酿酒酵母质粒的提取

酿酒酵母质粒的提取

酵母细胞的细胞壁比较厚，不容易破壁，不如大肠杆菌的质粒容易提取，最近做了些酿酒酵母的实验，从酿酒酵母中提取质粒，现在就总结下实验的方法和步骤。

一、酵母细胞质粒提取步骤：

1、接种单菌落(待检测酵母细胞)于25mLYNB(补加氨基酸营养物)培养基中，30℃振荡培养过夜。

2、第二天取一滴菌液于进行显微镜下观察,目镜用16,物镜用40倍观察细胞壁破碎前的状态,其成杆状,流动性比较下。

3、取10ml的培养酵母菌液,5000g离心3min,弃上清液.加入5ml 的1倍TE悬浮。

4、将悬浮液倒入高压破壁仪的样品管中,利用高压破碎机进行破碎细胞壁,压力加到20Mpa,停留15s,降压,反复来回压3次.取出细胞液,取一滴于显微镜下观察,如果细胞呈不规则的球状时,而且其流动性比较大,说明其细胞壁已经破碎成为原生质体。

5、取2个EP管,每管加入1.5ml上述的细胞液,12000g离心5min,收集原生质体.弃取上清液,每管加入300ul10%的SDS溶液,混匀冰浴5min,进行破原生质体。

6、然后加入150ul的tris饱和酚,和150ul的卤仿异戊醇混合液(卤仿:异戊醇=24:1),混匀,12000g,离心10min。

7、将水相移到另一EP管中,加入等体积的卤仿异戊醇混合液(卤仿:异戊醇=24:1), 混匀,12000g,离心10min。

8、将水相移到另一EP管中,加入1/10体积的3M KAC溶液和2倍体积的无水乙醇,放入-20℃冰箱中。

9、1h,12000g离心10min,倒出乙醇,等干燥后加入1ml的70%的无水乙醇,混匀,12000g,离心10min。

10、弃去乙醇,等室温干燥后,每管加入20ul的TE溶液(如要去处RNA酶,加入1ul的100mg/ml浓度的RNA酶),放入-20℃冰箱即可。

11、跑电泳进行检测是否从酵母菌中提出质粒了。