实验四 酵母菌原生质体细胞融合

实验四酵母菌原生质体细胞融合

（一）实验目的

学习以酵母菌为材料的原生质体细胞融合的方法。

（二）原理（略）

（三）实验材料

1.菌种：S.cerevisiae Y-1 a ade-，S.cerevisiae Y-2 his、leu、thr。

2.培养基：

（1）完全培养基（YPAD）：葡萄糖2%，酵母膏1%，盐酸腺嘌呤0.04%，蛋白胨2%，pH5.5

（2）基本培养基：葡萄糖2%，YNB0.67%，pH5.5，琼脂2%（处理琼脂）（3）再生完全培养基：每100毫升完全培养基中加入18.2g山梨醇。固体再加入2%琼脂。

（4）再生完全培养基软琼脂：组分同再生完全培养基，加入0.8～1%琼脂。（5）再生基本培养基：与基本培养基组分相同，加入18.2%山梨醇，再加入处理琼脂2%。

（6）再生基本培养基软琼脂：组分同再生基本培养基，加入处理琼脂0.8～1%。

（7）生孢子培养基

3.溶液：

（1）ST溶液：1mol/L山梨醇，0.01mol/Ltris-HCl（pH7.4）

（2）Zymolyase酶混合液：10mLST溶液，0.2mL0.05mol/L EDTA（pH7.5），Zymolyase酶1mg，过滤除菌

（3）STC溶液：ST溶液中，加入0.01mol/LCaCl2

（4）PTC溶液：35%PEG-4000，0.01mol/L tris-HCl（pH7.4），0.01mol/LCaCl2（5）0.05mol/LEDTA溶液

（6）0.5mol/Lβ-巯基乙醇

（四）方法与步骤

1.菌体前培养

分别从斜面取1环菌种接种于装有20mL完全培养基的250mL三角瓶中，30℃振荡培养16～18h；分别取2mL培养物接种于装有20mL完全培养基的250mL三角瓶中，30℃振荡培养6～8h，呈对数生长状态。

将上述培养液分别离心（3500r/min，10min）收集菌体，用10mL 无菌水离心洗涤菌体两次，尽可能出去杂质。

2.原生质体制备

（1）将两亲本细胞分别悬浮于10mL溶液（25mL0.05mol/LEDTA和

1mL0.5mol/Lβ-巯基乙醇混合液）中，30℃振荡处理10min。

（2）分别取1mL处理菌液，适当稀释后，以血球计数板直接测定或以活菌计数方法测定未经酶处理的细胞数。

（3）离心（3500r/min，10min）收集菌体。

（4）将菌体分别悬浮于9mL Zymolyase酶混合液中，30℃振荡反应40～60min。随时用显微镜观察细胞形成原生质体情况。

（5）离心（3000r/min，10min）收集原生质体细胞；用9mLST溶液洗涤离心1次，之后将细胞悬浮于9mLST溶液中。

（6）测定剩余细胞数：取1mL细胞悬液于9mL无菌水中摇匀，适当稀释后，以活菌计数法测定酶处理后剩余细胞数，并计算原生质体形成率。（7）将剩余的原生质体细胞液离心（3000r/min，10min）收集原生质体，之后分别悬浮于8mLSTC溶液中。

3.原生质体再生

分别取两亲本原生质体1mL，以STC溶液作适当稀释，取0.1mL稀释液至于冷却至45～50℃的再生完全培养基软琼脂（上层）6mL中，摇匀迅速倒入底层为再生完全培养基平板上，30℃培养3～4天，计算菌落数。该菌落数即为单菌原生质体的再生细胞数。分别计算两亲本的原生质体再生率。

4.原生质体融合

（1）各取1mL亲本原生质体细胞（等量细胞，浓度为106个/mL）混合，30℃振荡培养15min。离心（2000r/min，20min）收集细胞。

（2）于菌体中加入1mL促融剂PTC溶液，30℃振荡处理20min。离心（2000r/min，20min）收集细胞，用5mLSTC溶液洗涤细胞1次，最

后将细胞悬浮于1mL 中。

（3）再生：取0.1mLSTC菌液，加入到冷却至45～50℃的6mL再生基本培养基软琼脂中混匀，迅速倒入底层为再生基本培养基平板上，30℃

培养5～7天，平板上菌落数即为融合子数。计算融合率。

5.融合子的确定

（1）融合子能在基本培养基平板上生长发育，形成菌落，而对照两亲本菌株均不能在此培养基平板上生长。

（2）生孢能力的测定：两亲本为相同的接合型细胞，不能通过有性杂交实现细胞融合，形成二倍体杂合细胞；通过原生质体细胞融合，可获得

同型二倍体细胞（a/a），该二倍体细胞不具生孢能力，但具有接合能

力，可以与α型单倍体细胞杂交，生成三倍体细胞（a/a/α）。

附：

1.YNB培养基配方：由以下三种溶液组成

A液（维生素混合液）：维生素B11000mg，烟酸400mg，吡哆醇400mg，生物素20mg，泛酸钙2000mg，核黄素200mg，肌醇10000mg，对氨基苯甲酸200mg，无离子水1000mL。

B液（微量元素液）：H3BO4 500mg，MnSO4·7H2O 200mg，ZnSO4·7H2O 400mg，CuSO4·5H2O 40mg，FeCl3·6H2O 100mg，Na2MnO4200mg,无离子水1000mL。C液（其他无机盐液）：KI0.1mg，CaCl2·2H2O 0.1g，K2HPO4 0.15g，KH2PO4

0.85g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.1g，无离子水1000mL。

配制方法：取A液1mL，B液1mL，C液10mL，无离子水1000mL，混合，调pH值为6.5，即成。

说明：

（1）配制YNB时，先分别将以灭菌分装的A、B液各1mL与C液10mL，在无菌条件下混合，再将已灭菌的（NH）2SO4按0.5%的量加入到所需液体培养基的无离子水中，混匀即可。

2. 酵母生孢子培养基配方：

（1）含微量元素培养基

醋酸钠0.82g或NaAC·3H2O 1.36g，KCl 0.186g，微量元素溶液0.1mL，琼脂2g，蒸馏水100mL。121℃灭菌25min。

微量元素溶液：Na2B4O7·10H2O 0.8g，（NH）6 Mo 7SO24·4H2O 1.9mg,KI 10mg，Fe2（SO4）3·6H2O 22.8g ，MnCl2·4H2O 3.6mg，ZnSO4·7H2O

30.8mg，CuSO4·5H2O 39mg，蒸馏水100mL，加入1mol/L盐酸使不

再混浊为止。

（2）棉子糖培养基

醋酸钠0.4g，棉子糖0.04g，琼脂2g，蒸馏水100毫升。pH值6.0，115℃灭菌15min。

（3）胰蛋白胨培养基

NaCl 0.062g，醋酸钠0.5g，胰蛋白胨0.25g，琼脂2g，蒸馏水100mL，pH值6～7，115℃灭菌15min。