast isolation
b,c: 2 and 3 wo microcolonies.
d,e: 4 and 6 wo microcalli
f: 8 wo microcalli just before being transferred onto B5 medium
➢原理:利用比重大于原生质体的高渗蔗糖 溶液,离心后使原生质体漂浮其上,残渣 碎屑沉到管底。
离心后碎屑沉到管底,一个纯净的原生 质体带出现在蔗糖溶液和原生质体悬浮液 培养基的界面上。
③界面法
原理:选两种不同渗透浓度的溶液,其 中一种溶液密度大于原生质体的密度, 另一种溶液小于原生质体的密度。
100mmol/LCaCL2+300mmol/L山梨醇 +原生质体 140mmol/L蔗糖+360mmol/L山梨醇 500mmol/L蔗糖
Macerozyme R-10 根霉
Yakylt Honsha Co. Ltd.,Tokyo, Japan
Pectinase
黑曲霉 Sigma Chemical Co., St. Louit, MO 63178,USA
Pectolyase Y-23 黑曲霉
Seishin Pharm. Co. Ltd., Tokyo, Japan
酶解温度
图示:原生质体分离过程(以叶片为例)
过滤、离心
加果胶酶 和纤维素酶
三、原生质体的纯化
材料在酶液中一段时间后,轻轻振动容器或挤 压叶片,使原来组织中的原生质体释放出来。
此时还有一些亚细胞碎屑,尤其是叶绿体、维管 成分、未被消化的细胞和碎裂的原生质体,因此必 须除去。
三种方法
离心沉淀法 漂浮法
由于叶肉细胞排列疏松,酶的作用很容易达到 细胞壁。
植株的年龄和生长条件是十分重要的。
来源: ① 无菌苗 ② 温室培养的苗
培养条件: 低光照强度(1000lx) 短日照 温度为20~25℃ 相对湿度为60%~80% 以及充足的氮肥供应。
2 前处理 要保证酶解能充分的进行,必须促使酶溶液渗
入到叶片细胞间隙中。为此,要做到: 撕去叶片的下表皮,以无表皮的一面向下,使
这一伟大的贡献,使Neher和Sakmann获得1991年度的 诺贝尔生理学与医学奖。
非对称细胞融合技术
所谓非对称细胞融合技术,即利用某种外界因素(常为 γ射线,即γ融合gamma-fusion)辐照某一细胞原生质 体,选择性地破坏其细胞核;并用碘乙酰胺碱性蕊香 红6G处理在细胞核中含有优良基因的第二种原生质体, 选择性地使其细胞质失活,然后融合来自这两个原性 质体品系的细胞,从而实现所需胞质和细胞核基因的 优化组合,或使前者被打碎的细胞核染色体片段中的 个别基因渗入到后者原生质体的染色体内,实现有限 基因的转移,从而在保留亲本之一全部优良性状的同 时,改良其某个不良性状。
②酶解法
1960年Norkinghan大学的植物生理学家 Cooking用酶法降解细胞壁,获番茄根尖原生 质体,开创了大量获得原生质体的的方法。
20世纪九十年代以来,国内外原生质体培 养取得了突飞猛进的发展。 1971年,Takebe 等人在烟草上首次由原生质体培养获得植株。 至今已获得酶法制备植物原生质体操作方法。
a Friable embryogenic calli, b suspension cell aggregates,
c freshly isolated protoplasts from suspension culture, d protoplasts stained with FDA, e division of cell derived from protoplasts,
曲酶Rohm and Hass Co., Philadelphia, PA 19105, USA
Hemicellulase 黑曲霉 Sigma Chemical Co.,St. Louis, MO 63178,USA
纤维素酶——从绿色木霉中提取。用于活力 不同:P1500、P5000、 OnozukaR-10 (常用)
果胶酶(离析酶)——从根霉、黑曲霉中提 取。浓度若超过2%,分离时间过长,均易产生 毒害。常用(MacerozymeR-10)。
半纤维素酶-从黑曲霉中提取。常用于从愈 伤组织中分离原生质体;常用Rhozyme HP-150;
蜗牛酶——分离孢粉素、胼胝质。
步骤: 二步法:离析酶→纤维素酶 一步法:复合酶处理
embryos. i: Transfer of cotyledonary stage embryos onto MS medium for conversion of embryo into plantlets.
四、原生质体培养研究进展
膜片钳技术
1976年[1]德国马普生物物理研究所Neher和Sakmann创 建了膜片钳技术(patch clamp recording technique)。这是一种以记录通过离子通道的离子电 流来反映细胞膜单一的或多个的离子通道分子活动的 技术。它和基因克隆技术(gene cloning)并架齐驱, 给生命科学研究带来了巨大的前进动力。
植物原生质体培养 (补充)
The cultivation of plant protoplast (Complementarity)
李宏富
一、两个概念
再生植株 工程植株
二、原生质体分离
1 材料来源 植物原生质体最方便的来源是叶片,因为叶片
中可以分离出大量的比较均一的细胞,而又不致使 植物遭到致命的破坏。
Recovery of plantlets through somatic embryogenesis
g
h
i
g: Transfer of microcalli onto B5 medium and induction of somatic embryos. h: Transfer of globular embryos onto B5 medium for maturation of somatic
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