实验四 酵母菌原生质体细胞融合
原生质体融合技术简介
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中国科学院青岛生物能源与过程研究所
Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology
原生质体研究的发展
1838 1873 1896 1931 1954 1958 1970 1972 1972 1974 1976 1976 1977 1978 1981 1988 2002 Muller Lugmbuthl Unna Wathin Bnders et al Marston Power et al Carlson Ferenczy et al Michayluk Ferenczy et al Fodor et al Hopwood Gleba et al Menczel Kirimalra et al Stemmer et al 动物病理组织中发现多核细胞 天花病脓胞周围发现多核细胞 水痘侵害过的皮肤中发现多核细胞 麻疹病人扁桃腺中发现多核细胞 组织培养中发现麻疹病毒能诱导细胞用和成多核体 用副流感病毒诱发细胞融合 探索用硝酸钠诱导植物原生质体融合 用NaNO3进行了烟草种间原生质体融合 以白地霉营养缺陷型为材料经原生质体融合首次完成异核体形成 发现PEG是一种良好的聚合剂用于原生质体融合 是一种良好的聚合剂用于原生质体融合 发现 以曲霉 青霉营养缺陷型为材料经原生质体融合首次完成异核体形成 巨大芽孢杆菌内株间原生质体融合成功 链霉菌原生质融合并获融合重组子 用PEG+高pH-Ca2+研究原生质体融合 高 用高pH-Ca2++9℅DMSO与少量 与少量PEG获得较高的融合率 用高 与少量 获得较高的融合率 原生质体PEG融合获得黑曲霉二倍体柠檬酸高产菌株 融合获得黑曲霉二倍体柠檬酸高产菌株 原生质体 一种新的体内分子育种方法——全基因组改组技术 全基因组改组技术 一种新的体内分子育种方法
细胞融合实验报告
一.实验目的1.了解并掌握细胞融合的方法2.了解细胞融合技术及其在生命科学中所起的作用3.掌握化学融合法,了解电融合法及CRY-3细胞融合仪的使用二.实验原理两个或两个以上的细胞合并成一个双核或多核细胞的现象称为细胞融合,也称细胞杂交,在自然情况下的受精过程即属这种现象。
诱导细胞融合的主要方法有:病毒诱导融合,化学融合剂诱导融合和电融合。
1. 病毒诱导融合:有许多种类的病毒能介导细胞融合,最常用的是灭活的仙台病毒(HVJ),为RNA病毒。
病毒诱导细胞融合的过程有:首先是细胞表面吸附许多病毒粒子,接着细胞发生凝集,几分钟至几十分钟后,病毒粒子从细胞表面消失,而就在这个部位邻接的细胞的细胞膜融合,胞浆相互交流,最后形成融合细胞。
2. 化学融合剂诱导融合:化学融合剂主要有高级脂肪酸衍生物、脂质体、钙离子、水溶性高分子化合物、水溶性蛋白质和多肽,其中最常用的是聚已二醇(PEG)。
PEG用于细胞融合至少有两方面的作用:①可促使细胞凝结;②破坏互相接触处的细胞膜的磷脂双分子层,从而使相互接触的细胞膜之间发生融合,进而细胞质沟通,形成一个打的双核或多核融合细胞。
3. 电融合:是指细胞在电场中极化成偶极子,并沿着电力线排列成串,然后用高强度、短时程的电脉冲击穿细胞膜而导致细胞融合。
主要过程包括:1.制备原生质体:微生物及植物细胞有坚硬的细胞壁,需要用酶将其降解,而动物细胞无需要去壁处理。
2.诱导细胞融合:两种亲本细胞的悬浮液调到一定密度,滴入高浓度的聚乙二醇(PEG)诱导融合,或用物理方法如电刺激促进融合。
3.筛选杂合细胞:在特定的筛选培养基上,让杂合细胞有选择地生长,除去其他未融合的细胞。
细胞融合技术在基因定位、基因表达产物、肿瘤诊断核治疗、生物新品种培育及单克隆抗体技术等领域有着非常广泛的应用前景。
单克隆抗体技术就是通过细胞融合技术发展起来的,在生命科学研究核应用方面产生了重大影响。
三.实验结果与分析讨论融合细胞的观察实验中发现大部分的融合都是3个细胞的融合,两个相互融合的很少基本没有找到。
细胞生物学实验-细胞融合
细胞融合应用
一. 单克隆抗体 1975年英国科学家 Milstein和Kohler将产生抗体 的淋巴细胞 同肿瘤细胞融合,成功建立了单克隆抗 体技术,而获得1984年诺贝尔医学和生理 学奖。
The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1984 "for the discovery of the principle for production of monoclonal antibodies"
2化学法(聚乙二醇)
PEG: 聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG) 分子式:HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH 性状:白色蜡状固体,具有强烈的凝集、
沉淀蛋白质的作用 分子量 〉1000-6000u,可作诱融剂。
20世纪70年代,华裔科学家高国南发现聚乙二醇能诱导细胞融合
显微镜下的细胞融合过程
细胞融合的过程
细胞互相靠近 细胞膜融合 细胞桥形成 细胞质融合 细胞核融合
细胞融合主要经过了两原生质体或细胞互 相靠近、细胞桥形成、胞质渗透、细胞核 融合主要步骤。
细胞桥的形成是细胞融合最关键的一步, 融合过程中两个细胞膜从彼此接触到破裂 形成细胞桥。
细胞融合过程中两个细胞膜的变化
• 来源
前处理
融合的方法 主要应用
• 动物细胞 不需
仙台病毒,
PEG ,电融合 生产单克隆抗体
• 植物细胞 脱壁 PEG,电融合 创造植物新品种
• 微生物细胞 脱壁 PEG,
高产优质新菌种
加入融合剂
未融合
未融合
融合细胞的类型
同核体
同核体
异核体(杂交细胞)
• 同核体:由同一亲本细胞融合而来
诱导原生质体融合方法
诱导原生质体融合方法原生质体融合(Protoplast Fusion)是一种常用的遗传工程技术,用于将两个或多个植物细胞的原生质体融合成一个细胞。
这项技术可以用于基因转移、细胞杂交、基因组互补等研究和应用。
原生质体融合有许多不同的方法和策略。
下面我将介绍几种常用的原生质体融合方法:1. 化学诱导融合:这是最简单的原生质体融合方法之一。
首先,将需要融合的细胞分别处理,使其形成原生质体,然后将两种原生质体混合在一起,并使用一种化学物质(如聚乙二醇)来破坏原生质体的细胞壁。
细胞壁被破坏后,原生质体会相互融合成一个细胞。
这种方法的优点是简单易行,但融合效率较低。
2. 电穿孔融合:这是一种常用的物理诱导原生质体融合方法。
首先,将需要融合的细胞分别处理,使其形成原生质体。
然后,将原生质体置于含有金属离子的融合液中,如含有钙、镁等离子的PBS缓冲液。
使用一个电极将电流加到融合液中的细胞上,从而形成微小的电流孔。
电流孔能使细胞膜短暂地变得透明,原生质体便可以通过这些孔进入另一个细胞,并彼此融合。
3. 高速离心融合:这是一种利用机械力来诱导原生质体融合的方法。
首先,将需要融合的细胞分别处理,使其形成原生质体。
然后,将原生质体置于离心管中,并进行高速离心。
高速离心时,细胞的离心管内壁会形成主要的离心力,使细胞的原生质体被推到细胞的中心。
当离心完毕后,将生成的原生质体集中到一起,并通过重力或离心来诱导其融合。
4. 基因枪融合:这是一种利用基因枪将DNA导入细胞,并诱导细胞融合的方法。
首先,将需要融合的细胞分别处理,使其形成原生质体。
然后,将DNA负载在金属微粒上,并通过气压或爆炸将金属微粒射入细胞质中。
在这个过程中,细胞膜被破坏,使DNA可以进入细胞,并导致细胞融合。
以上是几种常用的原生质体融合方法。
根据实验需要和研究目的,可以选择适合的融合方法。
这些方法都有各自的优缺点,需要根据实际情况进行选择和优化。
原生质体融合方法的发展对于植物基因工程和农业育种具有重要意义,可以提高植物的遗传性状和生产性能,为植物育种和农业发展提供新思路和方法。
原生质体融合操作方法
原生质体融合操作方法
原生质体融合是将两个或更多的细胞融合在一起,以形成单一的细胞。
在实验室中,原生质体融合可用于合成杂交细胞或研究细胞膜蛋白质交互作用。
以下是一种常用的原生质体融合操作方法:
1. 制备原生质体:收获新鲜的植物细胞并环绕其周围的细胞壁。
用酶类解除细胞壁以获得原生质体。
2. 制备混合物:在离心管中将两种原生质体混合并加入缓冲液。
3. 让细胞融合:通过高渗透压或电脉冲使膜破裂或局部破损,让细胞形成互通。
4. 分离融合物:将融合物分离出来,并放在一个合适的培养基上培养。
5. 检测融合结果:使用显微镜观察细胞是否真正融合,或使用特定的抗体标记来检测融合后的细胞表面分子。
需要注意的是,原生质体融合需要谨慎操作,避免损坏细胞结构或引入杂质。
在实验中,需要仔细选择不同类型的原生质体,以确保它们能够融合。
酵母原生质体融合
酵母原生质体融合生态学院生物11 20号李香酿酒酵母,又称面包酵母或出芽酵母。
酿酒酵母是与人类关系最广泛的一种酵母,广泛的用于制作面包和馒头等食品及酿酒,是发酵中最常用的生物种类。
酿酒酵母的细胞为球形或者卵形,直径5–10μm。
其繁殖的方法为出芽生殖。
酵母菌种优劣直接影响发酵产品的价值,在自然界中菌种大多不具有较高的价值,因而对菌种的选育和改良显得尤为重要。
原生质体融合是一项应用广泛的菌种改良技术。
原生质体融合 (protoplast fusion)是将双亲株的微生物细胞分别通过酶解脱壁,使之形成原生质体,然后在高渗的条件下混合,并加入物理的或化学的或生物的助融条件,使双亲株的原生质体间发生相互凝集,通过细胞质融合,核融合,进而发生基因组间的交换重组,可以在适宜的条件下再生出微生物的细胞壁来。
从而获得带有双亲性状的、遗传性能稳定的融合子(fusant)的过程[1]。
目前常用的融合方法有化学融合、生物融合、电融合以及激光诱导融合等。
本实验用酿酒酵母2.339与酿酒酵母2.70作为融合双亲,进行融合,旨在计算两种菌原生质体的形成率、再生率及融合率。
望能将融合后的原生质体应用于酿酒生产中以获得较高的经济效益。
1材料1.1样品菌种:酿酒酵母(Saccharomgces cerevisiae)的两种营养缺陷型菌株(如met-、lys-)。
1.2 培养基和试剂(1)马铃薯培养基:马铃薯(去皮) 200g,葡萄糖20g,水1000 mL。
配制方法下:将马铃薯去皮,切成约2cm2的小块,放入1500mL的烧杯中煮沸30min,注意用玻棒搅拌以防糊底,然后用双层纱布过滤,取其滤液加糖,在补足水分1000 Ml,自然pH。
(2)YEPD培养基(用于酵母原生质体融合):酵母粉10g,蛋白胨20g,葡萄20g蒸馏水1000 mL,pH6.0。
(3)YEPD高渗培养基(含0.6 mol/L NaCl的YEPD):在YEPD培养基中0.6mol/L NaCl,3%琼脂。
植物原生质体培养和体细胞融合技术研究进展_李杰
仲恺农业技术学院学报,16(4):64~71,2003Jour nal of Zhongkai Agr otechnical College文章编号:1006-0774(2003)04-0064-08收稿日期:2003-04-23基金项目:国家“863”高技术研究计划(2001A A244011)资助项目.作者简介:李 杰(1974-),男,四川巴中人,在读博士生.*通信作者.植物原生质体培养和体细胞融合技术研究进展李 杰1,2,黄敏仁1*,王明庥1,蔡 汝2(1.南京林业大学林木遗传和基因工程国家林业局重点实验室,江苏南京210037;2.江苏省兰花工程研究中心,江苏泰州225321)摘要:自20世纪70年代以来,植物原生质体培养和体细胞融合操作技术不断趋于精密化、微量化、高效化与多样化.文章侧重于实验操作技术和当前研究热点,对植物原生质体培养和体细胞杂交等关键技术环节的重要研究成果和研究进展进行了综述,并对其在理论和实践上的应用前景及未来发展趋势进行了展望.关键词:植物;原生质体培养;体细胞融合;研究进展中图分类号:S682.31 文献标识码:A 植物原生质体培养和体细胞融合技术作为细胞工程技术的重要分支,一直是20世纪70年代以来的研究热点.30多年来,随着一系列关键性实验方法的发展和技术难关的逐步突破,原生质体培养和体细胞融合技术己广泛应用于生物科学众多领域的研究,尤其是在通过这样的实验体系进行植物品种改良和创造远源杂种方面取得了可喜的进展.近年来有关该领域的研究综述颇多,但大多是针对某一具体植物研究结果的总结,而针对更具普遍指导意义的操作技术评述较少.结合国内外有关文献,侧重于实验操作技术,作者对植物原生质体培养和体细胞杂交等关键技术环节的重要研究成果和研究进展进行综述,以期为相关领域的研究提供参考.1 植物原生质体的培养据许智宏等[1]介绍,自从1971年Nagata 和Takebe 首次利用烟草叶片分离原生质体,并培养获得再生植株以来,迄今至少已有46个科160多个属的360多种植物(含变种和亚种)的原生质体再生植株问世.1.1 植物原生质体的游离原生质体的游离是原生质体培养成功的一个重要环节.目前,游离植物原生质体的常规方法是酶解法.用酶解法游离原生质体时,首先要考虑植物材料的正确选择.一般情况下,当植物处于最佳生长状态时取材,分离的效果最为理想.如茄科植物一般选取生长旺盛、生理状态一致的试管苗上部叶片[2],而禾本科植物大多数选取胚性悬浮细胞系为材料[3].一个处于指数期快速生长的细胞培养体系,如愈伤组织或悬浮培养物,最适宜作为游离原生质体的材料.其次,要选择合适的水解酶种类、组合及浓度.目前市场上出现了许多游离原生质体的酶制品,但各种酶的性质、活性、纯度及作用有很大的差别,选用时应根据植物材料和酶制品的特性进行综合考虑.此外,还必须控制好酶解条件.影响酶解过程的主要因素有温度、pH 值、渗透压、离子浓度、振荡及预处理等.一般情况下,酶解温度为25~30℃,酶解液的pH 值根据所用酶种类的不同可以在5.4~6.2之间变动,渗压剂的使用浓度,一般控制在0.45~0.8mmol /L 范围内.酶解前对材料进行轻微的质壁分离,酶解时低速振荡(40r /min )以及酶解液中高钙镁离子浓度(CaCl 2和MgCl 2)等能提高原生质体的产量和质量.原生质体成功游离后的提纯方法常用的有漂浮法和沉降界面法.漂浮法在洗涤纯化过程中对原生质体的损伤较小,但对离心力要求严格,不易掌握,沉降界面法易造成原生质体损伤,但操作简单.具体选择方法则依实验条件而定.1.2 原生质体的培养在培养方式上,植物原生质体培养常采用固体包埋培养、液体培养、固液双层培养以及在此基础上发展起来的一些其它培养方式.固体包埋培养能提高培养初期原生质体的成活率,利于定点观察,但不利于通气和培养后期代谢物的排出.相比而言,多数实验者喜欢采用液体浅层培养法.这种方法的优点是培养物与空气接触面大,易于通气,添加更换培养基和转移操作方便,细胞悬浮培养中产生的有害代谢产物易于扩散,但不利于定点观察,易造成原生质体局部密度过高或过低.在固液双层培养法中,Shillito 等[4]建立的念珠培养法是比较好的一种方法,它是将含有原生质体的琼脂糖培养基切成小块放在液体培养基中进行振荡培养.用这种方法,明显提高了矮牵牛(Petunia hybridia )、番茄(Lyc opersicum escule ntum )、芜菁(Brassica rapa )等原生质体培养的植板率[4].在上述培养方式中,均可以加入未去壁但失去分化能力的完整细胞进行原生质体的看护培养(nurse culture ),能明显提高培养效果.Mit -sugu 等[5]用这样的方法,极大提高了百合(Lilium L .)原生质体培养初期的成活率. 在培养基的选择上,两种最常用的培养基为8P 和NT ,它们分别是由B5和MS 培养基改良而形成的.在这些基本培养基的基础上,针对不同植物材料和不同的培养阶段可以进行适当修改.大量元素中Mg 2+、Ca 2+浓度变化最多,铵态氮和硝态氮的比例及用量,不同实验也不尽相同.对碳源的要求一般不专一,多数采用蔗糖,或者以蔗糖和葡萄糖混合使用作为碳源营养.在激素使用上,一般须在含有一种生长素和一种细胞分裂素的培养基中才能正常分裂和生长.最常用的外源生长素是2,4-D ,但对细胞分裂素的需求,各种文献报道不一致.原生质体对外源激素的需求可能会随培养时间的推移而发生改变.如烟草(Nicotiana tabacum )原生质体在培养基中生长素水平降低或其作用消除后,会迅速生长并随之发生植株再生[6].此外,还发现一些其它化合物对原生质体的生长和分裂有一定影响.如鸟氨酸和丁二胺对木本植物的叶组织原生质体分裂和细胞团形成有利,亚精胺-精胺类多胺物质则对禾谷类植物的原生质体分裂有促进作用[6].在培养密度和条件上,根据物种和材料来源的65第4期李 杰,等:植物原生质体培养和体细胞融合技术研究进展 不同,一般可在3×103~1×105个/ml 原生质体之间变动,培养初期往往要求黑暗或弱光条件,对大部分植物种来说,25℃的培养温度,pH 5.5~5.7的范围是合适的.1.3 原生质体的植株再生原生质体的植株再生途径通常有3条:①经细胞团发育形成愈伤组织,再分化成芽长成植株;②直接形成胚状体,再发育成植株;③先形成愈伤组织,再由愈伤组织分化形成胚状体,最后发育成植株.分化和再生所需培养基的营养成分一般与同种植物正常离体组织培养的要求相似,但其分化和植株再生能力受供体植物的染色体组型和基因型影响.曾有文献[7]介绍,油菜(Brassic a campe stris )的再生能力以AABB 染色体组品种最强,AACC 次之,AA 最差.Kyozuka 等[8]报道,籼稻(O ryza sativa subsp .indica )、粳稻(O .sativa subsp .japonica )和野生稻(O .minuta )的不同基因型在分化和再生能力方面表现出基因特异性.甚至同一品种的不同个体之间也表现出这样的差异.据黄白渠[6]介绍,在同一品种的苜蓿(M edic ago sativa )中,来自不同植株的原生质体分裂和形成胚状体的潜力是不同的.最初由原生质体成功地再生出植株的是茄科的一些植物,如烟草和矮牵牛,这些物种长期以来一直被用来作为研究原生质体培养和植株再生的模式植物.20世纪80年代以来,原生质体植株再生的研究在许多植物中取得突破性进展,已经获得了若干种有重要经济价值的原生质体再生植株,包括禾谷类的水稻(O .sativa )、玉米(Zea mays )、小麦(Tritic um ae stivum )、甘蔗(Sacc harum sinense )、高粱(Sacc harum bicolor ),豆科中的大豆(G lycine max )、花生(A rac his hypogaea )、蚕豆(Vicia faba )、苜蓿(M .sativa ),重要经济作物中的棉花(G .hirsulum spp .)、甜菜(Beta var .rapa )及重要木本植物咖啡(Coffea stenophylla )、苹果(Malus pumila )、梨(Pyrus spp .)、龙眼(Dim ocarpus longan )、猕猴桃(A ctinidia chinensis )、杨树(Populus spp .)、泡桐(Paulownia spp .)、白云杉(Picea glau -ca )、观赏植物菊花(Chrysanthemum morifolium )、康乃馨(Dianthus caryophyllus )、天竺葵(Pelargonium hortorum )等[1].再生植株着重于农作物和经济植物,并从一年生向多年生、草本向木本、高等植物向低等植物、体细胞向生殖细胞扩展.总结原生质体植株再生成功的经验,有3个共性的关键因素:①选择合适的基因型;②利用胚性悬浮细胞或愈伤组织作为分离原生质体的材料;③培养条件适宜.尽管原生质体培养取得了令人鼓舞的成功,但原生质体培养的稳定性和可重复性差,存在很强的经验性,得到的原生质体再生植株仅占已进行原生质体培养的数百种植物中的一部分,而且原生质体分裂、分化的潜在生理生化本质和机制,以及各种影响因素需作深入的研究.2 植物体细胞的融合从原生质体再生完整植株的成功,最终引发了将不同遗传背景的细胞组合在一起的尝试.经过近30年的努力,人们建立起一套完整的体细胞杂交体系,它可能使不能通过有性过程杂交的亲本之间进行核基因的重组或胞质基因的重组.这套技术体系包括诱导原生质体的融合、选择融合体或杂种细胞及杂种植株的再生与鉴定.2.1 原生质体融合技术的进展原生质体的融合方法经历了一个逐步改进和完善的过程.早期使用的有Na NO 3法、高66 仲恺农业技术学院学报第16卷钙高pH 法、PE G 法等,后来相继发展了PEG 与高Ca 2+、高pH 值相结合的方法(也简称PE G 法)、电融合法以及聚集微束激光法.目前,广泛使用的是PEG 法和电融合法.PE G 法是采用聚乙二醇为融合剂的一种化学方法,使用简便、经济、可重复性强,已成功使近百个实验获得体细胞杂种.PE G 法诱导原生质体融合时,一般所用分子量为1500~6000,浓度为15%~45%.PE G 法的缺点是处理时间、PE G 分子量、诱导液的浓度等不易掌握,且易形成多元融合物,还有待于完善.电场融合是目前最流行的物理诱导融合法,它是20世纪80年代初迅速崛起的一种细胞融合技术[9].近年来,已发表了数百篇关于电融合的基本化学机理及其在医学、分子生物学、生物技术学等方面应用的科学论文.迄今为止,通过电融合反复实验,已测出了数十种植物原生质体的电融合参数,如水稻、小麦、燕麦(A vena sativa L )、马铃薯(Solanum tuberous m )、油菜(B .campestris )、胡萝卜(Daucus carota )、菜豆(Phaseolus vulgaris )、蚕豆、烟草、矮牵牛等,并成功获得部分细胞杂种[10].原生质体在融合液中的接触和融合受到外电场的作用强度、融合液的组成(如渗透剂种类、Ca 2+,Mg 2+浓度、添加的化学物质、pH 值等)的影响.电场融合的最适条件,需要分别具体材料,在实验中不断加以探索而提高,但电融合因其操作简便、快速、融合同步性好,尤其是与微培养技术相结合,将会是非常有前途的技术体系.在融合的方式上,主要有对称融合和供体-受体式融合两种.对称融合是体细胞杂交最初采用的融合方法,并由之实现了许多有性杂交不亲和的种属间的基因交流.如在马铃薯的育种中,Mattheij 等[11]用对称融合的方法获得了产量提高的四倍体细胞杂种,开辟了马铃薯商业化育种的新途径.但一般来说,对称融合在导入有用基因的同时,也带入新的全部不利基因,同时在体细胞水平上,也往往表现出一定程度的种间不亲和性.供体-受体式融合可分为细胞质杂交和不对称融合.若用致死剂量的射线处理供体原生质体,则可以形成完全没有亲本染色体的胞质杂种,若利用X 射线、紫外线打断或破坏亲本一方完整的染色体结构,使染色体部分被破坏后用于体细胞杂交,则形成不对称体细胞杂种.供体-受体式融合,可以实现胞质基因的重组,更有希望克服远缘杂交的不亲和性,因而是一条育种的简便途径,但不足之处在于供体基因丢失是一个随机的过程,丢失的程度是不可预见和难以控制的,所以有针对地转移特定的性状是亟待解决的问题.2.2 植物体细胞的杂交组合20世纪70年代,在培育体细胞杂种方面所取得的巨大成功使人们极度兴奋,许多学者一直致力于用这一方法创造新的杂种.在早期的研究中,研究兴趣和重点集中于获得亲缘关系较远的植物之间的体细胞杂种,在许多系统发育上无关的种间进行了大量的原生质体融合实验.有关例子包括大豆和烟草、大豆和大麦(H ordeum vulgare )、大豆和玉米、大豆和油菜、胡萝卜和大麦、胡萝卜和芹菜(Apium graveolens )等.多数情况下这些实验都如意料中的一样失败,融合的产物几乎不能进行分裂和生长.随后,许多学者试图从同科异属的杂种细胞再生杂种植物,杂交组合的例子有番茄+马铃薯、拟南芥+油菜、颠茄(Atropa spp .)+曼陀罗(Datura spp .)等,且获得了一些稳定的杂种细胞品系,有的还成功地再生出属间杂种植物,如广为宣传的番茄+马铃薯杂交植株.20世纪80年代中期以来,人们研究的兴趣转向选用近缘种内或种间以及较近缘属间的杂交组合.近缘体细胞杂交,具有更强的目的性,并且在实践上已经证明是一条可行的育种途径.在此期间,随着一大批经济植物如水稻、大67第4期李 杰,等:植物原生质体培养和体细胞融合技术研究进展 豆、小麦、柑桔(Citrus reticulata )、猕猴桃(A .c hinensis )、樱桃(Pyrus avium )、杨树等原生质体培养的成功和对部分体细胞杂种研究的重视,重要经济植物非对称体细胞杂交成为该领域研究的主流.Zhou 等[12]、向凤宁等[13]先后以小麦为受体进行了一系列属间、种间非对称原生质体细胞融合,并获得体细胞杂种植物.邓秀新等[14]通过柑桔体细胞杂交得到抗寒、抗高温和抗病的杂种植株.肖尊安等[15]通过猕猴桃属种间原生质体融合,获得了中华猕猴桃(A .chinensis )与狗枣猕猴桃(A .kolomikta )的4个体细胞杂种无性系再生植株.辛化伟[16]通过非对称杂交,获得水稻与大黍(Panicum maximum )的体细胞杂种及后代.据不完全统计,通过体细胞杂交,至少已获得44个种内、103个同属异种,48个属间、5个科间的杂种植物,其中非对称融合的体细胞杂种在90%以上.2.3 杂种细胞筛选和体细胞杂种鉴定植物原生质体融合后的杂种细胞筛选方法,迄今还没有一个在总体上可以被广泛应用的方案.目前按其各自的基本原理可分为3类:①利用或创造各种缺陷型或抗性互补细胞系,用选择培养基将互补的杂种细胞选择出来.细胞系互补包括叶绿素缺失互补、营养缺陷互补及抗性互补.前两种为隐性性状,其实施的关键是作为遗传标记的有关突变的利用.将黄化的黄花烟草(N .rustica )原生质体同白化的普通烟草原生质体融合,随后筛选出绿色的种间体细胞杂种[6].抗性互补为显性性状,当两个单抗的亲本融合后产生双抗杂种细胞,用相应的选择培养基则能将杂种细胞筛选出来,如Wijbrandi 等[17]用这种方法筛选了体细胞杂种.②利用或人为地造成两亲本原生质的物理特异性差异进行选择.如Sundber 等[18]根据融合和未融合原生质体物理特性的差异,利用倒置显微镜成功挑选出油菜融合原生质体,Chuong 等[19]用荧光激活细胞分拣机FACS 实现了大量挑选杂种细胞.③利用或人为地造成细胞生长或分化能力的差异进行选择.向凤宁等[20]在小麦与3种近缘属间禾草的体细胞杂交中发现,融合克隆具有优先生长的现象,这种生长速度的差异可用作选择的依据.当由杂种细胞获得再生植株后,必须进一步的分析和鉴定以证实杂种的真实性.常用的杂种鉴定方法有表现型鉴定、细胞学鉴定、同工酶鉴定及分子生物学鉴定.表现性鉴定是最常用的方法,是利用杂种与双亲表现型的差异进行比较分析.这种差异可以是形态学的直接特征,也可以是通过转基因人为创造的抗逆性.染色体数目和形态具有种的特性,是鉴定杂种的主要细胞学证据.此外基因组原位杂交(GISH )是分子细胞学鉴定杂种的主要方法.如Zhining 等[21]利用GISH 确认了羊草(L .chinensis )和小麦体细胞杂种.同工酶分析是最基本的生化分析方法,杂种的同工酶谱往往是双亲酶谱的总和,同时表现双亲特有的酶谱,也可能出现双亲没有的新酶带.有学者成功地通过分析油菜的PGI 、PGM 等同工酶,鉴定了体细胞杂种[7].近年来,对融合杂种植株进行分子生物学鉴定己成为强有力的手段.常用的鉴定植物体细胞杂种的分子生物学方法有限制性片段长度多态性(Restriction fragment length ploymorphism ,RFLP )、随机扩增多态性(Random amplified polymorphic DNA ,RAPD )、扩增片段长度多态性(Amplified fragment length ploymorphism ,AFLP )、简单重复序列(Simple se -quence repent ,SSR )等.在这方面已经有较多成功的例子.68 仲恺农业技术学院学报第16卷3 植物原生质体培养和融合技术的应用原生质体培养和融合是细胞工程的核心内容,它在基础理论研究和实现远缘遗传重组,转移多基因控制性状,创造和改良品种中展示出广阔的应用前景.3.1 原生质体的理论研究和遗传应用离体的植物原生质体和其起源细胞一样仍然具有全能性,可作为生物试验系统而广泛用于生理学、遗传学、病理学、病毒学和育种学的研究.如当细胞脱壁时会引起细胞自身防御系统启动,诱发某些基因表达和关闭,深化了对细胞修复机理的认识[22].Fo wke [23]对白云杉(P .glauc a )以及Simmonds [24]对烟草原生质体培养的研究表明,影响原生质体植株再生的因素如基因型、材料来源、培养基成分、培养条件等在生理或分子水平上有一定的重叠性和相关性,揭示了脱分化机理、细胞分裂等发育学上的问题.原生质体又是遗传工程的理想受体.原生质体可以直接摄取外源物质,包括细胞核、细胞器基因组、DNA 片段及病毒颗粒,而且在控制条件下,以单个原生质体进行准确的遗传操作,易于转化受体的筛选和分析,避免嵌合现象.经过多年的努力,以原生质体为受体直接进行基因转化己取得较大的成功[25].3.2 植物体细胞杂交的应用从有性杂交植物时代到体细胞杂交植物时代所获得的各种研究结果,使植物育种的视野在器官和细胞水平上都得到了扩大.在理论上,体细胞杂交可以和常规的有性杂交技术一样作为遗传分析的手段,用于对遗传性状的本质、核基因、核外基因以及细胞分化和形态发生机理的研究和分析.在实践中的应用体现在3个方面:①获得新的种质.体细胞杂交技术不仅能使近缘不亲和种内或种间植物,而且可使远缘不亲和的属间甚至科间植物产生体细胞杂种,使植物能够利用远缘的有用基因,从而扩大植物可利用的基因库.如果杂种植物可育,并能稳定遗传,就可能形成农业上有用的新物种.如通过白菜型油菜(B .c ampestris )与甘蓝(B .napobrassica )进行原生质融合得到38条染色体的甘蓝型油菜,通过甘蓝型油菜(B .napus )与黑芥(B .nigra )体细胞融合得到的含3套染色体的杂种,大部分可育并结籽[7].②培育新品种.将栽培品种与相关的野生种作为亲本,经过原生质融合、选择与再生,从而获得具有抗性的新品种.如通过这样的方法,得到抗马铃薯晚疫病的体细胞杂种[26].③转移细胞质基因.通过体细胞杂交能够转移多基因控制的性状,并且是目前唯一能使双亲胞质和核基因在杂种细胞中共存的技术.原生质体融合涉及了双亲的细胞质,它不仅可以把细胞质基因转移到全新的核背景中,也可使叶绿体基因组与线粒体基因组重新组合.这为许多实验所证实并直接应用于植物育种.4 结语纵观30多年来,虽然有关植物原生质体培养和体细胞融合技术的研究始终保持了长盛不衰之势,并取得了可喜的成绩,但是在原生质体培养技术的成熟度、在体细胞杂种的育性(特别是远缘体细胞杂交中)以及非对称杂交中染色体消失的随机性等方面都存在着亟待研69第4期李 杰,等:植物原生质体培养和体细胞融合技术研究进展 究和解决的问题.以原生质体植株再生技术为基础,利用体细胞杂交技术转移胞质雄性不育基因、多基因和基因组以及某些野生抗性性状等方面,将是未来研究的主流.有理由相信,原生质体培养和体细胞杂交技术与遗传转化技术相辅相成,与常规育种技术结合起来,将为植物基因组之间的结合和相互作用以及新品种的培育提供了无限的可能性.参考文献:[1] 许智宏,卫志明.植物原生质体培养和遗传操作[M ].上海:上海科学技术出版,1997.20-30.[2] SHEPARD J F .Cultivar dependent cultural refinements in potato protoplast regeneration [J ].Plant Science Letters ,1982,26:127-132.[3] FUJIMURA T .Regeneration of rice plant from protoplant [J ].Plant Tissue culture letters ,1985,2:74-75.[4] SHILLITO R D ,PASZKOOOSKI J ,POTRYKUS I .Agarose plating and a bead type culture technique enable andstimulate development of protoplast 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,1988,12:181-184.70 仲恺农业技术学院学报第16卷[20] 向凤宁,夏光敏,周爱芳,等.普通小麦与无芒雀麦不对称体细胞杂交的研究[J ].植物学报,1999,41(5):458-462.[21] ZHINING Wan ga ,ROBERT S ,ZE METRA A ,et al Jointed Goatgrass (A egilo ps cylindrica Host )x Wheat(Triticum aestivum L .)Hybrids :Hybridization Dynamics in Oregon Wheat Fields [J ].Crop Sci ,2002,42(6):1863-1872.[22] CRIQUI M C .In search of genes involved in the re -entry of mesoph y ll cells into the cell cycle [J ].Physiol Plant ,1991,82(1):A35.[23] FOWKE L C .Microtube organ ization and cell devision in embryogenic protoplast culture of white spruce (Piceaglauca )[J ].Protoplasma ,1990,158(1-2):86-94.[24] SIMMONDS D N .Microtubes in cultured protoplast [J ].Acta Bot Neet ,1991,40(30):183-195.[25] 张承才,彭 玲.蛋白激酶在植物生长及发育中的作用[A ].许智宏,刘春明.植物发育的分子机理[C ].北京:科学出版社,1998.172-188.[26] HELGESON J P ,HUNT G J ,HABERLAC H G T ,et al .Somatic hybrids bet ween Solanum bre videns and Solanu mtu berosu m Expression of a late blight resistance gene and potato leaf roll resistance [J ].Plant cell 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原生质体融合的操作流程和程序
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微生物原生质体融合技术
•1957年 年 1957年,Eddy和Williumson等首次用蜗牛酶酶 年 等首次用蜗牛酶酶 和 等首次用蜗牛酶 解制备了酵母菌的原生质体
•60年代 年代
60年代捷克的 年代捷克的Brno和西班牙的 和西班牙的Salmanca两个研究中心对原 年代捷克的 和西班牙的 两个研究中心对 质体技术做了大量基础性工作 前者主要应用原生质体研 工作, 生质体技术做了大量基础性工作,前者主要应用原生质体研 酵母细胞的生活史与细胞分裂,后者主要研究能够有 生活史与细胞分裂 究酵母细胞的生活史与细胞分裂,后者主要研究能够有 降解丝状真菌细胞壁的溶菌酶。 丝状真菌细胞壁的溶菌酶 效降解丝状真菌细胞壁的溶菌酶。
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2 原生质体的融合
微生物原生质体诱导融合方法主要有
电融合 基于微流控芯片 的细胞融合技术
PEG 结合高 + Ca2+诱 导法
激光诱导融合 高通量细胞融 合芯片
Logo PEG结合高 2+诱导法 结合高Ca + 结合高
聚乙二醇(PEG)是一种多聚化合物,不同种类微生物对 是一种多聚化合物, 聚乙二醇 是一种多聚化合物 PEG分子质量的要求不尽相同。亲本原生质体制备好后, 分子质量的要求不尽相同。 分子质量的要求不尽相同 亲本原生质体制备好后, 即可进行融合。 即可进行融合。
融合( 融合(PEG、离心沉淀、电脉冲等) 、离心沉淀、电脉冲等) 融合子的检出(直接检出法和间接检出) 融合子的检出(直接检出法和间接检出) 株的筛选
实用性菌 实用性菌
11
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二、原生质体融合技术的步骤与方法
融合重组体筛选
3
主要步骤
1
双亲本原生质 体制备和再生,
酵母菌细胞融合-实验操作
酵母菌细胞融合实验一、实验目的学习酵母菌原生质体制备和再生技术,为了解酵母菌为材料的外源基因转移等技术奠定基础。
二、实验原理酵母菌如酿酒酵母,在遗传学和分子生物学的研究中有很大作用,尤其是近些年来,随着科技的进步,酵母菌的遗传操作如转化、基因克隆和外源基因在酵母受体中的表达等技术都有了突破性的进展。
作为受体系统的酵母菌原生质体在这些技术中有独特的地位。
这种经溶菌酶处理脱壁后的细胞(脱壁不完全者称原生质球)既可以作为不同种属间细胞融合的母体,实现细胞器等大结构的转移,又可作为外源基因转移的受体,大大提高基因转移的效率。
这些新技术不仅促进了酵母菌遗传学的发展,而且很多已应用到构建新的酿酒业酵母。
本实验以酿酒酵母为材料,进行原生质体的分离制备和再生。
酵母菌原生质体的制备一般采用蜗牛酶、酵母溶菌酶或其它细胞壁溶解酶类。
分离制备过程受许多因素的影响,如不同菌株的生长期、细胞浓度、溶菌酶类型和用量、处理时间和温度等。
所以整个实验过程设计应综合考虑各种因素,才能获得较好的效果。
分离制备的原生质体在适当的再生培养基上培养时,可以再生出细胞壁而恢复完整细胞状态,即完成再生过程,这也是以原生质体为受体的所有实验技术最终能实现的一个关键步骤。
在原生质体制备中,应选用适当生长时期的菌体作为分离的材料。
一般来说,对数生长期的酵母菌细胞易脱壁,静止期细胞较难甚至不可能形成原生质体。
而不同菌种的生长对数期也略有差异,一般在12~16小时之间(108细胞/ml)。
制成的原生质体悬浮液在0℃条件下保存4~6小时,不会影响融合再生率。
所以欲进行原生质体融合,应在制备后尽快进行,以免时间过长,影响再生。
分离过程中采用的β-巯基乙醇可使细胞壁组分中的二硫键破坏,使蜗牛酶易于分解细胞壁。
此外,渗透压的调节可用0.8mol/L山梨醇、16%蔗糖,或者0.6mol/L KCl溶液。
三、实验材料菌种:酿酒酵母SP-48、L-酵母:器具和试剂:恒温摇床、恒温水浴、显微镜、台式离心机、培养皿、试管、过滤灭菌装置。
原生质体分离与融合
原生质体的分离、融合与培养一、实验目的1.了解植物原生质体分离、融合和培养的基本原理。
2.掌握植物原生质体分离、融合和培养的基本过程。
3.了解并掌握利用PEG原生质体融合的原理和方法。
二、实验原理植物原生质体是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞”,是开展基础研究的理想材料。
其中酶解法分离原生质体是一个常用的技术,其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成,因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分,除去细胞壁。
许多化学、物理学和生物学方法可诱导原主质体融合,现在被广泛采用并证明行之有效的融合方法是聚乙二醇(PEG)法、高Ca高pH法和电融合法。
PEG诱导融合的机理:PEG由于含有醚键而具负极性,与水、蛋白质和碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键,当PEG分子足够长时,可阼为邻近原生质表面之间的分子桥而使之粘连。
PEG也能连接Ca2+等阳离子,Ca2+可在一些负极化基团和PEG之间形成桥,因而促进粘连。
在洗涤过程中,连接在原生质体膜上的PEG分子可被洗脱.这样将引起电荷的紊乱和再分布.从而引起原生质体融合:高Ca高pH由于增加了质膜的流动性,因而也大大提高了融合频率,洗涤时的渗透压冲击对融合也可能起作用。
三、实验材料、试剂与仪器1.材料新鲜的菠菜叶片2.试剂(1)酶液:依次加入 1.25%纤维素酶、0.3%果胶酶、0.04%甘露醇、20mmol/LKCl和20mmol/L2-吗啉乙磺酸(MES),55℃水浴10min,冷却至室温,再加10mmol/LCaCL2、5mmol/Lβ-巯基乙醇和0.1%BSA,0.45um微孔滤膜过滤,溶液呈透明橙色。
(2)PEG溶液:4GpPEG4000\3mL去离子水、2.5mL0.8mol/L甘露醇和1mL1mol/L CaCL2。
(3)MMg溶液:0.4mol/L甘露醇、15mmol/LMgCl2、mmol/LCaCl2和4mmol/LMES。
原生质体融合(实验报告)
酵母原生质体融合××××××××××酵母有发酵工业的灵魂之称,其发酵性能的好坏直接影响发酵产品的质量,同时也决定着发酵工艺流程和运转周期及运转费用[1]。
因此,选育优良的酵母菌种在发酵工业中具有重要的意义[2]。
对酿酒酵母的选育始终是酿酒工作者所要从事的重要工作之一。
好的酿酒酵母能够提高酒的质量和产量,赋予酒良好的风味;能够简化工艺流程,减少设备投资;能够缩短发酵周期,降低运转费。
原生质体融合育种( protoplast fusion)是20世纪60年代发展起来的基因重组技术。
通过两个遗传性状不同的亲株原生质体融合从而达到杂交目的。
1960年法国的Barsi研究小组在培养两种不同动物细胞混合时发现了自发融合现象,同时日本的Dkada发现仙台病毒可诱发内艾氏腹水病细胞彼此融合,从而开始了细胞融合的探索。
国内外对原生质体融合技术的研究都比较成熟, 一般认为酵母菌原生质体融合技术的关键点有原生质体的制备和再生、原生质体的融合以及融合子的筛选等。
传统的对酿酒酵母的选育方法主要有自然分离、连续培养和诱变育种[3]。
近年来重组技术,基因工程和原生质体融合技术迅速发展,得到了广泛应用。
两个或两个以上的细胞经过自然的或者人为的作用合并成为一个细胞叫融合细胞,这个过程就称为细胞融合过程。
用微生物作材料进行细胞融合,必须消除细胞壁和细胞膜。
通常采用酶解作用破除细胞壁,采用聚乙二醇促使细胞膜融合。
细胞融合之后,还经过细胞质融合,细胞核重组,细胞壁再生等一系列过程才能形成具有生活能力的新菌株。
融合后的细胞有两种可能:一是染色体DNA不发生重组,两种细胞的染色体共存于一个细胞内,形成异核体,这是不稳定的融合。
另一类是两亲本细胞核染色体DNA真正发生重组。
通过连续传代分离纯化可以区别这两类融合。
应该指出,即便是真正的重组融合子,在传代中也有可能发生分离,产生回复或新的遗传重组体。
原生质体融合对亲本的要求
原生质体融合对亲本的要求原生质体融合是生物学中一种重要的现象,它在细胞生物学、生物化学等领域都有广泛的应用。
原生质体融合对亲本有一定的要求,下面将从细胞融合的机制、亲本的选择以及实验条件等方面进行详细阐述。
细胞融合的机制对于原生质体融合的亲本选择具有重要的影响。
细胞融合是指两个或多个细胞的质膜融合,形成一个新的细胞。
在原生质体融合中,亲本细胞的细胞膜必须具有一定的融合能力,以确保质膜的融合能够顺利进行。
因此,亲本细胞必须具有相似或相容的细胞膜成分和结构,以提供融合所需的蛋白质和脂质。
此外,亲本细胞的细胞膜应具有足够的稳定性,以避免在融合过程中发生破裂或破坏。
亲本的选择对于原生质体融合的成功也具有重要的影响。
亲本细胞的选择应基于其细胞类型和特性。
一般来说,亲本细胞应具有相似的细胞类型和功能,以确保融合后的细胞能够正常生长和分裂。
此外,亲本细胞的健康状态和生长条件也是选择的重要因素。
只有在健康状态良好且适宜的生长条件下,才能保证细胞的正常代谢和功能。
实验条件对于原生质体融合的成功也有一定的要求。
在进行原生质体融合实验时,需要注意以下几个方面。
首先,实验操作应严格遵循无菌操作规范,以避免细菌或其他微生物的污染。
其次,融合过程应在适宜的温度和pH条件下进行,以确保融合细胞的正常生长和代谢。
此外,实验中所使用的培养基和培养条件也要根据亲本细胞的特性进行调整,以提供适宜的营养和环境条件。
最后,实验过程中还需要进行适当的观察和监测,以确保融合细胞的健康状态和稳定性。
总结起来,原生质体融合对亲本的要求主要包括细胞融合的机制、亲本的选择以及实验条件等方面。
亲本细胞的细胞膜应具有融合能力和稳定性,以确保融合过程的顺利进行。
亲本的选择应基于其细胞类型和特性,以保证融合后的细胞能够正常生长和分裂。
实验条件应严格控制,包括无菌操作、适宜的温度和pH条件、合适的培养基和培养条件等。
通过遵循这些要求,可以提高原生质体融合实验的成功率,并为后续的研究工作奠定基础。
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实验四酵母菌原生质体细胞融合
(一)实验目的
学习以酵母菌为材料的原生质体细胞融合的方法。
(二)原理(略)
(三)实验材料
1.菌种:S.cerevisiae Y-1 a ade-,S.cerevisiae Y-2 his、leu、thr。
2.培养基:
(1)完全培养基(YPAD):葡萄糖2%,酵母膏1%,盐酸腺嘌呤0.04%,蛋白胨2%,pH5.5
(2)基本培养基:葡萄糖2%,YNB0.67%,pH5.5,琼脂2%(处理琼脂)(3)再生完全培养基:每100毫升完全培养基中加入18.2g山梨醇。
固体再加入2%琼脂。
(4)再生完全培养基软琼脂:组分同再生完全培养基,加入0.8~1%琼脂。
(5)再生基本培养基:与基本培养基组分相同,加入18.2%山梨醇,再加入处理琼脂2%。
(6)再生基本培养基软琼脂:组分同再生基本培养基,加入处理琼脂0.8~1%。
(7)生孢子培养基
3.溶液:
(1)ST溶液:1mol/L山梨醇,0.01mol/Ltris-HCl(pH7.4)
(2)Zymolyase酶混合液:10mLST溶液,0.2mL0.05mol/L EDTA(pH7.5),Zymolyase酶1mg,过滤除菌
(3)STC溶液:ST溶液中,加入0.01mol/LCaCl2
(4)PTC溶液:35%PEG-4000,0.01mol/L tris-HCl(pH7.4),0.01mol/LCaCl2(5)0.05mol/LEDTA溶液
(6)0.5mol/Lβ-巯基乙醇
(四)方法与步骤
1.菌体前培养
分别从斜面取1环菌种接种于装有20mL完全培养基的250mL三角瓶中,30℃振荡培养16~18h;分别取2mL培养物接种于装有20mL完全培养基的250mL三角瓶中,30℃振荡培养6~8h,呈对数生长状态。
将上述培养液分别离心(3500r/min,10min)收集菌体,用10mL 无菌水离心洗涤菌体两次,尽可能出去杂质。
2.原生质体制备
(1)将两亲本细胞分别悬浮于10mL溶液(25mL0.05mol/LEDTA和
1mL0.5mol/Lβ-巯基乙醇混合液)中,30℃振荡处理10min。
(2)分别取1mL处理菌液,适当稀释后,以血球计数板直接测定或以活菌计数方法测定未经酶处理的细胞数。
(3)离心(3500r/min,10min)收集菌体。
(4)将菌体分别悬浮于9mL Zymolyase酶混合液中,30℃振荡反应40~60min。
随时用显微镜观察细胞形成原生质体情况。
(5)离心(3000r/min,10min)收集原生质体细胞;用9mLST溶液洗涤离心1次,之后将细胞悬浮于9mLST溶液中。
(6)测定剩余细胞数:取1mL细胞悬液于9mL无菌水中摇匀,适当稀释后,以活菌计数法测定酶处理后剩余细胞数,并计算原生质体形成率。
(7)将剩余的原生质体细胞液离心(3000r/min,10min)收集原生质体,之后分别悬浮于8mLSTC溶液中。
3.原生质体再生
分别取两亲本原生质体1mL,以STC溶液作适当稀释,取0.1mL稀释液至于冷却至45~50℃的再生完全培养基软琼脂(上层)6mL中,摇匀迅速倒入底层为再生完全培养基平板上,30℃培养3~4天,计算菌落数。
该菌落数即为单菌原生质体的再生细胞数。
分别计算两亲本的原生质体再生率。
4.原生质体融合
(1)各取1mL亲本原生质体细胞(等量细胞,浓度为106个/mL)混合,30℃振荡培养15min。
离心(2000r/min,20min)收集细胞。
(2)于菌体中加入1mL促融剂PTC溶液,30℃振荡处理20min。
离心(2000r/min,20min)收集细胞,用5mLSTC溶液洗涤细胞1次,最
后将细胞悬浮于1mL 中。
(3)再生:取0.1mLSTC菌液,加入到冷却至45~50℃的6mL再生基本培养基软琼脂中混匀,迅速倒入底层为再生基本培养基平板上,30℃
培养5~7天,平板上菌落数即为融合子数。
计算融合率。
5.融合子的确定
(1)融合子能在基本培养基平板上生长发育,形成菌落,而对照两亲本菌株均不能在此培养基平板上生长。
(2)生孢能力的测定:两亲本为相同的接合型细胞,不能通过有性杂交实现细胞融合,形成二倍体杂合细胞;通过原生质体细胞融合,可获得
同型二倍体细胞(a/a),该二倍体细胞不具生孢能力,但具有接合能
力,可以与α型单倍体细胞杂交,生成三倍体细胞(a/a/α)。
附:
1.YNB培养基配方:由以下三种溶液组成
A液(维生素混合液):维生素B11000mg,烟酸400mg,吡哆醇400mg,生物素20mg,泛酸钙2000mg,核黄素200mg,肌醇10000mg,对氨基苯甲酸200mg,无离子水1000mL。
B液(微量元素液):H3BO4 500mg,MnSO4·7H2O 200mg,ZnSO4·7H2O 400mg,CuSO4·5H2O 40mg,FeCl3·6H2O 100mg,Na2MnO4200mg,无离子水1000mL。
C液(其他无机盐液):KI0.1mg,CaCl2·2H2O 0.1g,K2HPO4 0.15g,KH2PO4
0.85g,MgSO4·7H2O 0.5g,NaCl 0.1g,无离子水1000mL。
配制方法:取A液1mL,B液1mL,C液10mL,无离子水1000mL,混合,调pH值为6.5,即成。
说明:
(1)配制YNB时,先分别将以灭菌分装的A、B液各1mL与C液10mL,在无菌条件下混合,再将已灭菌的(NH)2SO4按0.5%的量加入到所需液体培养基的无离子水中,混匀即可。
2. 酵母生孢子培养基配方:
(1)含微量元素培养基
醋酸钠0.82g或NaAC·3H2O 1.36g,KCl 0.186g,微量元素溶液0.1mL,琼脂2g,蒸馏水100mL。
121℃灭菌25min。
微量元素溶液:Na2B4O7·10H2O 0.8g,(NH)6 Mo 7SO24·4H2O 1.9mg,KI 10mg,Fe2(SO4)3·6H2O 22.8g ,MnCl2·4H2O 3.6mg,ZnSO4·7H2O
30.8mg,CuSO4·5H2O 39mg,蒸馏水100mL,加入1mol/L盐酸使不
再混浊为止。
(2)棉子糖培养基
醋酸钠0.4g,棉子糖0.04g,琼脂2g,蒸馏水100毫升。
pH值6.0,115℃灭菌15min。
(3)胰蛋白胨培养基
NaCl 0.062g,醋酸钠0.5g,胰蛋白胨0.25g,琼脂2g,蒸馏水100mL,pH值6~7,115℃灭菌15min。