酿酒酵母质粒的提取
酿酒酵母的分离纯化 - 副本
酿酒酵母的筛选流程图
调查发现 开发设计 采集样品 增殖培养 （或富集）
筛选（初筛、复筛）
原种斜面
纯种分离
通过筛选的菌种斜面
性能鉴定
育种出发菌
菌种保藏机构提供的纯种斜面
菌种保藏
材料与仪器 低温保藏的酿酒酵母，麦芽汁培养基 9个平板、6支大试管、6支小试管、吸管（1ml、10ml）、 涂布棒、三角瓶等待用
3 耐酸酵母菌株的相对生活力测试：将供试的各酵母菌 株，分别接种于pH值相同的麦芽汁培养基，培养测定选出 的各酵母菌株在特定pH值条件下生活力的差异性，选择生 长较好的菌株作后继供试菌株。
•
4 耐酸酵母菌株的发酵环境生态适应性测试：将选出的 耐酸酵母菌与其他非耐酸酵母菌，作混菌对比培养，选择 相对生活力强、种群密度大的耐酸酵母菌株作后继供试菌 株。 • 5 耐酸酵母菌株的生产性能测试：将选出的各耐酸酵母 菌株，分别接种于常规酒精发酵培养基中。培养3d~6d后， 定时观察、测定产酒情况、产酒与pH值变化的相关性，了 解各酵母菌株的生产性能。
试验方法 • 1、酵母菌的分离接种 • 2、耐酸酵母菌的分离与筛选 • 3、性能鉴定
准备试验 • （1）将实验所用的9个平板、6支大试管、6支小试管、吸 管（1ml、10ml）、涂布棒、三角瓶等干杀待用 （2）用100ml容量瓶配制质量浓度为0.9%的生理盐水，分 装入6支大试管，各9ml，121℃高压湿热灭菌15min • （3）称取麦芽汁琼脂粉8g溶解至约200ml，加热煮沸， 分装，121℃高压湿热灭菌15min • （4）将湿热灭菌后的麦芽汁琼脂加热溶解冷却至约 50~60℃，倒平板，9个板，每个约15ml；倒小试管，每 管约5ml，制作斜面
酵母的筛选 • 酵母菌在长期的白酒发酵生产过程中因不断的生长繁殖， 将产生一定量的自发突变，一旦“耐酸突变”发生，耐酸 突变个体因“自然选择与适应”，将出现并存活于窖底泥、 黄浆水等低pH值环境中；因此，采用酸度呈梯度差异的 选择培养基，利用微生物学、遗传学等的相关原理与技术 方法，通过菌种的分离、纯化、扩培以及筛选、鉴定等相 关试验，以pH值呈梯度差异的培养基为选择条件，进行 了酵母菌的筛选。
酿酒酵母载体质粒
酿酒酵母载体质粒
酿酒酵母载体质粒是指用于将目的基因引入酿酒酵母细胞中的质粒。
质粒是一种环状的双链DNA分子，可独立于染色体存
在并繁殖。
酿酒酵母载体质粒通常包含以下元素：
1. 原核起始子（promoter）：用于启动目的基因的转录，使其
产生蛋白质。
2. 选择性标记基因（selectable marker gene）：常用的选择性
标记基因包括对抗生素的抗性基因（如抗生素抗性基因）或与缺失酵母株的互补基因（如RNA聚合酶II基因）。
选择性标
记基因能够在酵母细胞中提供抗性，使得只有表达该基因的转化细胞能够生长。
3. 多克隆位点（multiple cloning site，MCS）：用于将目的基
因插入质粒中，一般由多个限制性内切酶切割位点组成，方便将外源基因插入质粒。
4. 酿酒酵母起始子（promoter）：用于应用在酿酒酵母细胞中
工作的目的基因。
5. 终止子（terminator）：用于终止目的基因的转录。
通过插入目的基因到酿酒酵母载体质粒中，并经由转化等方法将质粒引入酿酒酵母细胞中，可以使得酵母细胞表达目的基因，从而进行相应的功能研究和应用实验。
这种酿酒酵母载体质粒在酿酒酵母遗传工程中起到了重要作用。
质粒的酿酒酵母转化实验报告
酿酒酵母转化实验报告摘要本文介绍了酿酒酵母转化实验的实验步骤和实验结果。
首先，介绍了实验所使用的材料和器材，以及实验的准备步骤，包括菌株的提取、培养基的种植和抗生素的添加等。
其次，介绍了质粒转化的步骤，包括提取质粒、构建质粒等。
最后，介绍了实验结果，包括质粒转化后酵母菌株的抗性检测和质粒转化效率的估算等。
关键词：酿酒酵母，质粒转化，抗性检测，质粒转化效率1. 实验简介酿酒酵母转化实验是一种常用的基因工程实验，它是将外源基因转入酿酒酵母中，以改变酵母的生理特性和功能的一种方法。
通过质粒转化，可以将外源基因转入酿酒酵母，从而改变酵母的生理特性和功能，为酿酒酵母的改良和研究提供了便利。
2. 实验材料和器材（1）材料：酿酒酵母菌株，质粒，抗生素，营养培养基，细胞溶解剂；（2）器材：离心机，离心管，烧杯，热水浴，烧杯架，离心瓶，烧杯支架，温度控制器，离心管支架，摇床，培养箱等。
3. 实验步骤（1）菌株提取：将酿酒酵母菌株放入营养培养基中，摇床培养24小时，然后用离心机离心提取菌液；（2）培养基种植：将菌液滴入营养培养基中，放入培养箱培养24小时；（3）抗生素添加：将抗生素添加到营养培养基中，放入培养箱培养24小时；（4）质粒提取：将质粒放入烧杯中，加入细胞溶解剂，热水浴溶解，然后用离心机离心；（5）构建质粒：将质粒和菌液混合，放入烧杯中，加入CaCl2，放入热水浴37℃反应30min，然后用离心机离心；（6）质粒转化：将离心后的质粒液滴入培养基中，放入培养箱培养24小时；（7）抗性检测：将质粒转化后的酵母菌株放入营养培养基中，添加抗生素，放入培养箱培养24小时，观察菌株是否有抗性。
4. 实验结果（1）质粒转化后酵母菌株具有抗性：质粒转化后的酵母菌株在抗生素的作用下仍能够正常生长，表明质粒转化后的酵母菌株具有抗性。
（2）质粒转化效率估算：通过对质粒转化后的酵母菌株的抗性检测，估算出质粒转化的效率为85%。
5. 结论通过本实验，我们可以得出结论：酿酒酵母质粒转化实验成功，质粒转化后的酵母菌株具有抗性，质粒转化效率估算为85%。
酿酒 分离
酿酒过程中的酵母分离是一个关键步骤，它确保了酿造过程中使用的是纯净且适合特定酒种的酵母菌株。
以下是一些酿酒酵母分离的基本步骤和注意事项：
1. 样品采集：酿酒酵母通常来源于发酵液、酒糟或酵母泥。
采集样品时，应确保工具的无菌操作，避免污染。
2. 分离纯化：将采集的样品进行适当的稀释，然后取一定量涂布于选择性培养基上，如YEPD培养基，这是一种常用的富集培养基。
在适当的温度（通常是28℃）下培养几天，以便酵母生长形成单菌落。
3. 单菌落挑选：在培养基上，挑选出不同的单菌落，这可以通过观察菌落的颜色、形状和质地来初步判断酵母的种类。
4. 形态鉴定：将挑选出的单菌落接种到WL鉴别培养基上，进一步观察和鉴定。
酿酒酵母在WL培养基上通常呈现为奶油色带有绿色、不透明，形状为球形、光滑、突起。
5. 生理生化测试：进行一系列的生理生化测试，以确定酵母的种属。
这些测试包括发酵能力、产生酒精的类型和数量、对不同碳源和氮源的利用等。
6. 分子生物学鉴定：为了更准确地鉴定酵母菌株，可以采用分子生物学方法，如PCR和DNA测序，分析其核糖体RNA（rRNA）或内部转录间隔区（ITS）等基因序列。
7. 保存与应用：经过鉴定和性能测试的酵母菌株可以保存于-4℃的冰箱中，用于未来的酿造。
在实际酿造过程中，根据酵母的特性选择合适的接种量和发酵条件。
在整个分离和纯化过程中，无菌操作是关键，避免任何外来的污染。
此外，记录所有的操作步骤和结果也是非常重要的，以便于后续的跟踪和分析。
在酵母的应用上，还需考虑其对酿造条件的适应性，以及是否能产生期望的风味特征。
质粒提取总结(原理、小提、中提、浓度测定)
本资料为word版本，可以直接编辑和打印，感谢您的下载
质粒提取总结(原理、小提、中提、浓度测定)
地点：__________________
时间：__________________
说明：本资料适用于约定双方经过谈判，协商而共同承认，共同遵守的责任与义务，仅供参考，文档可直接下载或修改，不需要的部分可直接删除，使用时请详细阅读内容
很多人对NaOH的作用误以为是为了让基因组DNA变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关DNA变性复性的描述所导致。有人不禁要问，既然是NaOH溶解的细胞，那为什么要加SDS呢？那是为下一步操作做的铺垫。这一步要记住两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。基因组DNA的断裂会带来麻烦，后面我再详细说明。
酵母质粒的提取注意事项
酵母质粒的提取注意事项1. 实验前准备在进行酵母质粒提取实验之前，需要准备好所需材料和试剂。
常用的材料包括酵母培养物、细胞裂解液、酶切酶、离心管、离心机等。
试剂方面，需要注意购买高质量的试剂，并按照说明书的要求保存和使用。
2. 细胞培养与处理在进行酵母质粒提取实验之前，需要进行酵母菌的培养和处理。
首先，将酵母菌接种到含有所需培养基的琼脂糖平板上，培养一夜，然后挑取单个菌落转移到液体培养基中，继续培养至所需菌量。
此外，在进行酵母菌细胞处理时，需要注意细胞浓度的控制，避免浓度过高或过低对实验结果产生影响。
3. 细胞裂解与质粒提取酵母菌细胞裂解是酵母质粒提取的重要步骤。
一般情况下，细胞裂解可通过化学方法、机械方法或酶解方法实现。
其中，酶解方法常用于酵母菌质粒提取，具有操作简单、效果较好的特点。
在进行细胞裂解时，需要注意裂解液的选择和浓度，以及裂解时间和温度的控制，以确保细胞完全裂解，质粒DNA充分释放。
4. 质粒DNA纯化与保存在进行质粒提取后，需要对提取得到的质粒DNA进行纯化和保存。
纯化可以通过酚/氯仿法、硅胶柱纯化法或商用质粒纯化试剂盒等方法实现。
在选择纯化方法时，需要根据实验要求和样品特点进行选择，并根据说明书的要求进行操作。
纯化后的质粒DNA应及时保存，可以用TE缓冲液稀释保存在-20°C或-80°C的冰箱中，以避免质粒DNA的降解和损失。
5. 实验操作注意事项在进行酵母质粒提取实验时，还需要注意以下几点操作事项：- 实验室操作要严格遵守无菌操作的要求，以避免外源性DNA的污染。
- 实验过程中注意个人防护，佩戴手套、口罩和实验服，避免实验中的化学品对身体造成伤害。
- 实验前应仔细阅读所用试剂的说明书，了解其性质和使用方法，按照要求准确称取和调配试剂。
- 实验中的离心操作要注意离心管的放置位置和离心速度的选择，以避免样品的溢出和离心管的破裂。
- 实验后要及时清洗实验台面和相关器材，保持实验环境的整洁和无菌。
一种快速、有效、经济的提取酵母质粒的方法
一种快速、有效、经济的提取酵母质粒的方法
熊福银;林艳丽;吴晓洁;周艳荣;邓继先;陈红星
【期刊名称】《生物技术通讯》
【年(卷),期】2009(20)3
【摘要】目的:建立一种经济有效、快速简便、稳定的提取酵母质粒的方法.方法:用葡糖苷酸酶消化酵母细胞壁以获取原生质体,然后采用碱裂解法裂解原生质体以获得质粒.结果:与采用商品化离心柱法试剂盒所提取的质粒相比,用该法获取的酵母质粒在PCR分析及转化效果方面没有差异.结论:建立了一种经济有效、快速简便、稳定的提取酵母质粒的方法.
【总页数】2页(P386-387)
【作者】熊福银;林艳丽;吴晓洁;周艳荣;邓继先;陈红星
【作者单位】军事医学科学院,生物工程研究所,北京,100071;军事医学科学院,生物工程研究所,北京,100071;军事医学科学院,生物工程研究所,北京,100071;军事医学科学院,生物工程研究所,北京,100071;军事医学科学院,生物工程研究所,北
京,100071;军事医学科学院,生物工程研究所,北京,100071
【正文语种】中文
【中图分类】Q78
【相关文献】
1.一种快速高效提取酵母质粒的方法 [J], 张怡;刘坤;曹鹏;魏森;韦丹丹;杜建;李鹏坤;李成伟
2.一种快速提取质粒DNA鉴别重组克隆的方法 [J], 何冬兰;余金龙;邵坤彦;邵洁云
3.一种快速提取质粒DNA用于鉴别重组克隆的方法 [J], 郭旭东;毛舒燕;侯冬霞;旭日干
4.一种简便的适用于酵母双杂交系统的酵母质粒提取方法 [J], 苑丽娜;王定和;王永杰;郭佳;单卫星
5.一种从酵母菌转化子中分离、检测重组质粒的有效方法 [J], 刘巍峰;高东
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
质粒抽提的8大窍门
质粒抽提的8大窍门时间：2010-02-04 09:42:01 来源：作者：点击：480次1、摇菌时间过夜培养是一个普遍接受的概念，而且适合大部分情况。
如果出现了问题，调整培养时间会有帮助：Nick 多，则增加培养时间；酶切出现问题，则减少培养时间。
2、起始菌体量大家习惯说“从多少 ml 菌液中抽提质粒”，但一定要养成每次都观察菌体量的习惯，因为质粒毕竟是在菌体中，而且，抽提质粒所用的试剂量，都只与菌体量有关。
3、菌体的彻底悬浮如果没有彻底悬浮菌体，则残留的菌体团块在溶液 II 加入后，变成一个外围几乎彻底裂解，往里不完全裂解，中间没有裂解的团块。
这个团块在溶液 III 加入后，会有一部分蛋白质继续存在于溶液中，成为蛋白质残留的最大根源。
4、使用相对过量的试剂这是适合所有核酸抽提的建议。
试剂相对过量的好处是：稳定性好，纯度高，操作更简单。
如果认为这样不经济，就少用一点菌体。
5、裂解时间加入溶液 II 后，混匀，体系最好能立即变得清澈。
体系如果变得清澈了，马上加入溶液 III 中和。
如果体系不马上变清澈，下次少用一点菌液，或者多用一点溶液。
如今的质粒设计得越来越复杂了，奇怪的现象也越来越多，而所有的奇怪现象，多与裂解时间有关。
6、中和的操作在1.5ml离心管中加入溶液 III 后，先颠倒两次，使管底朝上，用指头弹击管底数次，再颠倒混匀。
效果非常好。
7、中和后的离心去蛋白一定要将蛋白质彻底离心下去。
如果发现离心后仍然有蛋白质漂浮在液面，继续离心的效果并不好；而将上清倒入另外一个离心管中，再离心，效果要好许多。
【降低 RNA 残留的方法】RNA的去除，首先是使用 RNase 消化。
在溶液 I 中加入高浓度的 RNase A (100ug/ml)，或者用含 25ug RNase A/ml TE 溶解抽提好的质粒，都可以降低 RNA残留，但都不能彻底去除。
幸运的是，RNA 的残留并不影响酶切等最常用的用途。
6分钟提取质粒
6分钟提取质粒
"6分钟提取质粒" 通常指的是在分子生物学实验中，从细菌中提取质粒的过程，该过程可以在相对较短的时间内完成。
提取质粒是为了获取质粒中的目标基因、DNA片段或其他重要的遗传物质。
以下是一般的质粒提取步骤，这个过程可以在大约6分钟内完成：
1. 培养菌株：
- 开始前，先在培养基中培养含有目标质粒的大肠杆菌（E. coli）菌株。
2. 离心：
- 将培养好的菌液进行离心，将菌体沉淀。
3. 去除培养基：
- 弃去上清液，保留含有大肠杆菌的菌体沉淀。
4. 溶解：
- 使用缓冲液溶解菌体，使DNA释放。
5. 加入溶解剂：
- 加入一些溶解剂，如碱性SDS（十二烷基硫酸钠），破坏膜脂，释放DNA。
6. 快速离心：
- 进行瞬时离心，将膜脂等杂质快速沉淀。
7. 取上清：
- 取上清液中含有的质粒DNA。
8. 沉淀：
- 加入醋酸等溶液，使DNA沉淀。
9. 洗涤：
- 对DNA沉淀进行洗涤，去除残余的盐和其他污染物。
10. 溶解：
- 最后，用适当的缓冲液溶解沉淀的质粒DNA。
这样的质粒提取方法通常使用快速、高效的离心和溶解步骤，使得整个过程可以在相对较短的时间内完成。
实际提取时间可能因具体实验方案和使用的提取试剂盒而有所不同。
酵母抽提物生产流程
酵母抽提物生产流程第一篇：酵母抽提物生产流程酵母提取物前处理和自溶：废酵母→清水洗涤→过滤→酵母泥→加水调至含干酵母10％～15％→调pH至4．5→夹层热保温45℃～55℃→自溶24小时。
自溶期间每隔1小时开动搅拌2～5分钟，搅拌有利于酶类和酵母内大分子物质充分接触，提高单位接触面底物的浓度，从而加快细胞内酶的反应速度。
为了加速细胞的自溶，还可添加2％～3％的氯化钠，其对提高抽提物得率和上清液氨基氮含量有一定促进作用。
酶解：自溶结束后，在自溶酵母液中加入0.2％复合酶，调整物料pH为7．0，在50℃条件下酶解24小时。
酶解结束后，经纳米对撞机在150MP～200MP下进行破碎。
其作用原理是：物料形成150MP以上的高压射流，经分流装置被分成两股，然后，两股高压射流体在一个腔体内发生对撞，产生瞬时高压使振荡片振荡，形成频率高达20000赫兹以上的超声波，酵母细胞在对撞和超声波的强大压力的共同作用下发生纳米级破碎。
经纳米对撞机处理后，用显微镜检测，混合物料中大多数为空腔细胞和大量碎片，酵母细胞壁的破碎率可达97．9％，抽提物得率为91．8％。
破碎液经进一步纯化、浓缩后可制得淡黄色的胶木抽提物制品。
采用上述方法制得的酵母抽提物，肌苷酸（I）含量为1．27g／100g，鸟苷酸（G）含量为1．498g／100g牞（I＋G）为2．76g／100g。
与日本日研公司同类产品相比，指标分别提高294．4％、626．82％、413．96％。
具体工艺：废酵母预处理【120目过筛→脱苦→调整母液浓度(10%~15%)→加促进剂（2%Nacl）→自溶（温度50℃，pH5.2～6.0，24h）】→酶解（0.2%,pH7.0，50℃，24h）→纳米对撞机破碎（150MP～200MP，循环2～4次）→加麦芽根酶解酶（70℃，3～4h）→加热灭酶（95℃，10分钟）→离心分离→酵母上清液浓缩→酵母抽提物产品。
以上所述啤酒酵母抽提物的提取技术，其关键点是将传统的自溶、酶解方法与先进的纳米破碎技术相结合，利用高压撞击作用破碎酵母细胞壁，从而使其内容物最大限度溶出，提高制品中氨基酸含量。
酵母高纯度质粒大量快速提取试剂盒(离心柱型)操作方法及步骤说明书
酵母高纯度质粒大量快速提取试剂盒（离心柱型）目录号：PL19目录编号包装单位PL1901 10次适用范围：适用于大规模高纯度酵母质粒制备试剂盒组成、储存、稳定性：试剂盒组成保存10次（PL1901）RNaseA（10mg/ml）－20℃750µl破壁酶4℃1g（常温运输）溶液YP1 4℃75 ml溶液YP2 室温75 ml溶液YP3 室温110 ml去蛋白液PD 室温100 ml漂洗液WB 室温25 ml x 2第一次使用前按说明加指定量乙醇洗脱缓冲液EB 室温20 ml吸附柱DC 室温10个收集管（50ml）室温10个本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。
储存事项:1.第一次使用时，将试剂盒所带的全部RNase A加入溶液YP1（终浓度100µg/ml）置于4℃保存。
如果溶液YP1中RNase A失活，提取的质粒可能会有微量RNA残留，在溶液YP1中补加RNase A即可。
2.环境温度低时溶液YP2中SDS可能会析出浑浊或者沉淀，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清，不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。
3.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。
产品介绍：本试剂盒采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞并结合破壁酶特异消化酵母细胞壁，能在1小时内从酵母培养液中分离出高纯度质粒DNA。
酵母收集后,加入破壁酶去除细胞壁后,然后碱裂法裂解细胞，离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低PH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后低盐、高PH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。
产品特点：1.离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。
克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
2.快速、方便，不需要使用有毒的苯酚、氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀。
获得的质粒产量高、纯度好，可以直接用于酶切、转化、PCR、体外转录、测序等各种分子生物学实验。
质粒抽提原理与详细操作步骤
质粒抽提原理与详细操作步骤质粒抽提,实验室必备技能之一质粒质粒存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，是细胞染色体外能够自主复制的很小的环状DNA 分子。
质粒抽提从细菌中分离质粒DNA的方法包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。
采用强碱液、加热或溶菌酶（主要针对革兰氏阳性细菌）可以破坏菌体细胞壁，十二烷基磺酸钠（SDS）和 TritonX-100（一般很少使用）可使细胞膜裂解。
经溶菌酶和SDS或 Triton X-100处理后，细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上，同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多，易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。
当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA变性，而共价闭合环状DNA(Covalently closed circular DNA，简称cccDNA）的两条链不会相互分开。
当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性，而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起，而质粒DNA双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中。
质粒抽提最常用的方法是碱裂解法，它具有得率高、适用面广、快速和纯度高等特点。
当然，碱裂解法也有缺陷：容易导致不可逆的变性。
要降低不可逆的变性，就要控制好碱裂解的时间。
碱裂解法抽提质粒需要用到以下三种溶液溶液Ⅰ50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris-Cl（pH 8.0），10 mmol/L EDTA（pH 8.0），在15 psi 压力下蒸汽灭菌15 min，4℃保存。
溶液Ⅱ0.2 mmol/L NaOH（从10 mmol/L 贮存液中现用现稀释），10 g/L SDS（室温保存）。
溶液Ⅲ5 mol/L乙酸钾 60.0 mL，冰乙酸 11.5 mL，无菌水28.5 mL，4℃保存，使用时置于冰浴中。
下面介绍一下碱裂解法小提质粒的具体操作：01柱平衡：向吸附柱中加入500 μl平衡Buffer，12000 rpm离心30-60 s，倒掉收集管中的废液；注意：吸附柱平衡后可最大限度激活硅基质膜，提高质粒的得率；吸附柱平衡后应立即使用，长时间放置会影响其吸附效果。
一种快速、有效、经济的提取酵母质粒的方法
熊福银等：一种快速、有效、经济的提取酵母质粒的方法
机于４。Ｃ、１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心５ ｒａｉｎ， 将上清转移到另一离心管 中；
［摘要］ 目的：建立一种经济有效、快速简便、稳定的提取酵母质粒的方法。方法：用葡糖苷酸酶消化酵母细胞壁以获取原
生质体，然后采用碱裂解法裂解原生质体以获得质粒。结果：与采用商品化离心柱法试剂盒所提取的质粒相比，用该法获取
的酵母质粒在ＰＣＲ分析及转化效果方面没有差异。结论：建立了一种经济有效、快速简便、稳定的提取酵母质粒的方法。
１材料和方法
１．１材料
待提取质粒的目的酵母菌株（或酵母双杂交筛选获得的候
选阳性克隆）；葡糖苷酸酶购自Ｓｉｇｍａ公司；常规生化试剂均为国 产分析纯产品。
Ｔｒｉｓ－ＣＩ缓冲液：１００ ｍｍｏＬ／Ｌ（ｐＨ９．３）；ＭＰ缓冲液：１ ｍｏｌ／Ｌ 山梨醇，ｌ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣＩ，０．０１ ｍｏｌ／Ｌ冰醋酸（用ＮａＯＨ调节至
２种提取方法所得到的质粒各取１０灿，转化相同数量的大
肠杆菌ＤＨ５ａ，对转化所得到的菌落进行计数，以比较转化效率 （每种方法均重复３次），结果见表１。可以看出，手工提取质粒的 转化效率与商业试剂盒提取质粒的转化效率相近，且重复性较 好，说明手工提取方法稳定，可以作为实验窒常规方法使用。
表１ 手工提取质粒与商业试剂盒提取质粒转化效率的比较
［Ａｂｓｔｒａｃｔ】Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａ ｆａｓｔ，ｓｔａｂｌｅ ａｎｄ ｅｃｏｎｏｍｉｃａｌ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄ ｆｒｏｍ ｙｅａｓｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａｄｄ １３－ｇｌｕｃｕｍｎｉｄａｓｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｔＯ ｔｈｅ ｒｅｓｕｓｐｅｎｄｅｄ ｙｅａｓｔ ｃｅｌｌｓ．Ｍｉｘ ｗｅｌｌ ａｎｄ ｉｎｃｕｂａｔｅ ａｔ ３７℃ｆｏｒ １／２ ｔｏ ２ ｈｏｕｒｓ．Ａｄｄ ｌｙｓｉｓ ｓｏ— ｈｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ｓｐｈｅｒｏｐｌａｓｔ ｐｅｌｌｅｔ ｂｕｔ ｄｏ ｎｏｔ ｒｅｓｕｓｐｅｎｄ．Ｔｈｅｎ ａｄｄ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ．Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｈｅ ｓｕｐｅｒ－ ｎａｔａｎｔ ｃａｒｅｆｕｌｌｙ ｔｏ ａ ｆｒｅｓｈ ｍｉｃｒｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ｔｕｂｅ ａｎｄ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ ｔｈｅ ｐｌａｓｍｉｄ ｂｙ ｅｔｈａｎ０１．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ ｙｅａｓｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ，ｔｈｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ Ｗａｓ ｎｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｔｗｏ ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ： Ｗｅ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅ ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄ ｆｒｏｍ ｙｅａｓｔ ｂｙ １３一ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｉｓ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ａｎｄ ｆａｓｔ．Ｉｔ ｍａｙ ｂｅ ｕｓｅｄ ａｓ ａ ｒｅｇｕｌａｒ ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．
一种快速高效提取酵母质粒的方法
产率、 纯度 和对后 续 实验 的影 响等方 面进行 了比较 。结 果表 明 ， 与 另 外两种 方 法比较 ． 玻璃 珠液
氮法提 取酵 母质 粒具 有效 率 高、 质量 好 、 成本低 、 时间短 、 操 作 简单的优 点 。 可作 为 实验 室规 模化
提 取 酵 母 质 粒 的 常 用 方 法
Ｚ ＨＡＮＧ Ｙ ｉ ， Ｌ Ｉ Ｕ Ｋｕ ｎ， Ｃ Ａ０ Ｐ ｅ ｎ ｇ， Ｗ ＥＩ Ｓ ｅ ｎ， Ｗ Ｅｌ Ｄａ ｎ － ｄ ａ ｎ， ＤＵ Ｊ ｉ ａ ｎ， Ｌ ＩＰ ｅ ｎ ｇ － ｋ ｕ ｎ， Ｌ Ｉ Ｃ ｈ ｅ ｎ ｇ － ｗ ｅ ｉ ｜
（ Ｋ ｅ ｙ Ｌ ａ ｂ ｏ ｒ ａ ｔ ｏ ｒ ｙ ｏ ｆ Ｐ ｌ ａ ｎ ｔ Ｇ ｅ ｎ ｅ ｔ ｉ ｃ ｓ ａ ｎ ｄ Ｍｏ ｌ ｅ ｃ ｕ ｌ ａ ｒ Ｂ ｒ ｅ ｅ ｄ ｉ ｎ ｇ， Ｚｈ ｏ ｕ ｋ ｏ ｕ Ｎｏ ｒ ｍａ ｌ Ｕｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ， Ｚ ｈ ｏ ｕ ｋ ｏ ｕ ４ ６ ６ ０ ０１ ， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ）
Ａｂｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ： Ｐｌ ａ ｓ ｍｉ ｄ ｅ ｘ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｉ ｓ ａ ｎ ｉ ｍｐ ｏ ｒ ｔ ａ ｎ ｔ ｂ ｕ ｔ ｄ ｉ ｆ ｆ ｉ ｃ ｕ ｌ ｔ ｓ ｔ ｅ ｐ ｏ ｆ ｔ ｈｅ ｇ ｅ ｎ ｅ ｔ ｉ ｃ ｅ ｎ ｇ ｉ ｎ ｅ ｅ ｒ ｉ ｎ ｇ ｏ ｐ ｅ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓ， ｂｅ ｃ ａ ｕｓ ｅ ｏ ｆ ｔ ｈｅ ｙ ｅ ａ ｓ ｔ ｓ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ｗｉ ｔ ｈ ｔ ｏ ｕｇ ｈ ａ ｎｄ ｕ ｎｂ ｒ ｅ ａ ｋ ａ ｂ ｌ ｅ ｃ ｅ ｌ ｌ ｗａ ｌ １ ．Ｆ ｏ ｒ ｇ ｅ ｔ ｔ ｉ ｎ ｇ ｏ ｎ ｅ ｆ ａ ｓ ｔ ， ｓ ｉ ｍｐｌ ｅ， ｅ ｉｃ ｆ ｉ ｅ ｎ ｔ ａ ｎ ｄ ｓ ｔ ａ ｂ ｌ ｅ ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｏ ｆ ｐ ｌ ａ ｓ ｍｉ ｄ ｅ ｘ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｆ ｒ ｏ ｍ ｙ ｅ ａ ｓ ｔ ｓ， ｗｅ ｅ ｍｐ ｌ ｏ ｙ ｅ ｄ ｔ ｈ ｅ ｔ ｅ ｃ ｈ ｎｉ ｑ ｕ ｅ ｓ ｏ ｆ ａ ｇ ａ ｒ ｏ ｓ ｅ ｇ ｅ ｌ ｅ ｌ ｅ ｃ ｔ ｒ ｏ ｐ ｈ ｏ ｒ ｅ ｓ ｉ ｓ ， ｓ ｐｅ ｃ ｔ ｒ ｏ ｐ ｈ ｏ ｔ ｏ ｍｅ ｔ ｅ ｒ ａ ｎ ｄ Ｐ ＣＲ ａ ｍｐ ｌ ｉ ｉｃ ｆ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ， ａ ｎ ｄ ｃ ｏ ｍｐ ａ ｒ ｅ ｄ ｔ ｈ ｅ ｙ ｉ ｅ ｌ ｄ， ｐ ｕｒ ｉ ｔ ｙ ｏ ｆ ｐｌ ａ ｓ ｍｉ ｄｓ ｗｈｉ ｃ ｈ ｗｅ ｒ ｅ ｉ ｓ ｏ ｌ ａ ｔ ｅ ｄ ｆ ｒ ｏ ｍ ｙ ｅ ａ ｓ ｔ ｓ ｗｉ ｔ ｈ ｔ ｈｅ ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｓ ｏ ｆ ｇ ｌ ａ ｓ ｓ ｂ ｅ ａ ｄ ｓ － ｌ ｉ ｑ ｕ ｉ ｄ ｎ ｉ ｔ ｒ ｏ ｇ ｅ ｎ， ｓ ｎａ ｉ ｌ ａ ｓ ｅ ａ ｎｄ ｋｉ ｔ ．Ｔｈ ｅ ｒ ｅ ｓ ｕ ｌ ｔ ｓ ｓ ｈ ｏ ｗｅ ｄ ｔ ｈ ａ ｔ ｔ ｈ ｅ ｍｅ ｔ ｈｏ ｄ ｏ ｆ ｇ ｌ ａ ｓ ｓ ｂ ｅ ａ ｄ ｓ－ ｌ ｉ ｑ ｕｉ ｄ ｎｉ ｔ ｒ ｏ ｇ ｅ ｎ ｈ ａ ｄ ｔ ｈ ｅ ａ ｄ ｖ ａ ｎ ｔ ａ ｇ ｅ ｓ ｏ ｆ ｈ ｉ ｇ ｈ ｅ ｆ ｆ ｉ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｙ， ｇ ｏ ｏ ｄ ｑｕ ａ ｌ ｉ ｔ ｙ， ｌ ｏ ｗ ｃ ｏ ｓ ｔ ， ｓ ｉ ｍｐ ｌ ｅ ｏ ｐ ｅ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｉ ｎ ｃ ｏ ｎ ｔ ｒ ａ ｓ ｔ ｔ ｏ ｔ ｈ ｅ ｏ ｔ ｈ ｅ ｒ ｔ ｗｏ
质粒提取操作技巧
质粒提取实验材料：1.5ml EP管，枪头，高速离心机，恒温摇床，15/50 ml无菌离心管，水浴锅试剂：ddH2O，质粒小提试剂盒（天根），LB培养基，氨苄霉素，卡那霉素，感受态细菌，琼脂糖培养板实验步骤：1.LB固体培养基及琼脂糖培养板的制备：a)用双蒸水配制100mg/ml氨苄霉素、50mg/ml卡那霉素溶液，0.22μm滤器过滤，1.5ml EP管分装于-20保存；b)配制并高压灭菌LB固体培养基(自然冷却后4℃保存)：1L培养基含Tryptone(胰蛋白胨) 10g、Yeast Extract(酵母提取物) 5g、Nacl10g、再加入15g Agrose，定容到1L (玻璃瓶，此时不加Amp/Kana等抗生素)c)高压灭菌，待培养基自然冷却至50-60℃（温度高于75℃会导致Amp/Kana失效，但也不能太低，否则会使培养基提前凝固），取干净50ml离心管或高压灭菌过的小玻璃瓶，在无菌工作台中倒入冷却的LB培养基，并在按比例（配抗生素时的比例）加入氨苄/卡那霉素，摇匀。
小心倾倒至无菌10cm细菌培养皿中（不宜过多，一般8ml左右轻轻晃动能铺满整个皿底），待培养基自然冷却凝固。
培养板按照抗生素分类标记，继续在超净台（开风机）中倒置放置0.5~1h小时左右，使水分蒸发。
最后封口膜封口，装袋于4℃冰箱保存（注：一般平板应该按照实验需要多倒2~3个培养板，可能有培养板倒过程中产生气泡而不能正常使用）；2.质粒转化：a)在冰上缓慢融解感受态细菌，取30-50μl加入1ul浓度至少200~500ng/ul的质粒。
如果转化连接产物，每50微升感受态细菌加入2-10微升连接产物；（此步骤应严格在冰上操作）b)轻轻用手指弹动离心管，以混匀细菌和质粒或连接产物。
冰浴或冰水浴放置30分钟；c)42ºC水浴，热休克90sec；d)热休克后立即置于冰浴中，5分钟；e)加入500微升LB，37ºC 200rpm培养30-60min，并按比例加入相应的抗生素；f)在此期间准备清洗过的玻璃棒，喷酒精在超菌台紫外照射30min备用；g)将摇床上带培养基的EP管取出，室温2000rbp离心3min，此时应看到底部有白色沉淀；h)用枪吸去上清，剩下50-100ul，用枪将EP管底部的沉淀吹打混匀，在酒精灯旁，涂到含有相应抗生素的LB平板上，玻璃棒涂匀，37ºC恒温箱培养过夜不超过16h。
酿酒酵母嗜杀质粒(dsRNA)的提取与分离纯化 Extraction and Purification of the double-stranded
１． ．３琼脂糖凝胶电 （ ４ 泳 ． ，
检测用琼脂糖浓度为 １ ％，纯化时的琼脂糖浓度为 １％．电 压７Ｖ ． ０ ． ２ 泳电 ０，采用
水 平 式 电泳 ． 电 泳 缓 冲 液 为 Ｔｉ Ｈ （ ） 缓 冲 液 （ ０ ｍｏ／ Ｔｉ ２ｍｍｏ／ Ｅ Ｔ ｒ－ ｓ Ａｃ ＡＥ Ｔ ４ｍ ｌ ｒ， Ｌ ｓ ０ ｌ Ｄ Ａ， Ｌ ２ｍｍｏ／ Ｎ Ａ ， ．） ０ ｌ ａ ｃ ｐ １．以琼脂糖凝胶中加人终浓度为．． ／ 的澳化乙锭 （ Ｂ Ｌ Ｈ８ ０Ｓｇ ｌ ｕ ｍ Ｅ ）染色，在波长
５ 期
刘巍峰等： 酿酒酵母嗜杀质粒 （ｓ Ｎ ｄＲ Ａ）的提取与分离纯化
４ ３
图 Ｉ嗜杀菌 Ｅ Ｒ 的电 Ｒ ， 泳检测
图 ２各种菌的嗜杀质粒检测电泳图
（ 敏感 菌株〕
（ 敏感菌株）
嗜杀 活性 消除 菌
图 ３纯 化的 Ｌ和 ＭｄＲＮ 电泳 图 ｓ Ａ ａＡ ． ＤＮＡ／Ｈ ｎ Ｉ； Ｍｄ Ｒ ； Ｌ ｓ ＮＡ． ｉｄＱ ｂ ． ｓ ＮＡ Ｃ ｄ Ｒ ．
１ ． ３酿酒酵母的培养
嗜杀酵母 ２℃培养．ＹＥ Ｄ斜面活化菌株接一环于 ５ Ｙ Ｐ ２ Ｐ ｍ１ Ｄ液体培养基中，２℃培养 ２ 小时，按 １ Ｅ ２ ４ ％转 接大瓶 Ｙ Ｐ ２℃摇床培养 １ Ｅ Ｄ， ２ 天，再静置培养 １ 天． －２
１ ． ４嗜杀质粒的提取与纯化
１． ．１酿酒酵母嗜杀质粒 （ｓＮ ）的提取 ４ ｄ Ａ Ｒ 在 Ｆｉ 和Ｆ ｋ方法的基础上加以修改 （ 离心收集酵母菌 ｒｄ ｉ ｅ ｎ ４ ）
遗传 ＨＥ Ｄ Ｔ Ｓ ｅｉｇ １（）４－４ １９ ＲＥ ＩＡ （ ｉ ） ５： ４ ５ Ｂｊ ｎ ７ １ ９
酿酒酵母嗜杀质粒 （ｓ ＮＡ ｄＲ ）的提取与分离纯化
酵母的提取实验报告
酵母的提取实验报告一、实验目的本次实验旨在掌握从天然材料中提取酵母的方法，了解酵母的生长特性和提取过程中的关键因素，为后续的发酵实验和相关研究提供纯净的酵母样本。
二、实验原理酵母是一种单细胞真菌，在适宜的环境条件下能够迅速生长和繁殖。
本实验利用糖分丰富的培养基来吸引酵母，并通过一系列的分离和纯化步骤，将酵母从其他微生物和杂质中分离出来。
三、实验材料与设备1、材料新鲜水果（如葡萄、苹果等）白砂糖无菌水琼脂2、设备无菌培养皿显微镜移液器恒温培养箱离心机无菌过滤器四、实验步骤1、培养基制备称取一定量的白砂糖溶解于无菌水中，配制成含糖量约为 10%的溶液。
将琼脂加入上述溶液中，加热至琼脂完全溶解，制成固体培养基。
将培养基倒入无菌培养皿中，冷却凝固备用。
2、样本采集选取新鲜、无病害的水果，用无菌水冲洗干净。
将水果表面擦干，然后用无菌刀具将其切碎。
3、接种将切碎的水果放入无菌容器中，加入适量的无菌水，搅拌均匀。
用移液器吸取上述混合液，滴加在培养基表面，均匀涂布。
4、培养将接种后的培养皿放入恒温培养箱中，设定温度为 28℃ 30℃，培养 2 3 天。
5、观察与分离定期观察培养皿中菌落的生长情况。
在显微镜下观察菌落形态，确定酵母菌落。
用无菌移液器挑取酵母菌落，转移至新的培养基中进行纯化培养。
6、纯化重复上述培养和观察步骤，直至获得纯净的酵母菌株。
7、保存将纯化后的酵母菌株接种至含有适量培养基的无菌试管中，培养至对数生长期。
加入无菌甘油，使甘油终浓度为 15% 20%，混匀后置于－80℃冰箱中保存。
五、实验结果与分析1、培养结果经过 2 天的培养，培养基表面出现了多种菌落。
其中，酵母菌落呈现出圆形、湿润、表面光滑且有光泽的特点，颜色多为乳白色或淡黄色。
2、显微镜观察结果在显微镜下，酵母细胞呈椭圆形或球形，大小较为均匀，具有明显的细胞壁和细胞核。
3、纯化效果经过多次纯化培养，最终获得了纯净的酵母菌株，在培养基上生长形态一致，无其他杂菌污染。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
酿酒酵母质粒的提取
酵母细胞的细胞壁比较厚，不容易破壁，不如大肠杆菌的质粒容易提取，最近做了些酿酒酵母的实验，从酿酒酵母中提取质粒，现在就总结下实验的方法和步骤。
一、酵母细胞质粒提取步骤：
1、接种单菌落(待检测酵母细胞)于25mLYNB(补加氨基酸营养物)培养基中，30℃振荡培养过夜。
2、第二天取一滴菌液于进行显微镜下观察,目镜用16,物镜用40倍观察细胞壁破碎前的状态,其成杆状,流动性比较下。
3、取10ml的培养酵母菌液,5000g离心3min,弃上清液.加入5ml 的1倍TE悬浮。
4、将悬浮液倒入高压破壁仪的样品管中,利用高压破碎机进行破碎细胞壁,压力加到20Mpa,停留15s,降压,反复来回压3次.取出细胞液,取一滴于显微镜下观察,如果细胞呈不规则的球状时,而且其流动性比较大,说明其细胞壁已经破碎成为原生质体。
5、取2个EP管,每管加入1.5ml上述的细胞液,12000g离心5min,收集原生质体.弃取上清液,每管加入300ul10%的SDS溶液,混匀冰浴5min,进行破原生质体。
6、然后加入150ul的tris饱和酚,和150ul的卤仿异戊醇混合液(卤仿:异戊醇=24:1),混匀,12000g,离心10min。
7、将水相移到另一EP管中,加入等体积的卤仿异戊醇混合液(卤仿:异戊醇=24:1), 混匀,12000g,离心10min。
8、将水相移到另一EP管中,加入1/10体积的3M KAC溶液和2倍体积的无水乙醇,放入-20℃冰箱中。
9、1h,12000g离心10min,倒出乙醇,等干燥后加入1ml的70%的无水乙醇,混匀,12000g,离心10min。
10、弃去乙醇,等室温干燥后,每管加入20ul的TE溶液(如要去处RNA酶,加入1ul的100mg/ml浓度的RNA酶),放入-20℃冰箱即可。
11、跑电泳进行检测是否从酵母菌中提出质粒了。