水稻原生质体制备及转化方法
水稻原生质体分离及转化
水稻原生质体分离及转化作者：植物逆境与光合实验室|发表日期：2014-04-11实验目的：用于做荧光定位、BIFC、Co-IP实验实验材料和试剂：生长8-10 d的水稻组培幼苗、酶解液、mmg溶液、PEG-CaCl2溶液、W5溶液、5 mL移液枪、5 mL枪头、12 mL BD管、1.5 mL EP管、100 mL锥形瓶、圆形培养皿、滤网（20 mm×20 mm）、离心机、摇床等。
溶液的配制：母液的配制：1、0.2 M MES(pH 5.7)2、0.8 M Mannitol(甘露醇)3、1 M CaCl24、2 M KCl5、2 M MgCl26、10% BSA[Fluka PEG 4000 81240]以下如有上述母液，则都是使用的母液酶解液：20 mL ×2MES 0.5mL 1 mLMannitol 7.5mL 15 mLCellucose（纤维素酶）0.15g 0.3 gMacerozyme（离析酶）0.075g 0.15 gddH2O 1.8mL 3.6 mL55℃10 min冷却至RT后加入200 uL CaCl2加入200 uL 10% BSAMmg: 20 mL ×2 MES 0.2mL 0.4 mLMannitol 5mL 10 mLMgCl2 0.075mL 0.15 mLddH2O 4.725mL 9.45 mLPEG-CaCl2: 20 mL ×2Mannitol 2.5mL 5 mLCaCl2 1mL 2 mLPEG4000 4g 8 gddH2O 3mL 6 mLW5: 200 mLMES 2 mLNaCl 1.8 gCaCl2•2H2O 3.67525 gKCl 0.5 mLddH2O 197.5 mL具体实验步骤：1、从培养基上切取培养8-10 d的水稻幼苗，去除幼苗外层包裹的叶子。
2、用干净的刀片将幼苗切成很细的粉末状碎片（越细越好，有利于酶解），大概切到水稻幼苗茎秆的中间段即可（剩余未切割的部分可以扔掉）。
水稻原生质体分离与转化方法2014-01-20
水稻原生质体分离与转化方法（储成才 课题组 2014-01-20）【概述】原生质体是一种非常好的瞬时表达系统，现在已被广泛应用于植物生理生化和分子机制的研究，包括细胞信号转导过程，离子转运，细胞壁合成，蛋白质分泌以及细胞程序化死亡等生物学过程。
现在已有的基于原生质体的实验技术包括亚细胞定位，基因瞬时表达分析，启动子活性分析，离子吸收实验以及蛋白质相互作用验证（如BiFC和蛋白质免疫共沉淀）等。
本文主要阐述如何利用原生质体进行亚细胞定位，包括原生质体的制备与转化，定位载体的选择，共定位蛋白参照的介绍，荧光蛋白的性质和波长选择等问题。
一、实验的前期准备：1. 水稻材料：将露白的水稻种子(中花11或者日本晴均可)整齐的播种在营养土（最好混有蛭石，营养土与蛭石的比例为1:1）中，放在温室生长14-21天。
或者放在96孔PCR板上，萌发两天后，换成1×木村营养液培养7-10天。
注意如果采用水培苗必须每天更换营养液，否则水培苗纤维化程度较高，叶鞘部分不够肥厚，且不容易被酶液消化。
制备一次原生质体需要50-60棵水稻幼苗，可供转化质粒5-8个。
2. 质粒制备：转化原生质体对质粒的质量要求比较高，需要使用试剂盒大量提取。
通常大量提取一次需要100 mL菌液，使用Qiagen中量提取试剂盒可获得100-150 μg的高纯度无内毒素的质粒。
质粒提取完毕后需要定量，通常将质粒稀释到 2 μg/μL，一次原生质体转化需要5-10μg质粒。
二、试剂和耗材：1. 耗材：耗材准备如下表所示。
50 mL 蓝口瓶 1 否 用于配制酶液250 mL 三角瓶 2 是 用于盛放酶液和过滤原生质体A4打印纸 4-10 否 暂时盛放刀片切下的叶鞘薄片玻璃板 1 否 避免刀片划伤实验台50 mL Nalgen圆底有机玻璃管 2 是 用于离心收集原生质体2 mL离心管 6-10 是 用于原生质体转化双面刀片 8 否 用于切水稻茎和叶鞘0.22 μm滤膜 2-3 否 用于过滤酶液细胞培养板 1 否 用于培养转化的原生质体2. 试剂准备：(1) Enzyme solution0.6 M D-Mannitol (M=182.17) 2.74 g 5.47 g 10.93 g10 mM MES (M=195.24, pH=5.7) 0.0487 g 0.0975 g 0.195 g1.5% Cellulase R-10（w/v, Yakult）0.375 g 0.75 g 1.5 g0.75% Macerozyme（w/v, Yakult）0.1875 g 0.375 g 0.75 gD-Mannitol 和MES 在常温储存，Cellulase R-10和Macerozyme R-10在4度冰箱储存。
水稻遗传转化体系Protocol
水稻遗传转化体系ProtocolIntroduction1．水稻的遗传转化研究历史与现状20 世纪80年代末, 水稻的遗传转化首获成功。
1988 年, 3 个不同的研究小组以水稻原生质体为受体,采用“电击法”或“PEG 介导法”等方法将外源3]。
1991 年, 基因枪转化的方法在水稻中基因导入到水稻中并获得再生植株[1~获得成功[4],随后成为水稻遗传转化的常用方法之一。
1993 年，Chan 等人[5]首先采用农杆菌介导的方法获得了转基因水稻。
Hiei 等人[6]以水稻成熟种子诱导的愈伤为受体, 建立了农杆菌介导的粳稻高效转化体系, 使得农杆菌介导法逐渐成为了水稻转化最常用的方法。
此后, 粳稻的转化方法被进一步优化, 使粳稻的遗传转化周期大幅缩短[7]。
虽然Hiei等[6]建立的农杆菌介导的转化体系使得粳稻的转化不再困难, 但是许多籼稻的转化依然存在障碍, 主要是转化效率低下。
因此, 一些研究者对籼稻的转化体系进行了一些优化, 使得籼稻的转化效率得到了一定的提高[8,9]。
最近, Hiei 和Komari[10]发表了一个粳稻和籼稻均适用的农杆菌高效转化的方法.根据他们的结果, 采用幼胚作为外植体, 籼13 个稻的转化可以在两个半月内完成，且转化效率非常高(一个幼胚可以得到5~独立的转化植株)。
2. 转基因技术在水稻上的研究与应用[11]a. 转基因抗虫水稻对于水稻最主要的害虫——螟虫(二化螟、三化螟、稻纵卷叶螟等)在水稻中尚未发现有效的抗性种质资源. 目前,最有希望和前途的方法就是利用转基因技术把外源抗虫基因引入水稻中创造出新的抗虫品种。
虽然水稻中已经发现和鉴定了19 个抗褐飞虱的基因[12], 但是由于褐飞虱有多个生物型且易产生变异, 抗性品种往往推广数年后就会失去抗性。
b. 转基因抗病水稻见抗水稻病毒研究c. 转基因抗旱水稻d. 转基因营养高效利用水稻e. 转基因优质水稻f. 转基因高产水稻g. 转基因抗除草剂水稻3.转基因技术在水稻抗病毒基因工程上的应用随着RNA干扰技术（包括siRNA和miRNA介导的RNA干扰）在抗病毒18 ]，结合RNA干扰技术和水稻遗传转化技术基因工程上的广泛研究和应用[13~来研究水稻，获得对水稻病毒高抗的品系越来越受研究人员的重视，成为国内外水稻病毒研究的热点。
一种快速高效的水稻原生质体制备和转化方法的建立
植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (3): 351~357351收稿 2013-11-21 修定 2014-01-12资助国家重点基础研究发展计划(2012CB944803)、浙江省青年科学基金(LQ13C020002)和浙江省博士后项目择优资助(Bsh1202082和Bsh1202081)。
*通讯作者(E-mail: yzhu1974@; Tel: 0571-********)。
一种快速高效的水稻原生质体制备和转化方法的建立段炼1,2, 钱君2, 郭小雨2, 朱英2,*1浙江师范大学化学与生命科学学院, 浙江金华321004; 2浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所, 浙江省植物有害生物防控重点实验室, 省部共建国家重点实验室培育基地, 杭州310021摘要: 在模式植物拟南芥中, 原生质体瞬时表达技术已被广泛地应用到功能基因组学的研究中, 但水稻原生质体因其制备过程相对繁琐, 转化效率偏低, 尚未在基因功能研究中获得广泛应用。
本研究在拟南芥原生质体制备和转化的基础之上, 对水稻原生质体的制备和转化方法进行改良优化。
以水稻幼茎为起始材料, 采用纤维素酶R-10和果胶酶R-10, 对水稻组织进行消化并利用蔗糖密度梯度自沉降的方法分离原生质体, 获得了高纯度的原生质体。
对质粒转化原生质体时的转化方法、转化时间及质粒浓度进行探索, 在缩短原生质体分离时间的同时, 大大提高了转化效率。
用较少量的质粒DNA 即可获得外源基因在原生质体内高效的表达, 且转化效率可达70%。
我们建立的这种快速有效的水稻原生质体制备和转化方法, 可为水稻功能基因组学研究提供技术支持。
关键词: 水稻; 原生质体; 自沉降法A Rapid and Efficient Method for Isolation and Transformation of Rice ProtoplastDUAN Lian 1,2, QIAN Jun 2, GUO Xiao-Yu 2, ZHU Ying 2,*1College of Chemistry and Life Science, Zhejiang Normal University, Jinhua, Zhejiang 321004, China; 2State Key Laboratory Breeding Base for Zhejiang Sustainable Pest and Disease Control, Institute of Virology and Biotechnology, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021, ChinaAbstract: Transient gene expression in protoplast is a common approach for studying subcelluar localization, promoter activities and protein complexes in model plant, Arabidopsis. However, protoplast isolation, transformation and as well as downstream analyses in rice are often hampered by a number of factors such as time-consuming, cost-intensive and low transformation efficiency. In this study, we reported a rapid and efficient method for isolation and transformation of rice protoplast, based on the recently published procedure for Arabidopsis protoplast preparation. 10-to-14-days stem tissues but not leaf tissues were digested by proper cellulase R-10 and mecerozyme R-10. Pure protoplasts without cell debris were isolated from the interphase of sucrose gradient after natural sink. This method was also very time-efficient, large amount of protoplasts could be obtained within one day. The transformation efficiency was pretty high (70%) with little amount of DNA. The method we presented here should be valuable for the functional genomics research in rice.Key words: rice (Oryza sativa ); protoplast; the self-settlement method植物原生质体(protoplast)是指通过质壁分离能够分开的那部分细胞物质。
水稻原生质体制备
试剂：1、酶解液0.6M mannitol（182.17）：10mM MES, PH5.71.5% Cellulase RS0.75% Macerozyme备：65度加热10然后加入：0.1%BSA3.4mMCaCl2-2H2O5mM β-巯基乙醇50ug/ml 羧苄青霉素carbenicillin2、W5溶液154mM NaCl,125mM CaCl2,5mM KCl,2mM MES (pH 5.7)3、Mmg solution(0.6M mannitol, 15mM MgCl2, 4mM MES (pH 5.7) 4、incubation solution(0.6 M mannitol, 4mM MES (pH 5.7), 4mM KCl) 5、40% PEG(0.6M mannitol, 100mM CaCl2, 40% v/v PEG4000)母液：1.2M mannitol：50ml（10.93g，定容于50ml）1M MES，ph5.7：切叶片抽真空（15Hg）760毫米汞柱高是一个大气压；酶消化4小时，28度，黑暗，转速50rpm完毕后，镜检；黄花苗的protoplasts 由于中部有个大液泡，所以对焦后才能见。
需要多的protoplasts, 可以加摇几个小时，镜检，满意为止。
过滤：35um （100mu）过滤，这时候要gentle with proplasts。
离心：150g 5分钟，收集proplasts。
然后加入W5，等体积。
W5：150mM NaCl，125mM CaCl2，5mM KCl, 2mM MES(PH5.7) , 然后，1500rpm（本实验室的离心机相当于289g or 289rcf Relative centrifugal force (RCF) RCF 就是实际离心力转化为重力加速度的倍数g为重力加速度(9.80665m/s2)），5分钟。
这后，看到原生体小团在离心管底部。
一种水稻茎单细胞原生质体的提取方法和应用
水稻是一种重要的农作物，而提取其茎单细胞原生质体是一项重要的研究内容。
茎单细胞原生质体是一个包含丰富细胞器的细胞成分，具有多种应用潜力。
本文将就一种水稻茎单细胞原生质体的提取方法和应用进行深入探讨。
1. 概述水稻是世界上重要的粮食作物之一，对于提高水稻的产量和抗性具有重要的意义。
茎单细胞原生质体是细胞内部的重要成分，它包含了细胞膜、细胞器和细胞质等多种重要物质，对于研究水稻的生长、代谢和抗性具有重要的作用。
2. 提取方法提取水稻茎单细胞原生质体是一项复杂的工作，需要一定的技术和设备支持。
一种常用的提取方法是采用酶解法，首先将水稻茎组织研磨成细胞悬浮液，然后加入葡萄糖酶等酶解剂，经过一定的时间和温度处理后，通过差速离心等手段，最终可以得到茎单细胞原生质体。
3. 应用价值水稻茎单细胞原生质体的提取具有重要的应用价值，首先可以通过光学显微镜观察到细胞膜、叶绿体、线粒体等重要细胞器的形态和结构，这对于研究水稻的生长和发育具有重要的作用。
可以通过分离和纯化细胞膜，进行生化分析和功能研究，探索水稻抗病、抗逆性等重要生理机制。
另外，还可以通过提取细胞中的核酸、蛋白质等重要分子，开展分子生物学研究，如基因的克隆、表达和功能分析等。
4. 个人观点水稻茎单细胞原生质体的提取方法和应用是一个重要的研究方向，它对于水稻的生长、代谢和抗性具有重要的意义。
在今后的研究中，我认为可以进一步优化提取方法，提高提取效率和纯度；可以开展更多的应用研究，如利用蛋白组学和基因组学技术，揭示茎单细胞原生质体在水稻抗逆性等方面的重要作用。
总结回顾水稻茎单细胞原生质体的提取是一个重要的研究内容，它对于水稻的生长、代谢和抗性具有重要的作用。
尽管目前的提取方法已经具有一定的成熟度，但在今后的研究中仍然需要不断的优化，以更好地满足研究的需求。
对于茎单细胞原生质体的应用研究也需要不断深化，以揭示其在水稻生理过程中的重要作用。
通过本文的探讨，相信读者对水稻茎单细胞原生质体的提取方法和应用有了更深入的了解。
实验三 原生质体
. 重复上一步。 重复上一步。
. 从此，室温进行，每管沉淀用 从此，室温进行，每管沉淀用450µl MMG 重悬
5. 取25~50µg质粒于1.5ml离心管中，加100µl上一 质粒于1.5ml离心管中 离心管中， 质粒于 上一 步重悬过的细胞， 剪头200µl枪头轻轻吹匀。 枪头轻轻吹匀 步重悬过的细胞，用剪头 枪头轻轻吹匀。
.柱子加入空 管，向膜中加入 柱子加入空EP管 向膜中加入30µl Elution Buffer,室 柱子加入空 室 置2min
观察原生质体•源自下午观察上午制备的原生质体细胞， 下午观察上午制备的原生质体细胞， 用去头的枪头吸取静置后下层的细胞， 静置后下层的细胞 用去头的枪头吸取静置后下层的细胞， 制片， 制片，观察
1. 原生质体的制备
实验材料：继代7~8天的水稻悬浮细胞 天的水稻悬浮细胞, 实验材料：继代7~8天的水稻悬浮细胞, 20ml 实验试剂： 实验试剂：20ml
100ml 0.147g 纤维素酶RS NaOAc 甘露醇 pH 5.7 0.098g 离析酶R－10 11g 20ml 0.24g 0.12g
第二天，周六，3.17，地点实验楼，626 第二天，周六， ，地点实验楼， 1- 5 组观察 上午 9:00 10:00 6-10 组观察 10
实验目的 • 掌握水稻原生质体的制备方法； 掌握水稻原生质体的制备方法； • 掌握基因瞬时转化方法； 掌握基因瞬时转化方法； • 了解 了解GFP的发光原理； 的发光原理； 的发光原理 • 了解质膜蛋白的分选途径。 了解质膜蛋白的分选途径。
尽管450～490nm(蓝光)是 是GFP的副吸收峰,但由于长波 能量低,细胞忍受能力强, ,因此更适合于活体检测.
3、水稻悬浮细胞原生质体转化 水稻悬浮细胞原生质体转化
水稻原生质体制备及转化实验方法
单子植物叶片原生质体分离与转化水稻原生质体分离及转化1.需要准备的器材名称名称名称剃须刀片40um尼龙膜0.45um滤膜玻璃皿血球计数板真空泵及适配器70mm培养皿或100ml锥形瓶离心机（水平转子）滤布圆周摇床2ml圆底管10/50ml注射器50ml圆底离心管六孔板2.材料准备水稻种子，先用75%乙醇漂洗1分钟，再用30%次氯酸钠处理20分钟，无菌水洗涤5次以上。
放在1/2 MS培养基上培养2周左右，26℃，12h光照（150 umol m-2s-1）。
使用大玻璃培养杯培养，每瓶可放15粒种子。
40~60株幼苗可以做一次实验，分离出的原生质体量可以转化大约6个质粒。
3.原生质体分离（1）选取幼苗茎干和叶鞘部分分离原生质体，去除水稻顶部的叶子和茎干小的叶鞘，用锋利的刀片切成大约0.5mm宽的条块，可以20~30个放在一起切开；比例大约15ml酶解液/1g材料；（2）切开后立刻转移到0.6M Mannitol溶液中，避光放置10分钟；（3）过滤掉Mannitol溶液，将其转移到配好的酶解液中，避光，真空泵-15~-20 (inHg)抽真空30分钟；（3）再避光酶解5-6小时，同时缓慢摇动（圆周摇床，速度40）；（5）酶解结束后，加入等体积的W5溶液，稍有力地用手水平摇动10秒钟，释放原生质体；（6）使用40um尼龙膜过滤原生质体到50ml的圆底离心管中，再加W5溶液冲洗条块；（7）250 g水平离心3分钟沉淀原生质体，用5 ml移液器吸出上清；（注：离心机需采用水平转子，且升降速不可超过3，否则细胞可能破碎，以下所有离心步骤均需采用此设置。
）（8）加10ml W5重悬原生质体，250g离心3分钟，弃上清；（9）加适量MMG溶液重悬，原生质体浓度为2*106/ml，血球计数器计数。
（注：1、吸取原生质体所用枪头均需剪去枪头尖以防其对细胞造成伤害；2、以上所有步骤在室温进行。
）4.原生质体转化（1）加入10~20ug质粒到2ml离心管中，加入200ul原生质体（大约4*105细胞），再加入220ul新配的PEG溶液，混匀，室温避光放置10~20分钟诱导转化；（2）诱导转化结束后缓慢加880ul W5溶液，轻轻颠倒混匀，250g水平离心3分钟，弃上清；（3）加1ml WI溶液重悬，转移到六孔板中（已预先加入1ml WI溶液）室温（或28℃）暗处培养6~16小时，若用于提取原生质体基因组DNA，需培养48小时。
水稻转化方法
水稻转化方法配置1升诱导培养基：1.水解酪蛋白300 mg/L2.谷氨酰胺500 mg/L3.脯氨酸500 mg/L4.肌醇100 mg/L5.蔗糖30g/L6.PHytagel 2.6 mg/LN6大量50毫升，B5微量5毫升，B5维生素5毫升，铁盐毫升，2,4-D母液2毫升，pH 5.85.1水稻转化受体的准备5.1.1水稻幼胚愈伤组织的诱导培养取开花后12-15天左右的水稻幼穗脱粒,用清水漂去秕粒,用70%乙醇浸泡1-2分钟，然后用加有几滴Tween20的1.25%的次氯酸钠溶液（活性氯含量为1.25%）浸泡90分钟，进行表面灭菌。
(灭菌时要经常搅拌)用无菌水冲洗3-4次，沥去水备用。
在无菌滤纸上用镊子和刮牙器挤出水稻幼胚置于固体诱导培养基（NB培养基）上，26℃暗培养诱导愈伤组织。
约5-7天后剥下愈伤组织，转入新鲜配制的继代培养基（NB培养基）上，在相同条件下继代培养5天左右，用于共培养。
5.1.2水稻成熟胚愈伤组织的诱导培养去壳的水稻成熟种子先用70%乙醇浸泡1-2分钟，然后用0.1%升汞浸泡30分钟，进行表面灭菌(最好在摇床上进行)，无菌水冲洗3-4次，再将种子放在无菌滤纸上吸干水分后，放在成熟胚愈伤诱导培养基上，26℃暗培养。
约10-15天后，剥下成熟胚盾片长出的愈伤组织,转入成熟胚继代培养基上，在相同条件下继代培养。
以后每两周继代培养一次。
挑选继代培养4-5天、色泽淡黄颗粒状的愈伤组织共培养。
成熟季节的天气；颖壳和种皮表面没有麻点（病斑）；按成熟度分开（青米优于完熟米）注意：粳稻不适宜用NaClO灭菌。
5.2农杆菌的培养将含有目的基因载体的农杆菌EHA105在含有50mg/L Kanamycin的YM平板上划线，28℃黑暗培养2-3天，用一金属匙收集农杆菌菌体,将其悬浮于共培养为0.3-0.5，加入AS，使AS终浓度为CM液体培养基中，调整菌体浓度至OD600100mΜ，即为共培养转化水稻用的农杆菌悬浮液。
水稻原生质体转化
水稻的培养: 水稻去壳后于75%的酒精中浸泡1 min，再用50%的次氯酸钠消毒30 min后，分别播种到1/2MS培养基培养基上，1.2.5 水稻原生质体转化实验水稻原生质体转化实验参照文献（Bart et al., 2006），具体做法如下:（1）水稻黄化苗培养。
将水稻种子（约100粒）去壳后消毒（参见上文），播种到1/2MS培养基上，黑暗条件下，28℃培养12 d。
（2）黄化苗的处理。
去除黄化苗的根和叶，将其茎切成1～2 mm的小段，放入含有15 mL酶解液的培养皿中。
（3）酶解液浸润水稻组织。
将培养皿盖打开，室温条件下,避光抽真空1 h，使酶解液浸润组织。
（4）酶解组织，释放细胞。
盖好培养皿盖，避光，25℃，40 rpm酶解组织4 h。
随后将转速调至80 rpm，释放细胞2 min。
（5）收集细胞。
向培养皿中加入等体积的W5溶液，轻轻混匀，经Miracloth 和millipore过滤组织残渣，并用2倍酶解液体积的W5溶液洗组织残渣3次，1500 rpm离心4 min，小心弃上清；加入10 mL W5溶液重悬细胞，1500 rpm离心4 min，小心弃上清。
（6）重悬细胞，确定细胞浓度。
加入一定体积的MMG溶液重悬细胞，用血球计数板确定细胞浓度，当细胞浓度达到106个/mL时即可用于原生质体转化。
（7）原生质体转化。
在2 mL的离心管中，按照表3加入相应的质粒DNA，200 uL的细胞悬浮液，220 uL的40% PEG，轻轻混匀，于25℃避光条件下孵育20 min。
加入1 mL的W5，轻轻混匀，终止反应，置于25℃培养箱中避光培养12 h。
（8）细胞裂解。
从培养箱中取出细胞悬浮液，2000 rpm离心5 min，弃上清。
加入200 ul的1×CCLR，涡旋振荡30 s后，2000 rpm离心5 min。
水稻原生质体提取及转化
十四、水稻原生质体提取及转化1.将水稻种子去壳后，用70%酒精清洗30 sec，再用30% 次氯酸钠溶液浸泡30 min。
2.将消毒过的水稻种子植于1/2 MS培养基中，避光培养12-14天后，得到的黄化苗可进行原生质体提取。
3.现配20 mL enzyme solution并置于5 公分塑料培养皿中。
4.取黄化苗水稻茎部用锋利刀片细切至0.1-0.5 mm置于enzyme solution中。
5.将含有水稻材料的enzyme solution 抽气15-20 cm-Hg，15-30 min。
6.28℃，40 rpm持续震荡3 hr。
7.28℃，80 rpm继续震荡30 min。
8.用300目尼龙网布过滤含有原生质体的enzyme solution，将过滤的enzymesolution 250g离心3 min。
9.去除上清液，小心用W5 buffer将原生质体重新冲洗悬浮。
10.再次用250g离心1 min。
11.去除上清液，加入W5 buffer将原生质体重新冲洗悬浮。
12.原生质体置于冰上30 min后可进行PEG转化。
13.30 min 稍微离心去除上清液，加入MMg solution 使原生质体总数为2-5×105。
14.取5-10 μg Plasmid DNA 体积为20μL，加入200μL 原生质体，置于冰上10 min。
15.加入等体积PEG4000溶液，小心混匀并置于室温下15 min。
16.加入1 mL W5稀释并终止反应，100g离心2 min。
17.去除含有PEG4000的上清液，加入W5或Incubation Solution重新悬浮并置于用0.1% BSA浸泡过的塑料培养皿中培养。
18.原生质体在28℃，40rpm 暗培养12-16 hr后用激光共聚焦显微镜观察。
试剂配方：Enzyme solutionCellulase RS (Yakult)2%macerozyme R10 (Yakult)1%MES pH5.60.1%mannitol (fresh prepare)0.4 MHeat 55℃,10 min and cool at RTCaCl2.2H2O 0.1%0.45 μm Filter sterilizedW5 SolutionWorking Stock Add154 mM NaCl 3 M 10.3 mL125 mM CaCl2 1 M 25 mL5 mM KCl 0.2 M 5 mL2 mM MES (pH5.7) 0.1 M 4 mL5 mM glucose 0.1 M 10 mLAdd H2O final to 20 mLMMg SolutionWorking Stock Add0.4 M mannitol (fresh) 0.8 M 7.5 mL15 mM MgCl2 1 M 0.15 mLAdd H2O final to 200 mLPEG Solution (40%,V/V)Stock Final concentration PEG 4000 (Fluka,81240) 4 g 40%0.8 M mannitol 1.093 g 0.6 M1 M CaCl2 1 mL 0.1 MAdd H2O Final to 10 mL将PEG solution 与55 ℃水浴溶解，冷却后可进行转化Incubation Solution (10 mL)Working Stock Add0.6 M mannitol 0.8 M 7.5 mL4 mM MES pH5.7 0.1 M 0.4 mL4 mM KCl 0.2 M 0.2 mLAdd H2O 1.9 mL。
水稻原生质体分离及转化
水稻原生质体分离及转化水稻原生质体分离及转化作者：植物逆境与光合实验室|发表日期：2014-04-11实验目的：用于做荧光定位、BIFC、Co-IP实验实验材料和试剂：生长8-10 d的水稻组培幼苗、酶解液、mmg溶液、PEG-CaCl2溶液、W5溶液、5 mL移液枪、5 mL枪头、12 mL BD管、1.5 mL EP管、100 mL锥形瓶、圆形培养皿、滤网（20 mm×20 mm）、离心机、摇床等。
溶液的配制：母液的配制：1、0.2 M MES(pH 5.7)2、0.8 M Mannitol(甘露醇)3、1 M CaCl24、2 M KCl5、2 M MgCl26、10% BSA[Fluka PEG 4000 81240]以下如有上述母液，则都是使用的母液酶解液：20 mL ×2MES 0.5mL 1 mLMannitol 7.5mL 15 mLCellucose（纤维素酶）0.15g 0.3 gMacerozyme（离析酶）0.075g 0.15 gddH2O 1.8mL 3.6 mL55℃10 min冷却至RT后加入200 uL CaCl2加入200 uL 10% BSAMmg: 20 mL ×2 MES 0.2mL 0.4 mLMannitol 5mL 10 mLMgCl2 0.075mL 0.15 mLddH2O 4.725mL 9.45 mLPEG-CaCl2: 20 mL ×2Mannitol 2.5mL 5 mLCaCl2 1mL 2 mLPEG4000 4g 8 gddH2O 3mL 6 mLW5: 200 mLMES 2 mLNaCl 1.8 gCaCl2?2H2O 3.67525 gKCl 0.5 mLddH2O 197.5 mL具体实验步骤：1、从培养基上切取培养8-10 d的水稻幼苗，去除幼苗外层包裹的叶子。
2、用干净的刀片将幼苗切成很细的粉末状碎片（越细越好，有利于酶解），大概切到水稻幼苗茎秆的中间段即可（剩余未切割的部分可以扔掉）。
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原生质体制备及转化
1.去皮的日本晴种子在75%的酒精中消毒1 min。
然后用
2.5%的次氯酸钠消毒20 min。
用无菌水洗至少5次，然后在1/2 MS培养基上，12 h光照（大约150umol m-1 s-1）十二小时黑暗，26 ℃培养7-10天，提前一天烧好去尖的黄蓝枪头备用。
2.取40-60棵水稻幼苗的茎和叶鞘的绿色组织。
3.将一捆水稻植株（大概10棵幼苗）用剃刀一起切成大约0.5 mm的小段。
4.将小片段立刻放进0.6 M的甘露醇中，黑暗中放置10 min。
5.用100目钢制滤网去掉甘露醇，将小片段放在加入15mL酶液的25mL锥形瓶中，
（1.5% Cellulase RS，0.75% Macerozyme R-10，0.6 M甘露醇，pH5.7的10mM MES，10mM CaCl2，0.1% BSA），28℃摇床中轻轻摇晃（50rpm），黑暗孵育4-6 h。
6.此时配置40%的PEG4000，酶消化后，分三次加入等体积15mL的W5溶液（154 mM NaCl，125mM CaCl2,5 mM KCl，pH 5.7的2mM MES）。
用手充分摇晃10s。
7.用400目钢制滤网过滤得到原生质体在圆底管中。
8.80g离心（升降速度设为1档）5min，缓慢吸走上清液。
9.沿壁缓慢加入4mL W5溶液，轻轻悬浮，再离心80g，5min，弃上清
10.沿壁缓慢加入4mL Mmg溶液，离心80g，5min，弃上清
11.再加Mmg溶液，补至每个样品100μl原生质体
12.分装2mL离心管，每100μl原生质体，加入20μl质粒和120μl新鲜制备的
40%的PEG4000，混匀
13.28℃避光静置转化20--25min
14.加1.5 mL W5溶液混匀，80g离心3min，弃上清。
15.重复步骤14
16.加2mL W5溶液重悬，轻轻混匀，移到细胞培养板，锡箔纸包裹避光28℃避
光静置培养15-20小时
17.培养完成后，将培养板中沉淀的原生质体轻轻混匀，吸到2 mL离心管中，80g
离心3min，弃上清，保留100μl上清液
18.共聚焦显微镜观察拍照
配制溶液方法：
酶液
W5溶液
MMG溶液
PEG(5mL)。