水稻原生质体制备及转化方法

原生质体制备及转化

1.去皮的日本晴种子在75%的酒精中消毒1 min。然后用

2.5%的次氯酸钠消毒20 min。用无菌水洗至少5次，然后在1/2 MS培养基上，12 h光照（大约150umol m-1 s-1）十二小时黑暗，26 ℃培养7-10天，提前一天烧好去尖的黄蓝枪头备用。

2.取40-60棵水稻幼苗的茎和叶鞘的绿色组织。

3.将一捆水稻植株（大概10棵幼苗）用剃刀一起切成大约0.5 mm的小段。

4.将小片段立刻放进0.6 M的甘露醇中，黑暗中放置10 min。

5.用100目钢制滤网去掉甘露醇，将小片段放在加入15mL酶液的25mL锥形瓶中，

（1.5% Cellulase RS，0.75% Macerozyme R-10，0.6 M甘露醇，pH5.7的10mM MES，10mM CaCl2，0.1% BSA），28℃摇床中轻轻摇晃（50rpm），黑暗孵育4-6 h。

6.此时配置40%的PEG4000，酶消化后，分三次加入等体积15mL的W5溶液（154 mM NaCl，125mM CaCl2,5 mM KCl，pH 5.7的2mM MES）。用手充分摇晃10s。

7.用400目钢制滤网过滤得到原生质体在圆底管中。

8.80g离心（升降速度设为1档）5min，缓慢吸走上清液。

9.沿壁缓慢加入4mL W5溶液，轻轻悬浮，再离心80g，5min，弃上清

10.沿壁缓慢加入4mL Mmg溶液，离心80g，5min，弃上清

11.再加Mmg溶液，补至每个样品100μl原生质体

12.分装2mL离心管，每100μl原生质体，加入20μl质粒和120μl新鲜制备的

40%的PEG4000，混匀

13.28℃避光静置转化20--25min

14.加1.5 mL W5溶液混匀，80g离心3min，弃上清。

15.重复步骤14

16.加2mL W5溶液重悬，轻轻混匀，移到细胞培养板，锡箔纸包裹避光28℃避

光静置培养15-20小时

17.培养完成后，将培养板中沉淀的原生质体轻轻混匀，吸到2 mL离心管中，80g

离心3min，弃上清，保留100μl上清液

18.共聚焦显微镜观察拍照

配制溶液方法：

酶液

W5溶液

MMG溶液

PEG(5mL)