细胞与原生质体培养
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细胞工程___第四章原生质体与细胞融合用
五.原生质体鉴定
1)低渗爆破法：无壁吸水向外膨胀直至胀破，是无形 的。有部分细胞壁，则原生质体从破碎后留下的残 迹仍保持半圆形的细胞壁。
2)荧光染色法:将原生质体放大离心管中，加入0·7mo l/L甘露醇配置的0.05%~0.1%荧光增白剂溶液，染 色5-10Min ，离心、洗涤除去多余的染料，在荧光 显微镜下观察(波长3600-4400A0)。绿色光显示纤维 素的存在，发出红色光的没有纤维素的真正的原生 质体。
4、细胞质膜稳定剂
细胞质膜稳定剂，能防止质膜破坏，提高原生质 体的稳定性与活性，促进细胞壁形成及细胞分裂等。
常用质膜稳定剂有：
葡萄糖硫酸钾、MES、CaCl•2H2O、KH2PO4等。 MES:2-( N-morpholino) ethanesulfonic acid 2-( N-吗啉代)乙磺酸
作用：不但具有质膜稳定作用，还具有缓冲作用，调 节pH值。
(4)氧电极法:有活力的原生质体在光照下会进行光合 作用而放出氧气，在没有光照的条件下进行呼吸而 耗氧。因此，可以采用氧电极来测定氧的变化来原 生质体是否具有活力。
第二节 细胞融合
一、细胞融合的概念
细胞融合，也称原生质体融合，或体细 胞杂交。是指两种异缘（种间、属间）原生 质体，在诱导剂诱发下或电冲击下，发生膜 融合、胞质融合和核融合并形成杂种细胞， 进一步发育成杂种植物体。
甘露醇
0.6 M
CaCl•2H2O
0.5%
MES
5.0 mM
pH
5.8
6、原生质体的游离与纯化(以叶为例)
1）、原生质体的游离
酶解处理时把灭菌的叶片或子叶等材料下表皮撕掉，将 去表皮的一面朝下放入酶液中。去表皮的方法是：在无 菌条件下将叶面晾干、顺叶脉轻轻撕下表皮。如果去表 皮很困难，也可直接将材料切成小细条，放入酶液中。 对于悬浮细胞等材料，如果细胞团的大小很不均一，在 酶解前最好先用尼龙网筛过滤一次，将原细胞团去掉， 留下较均匀的小细胞团时再进行酶解。
第九章：原生质体培养与体细胞杂交
优点： 融合成本低，勿需特殊设备； 融合子产生的异核率较高； 愈伤组织 融合过程不受物种限制。
不定芽 缺点： 融合过程繁琐 根形成 PEG 可能对细胞有毒害。
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诱导融合方法
（二）电融合法：利用改变电场来诱导原生
质体彼此连接成串，再施以瞬间强脉冲使质膜 发生可逆性电击穿而使原生质体融合的方法。
29
2、培养方法
30
液体浅层培养
将含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄 层，封口后进行培养。 优点：操作简单，对原生质体的损伤小，且易 于添加新鲜培养基转移培养物。 缺点：原生质体分布不均匀，常常发生原生质 体之间的粘连现象而影响其进一步的生长和发 育。此外，难以跟踪观察某一个细胞的发育情 况。
19
1、原生质体的纯化方法
（3）梯度离心法：利用比重不同的溶液，经离心 后使完整无损的原生质体处在两液相的界面之间， 而细胞碎片等杂质则沉于管底。用这种方法可以 获得更为纯净的原生质体。
20
原生质体的纯化步骤
用300-400目不锈钢网过滤酶解材料,弃去残渣
600rpm, 5-10min
吸去上清 原生质体重悬于0.16mol/L CaCl2· 2H2O溶液中
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机理：
1、NaNO3诱导融合
原生质体表面带有负电荷(-10～-30mV)，同性 质电荷彼此凝聚的原生质体质膜无法靠近到足 以融合的程度。 NaNO3中的钠离子能中和原生质体表面的负 电荷，使凝聚的原生质体质膜紧密接触，促进 细胞融合.
融合率 0.1%-4%。
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2、PEG（聚乙二醇）与高pH、 高Ca2+相结合诱导融合
PEG，能与水、蛋白质、糖等具有正极性基团的极 性物质形成氢键，在相邻原生质体表面间作为分子 桥，使原生质体发生粘连
原生质体培养名词解释
原生质体培养名词解释原生质体培养是一种常用的植物组织培养技术，用于繁殖植物和研究植物基因转化等问题。
本文将介绍原生质体培养的定义、原理和应用等方面的名词解释。
下面是本店铺为大家精心编写的4篇《原生质体培养名词解释》，供大家借鉴与参考，希望对大家有所帮助。
《原生质体培养名词解释》篇11. 原生质体（Protoplast）原生质体是指从植物细胞中除去细胞壁后剩余的细胞质部分，包括细胞膜、质体、线粒体、质体小体、微管和微丝等细胞器。
原生质体是一个高度液态的细胞质体系，其形态和功能类似于一个微小的细胞。
原生质体可以通过融合实现远缘杂交，从而扩大植物遗传资源的利用范围。
2. 原生质体培养（Protoplast Culture）原生质体培养是指将离体的植物原生质体在适当的培养基上进行培养，以获得再生的植物组织或细胞。
原生质体培养的主要目的是通过原生质体的融合，克服远缘杂交障碍，实现植物遗传资源的利用和改良。
3. 原生质体融合（Protoplast Fusion）原生质体融合是指两个或多个原生质体合并成一个细胞的过程。
原生质体融合可以通过电激、化学处理或生物方法等手段诱导。
融合后的细胞称为杂种细胞，可以用于植物遗传资源的利用和改良。
4. 再生（Regeneration）再生是指通过培养技术，使离体的植物组织或细胞重新分化、再生为新的植株或组织。
再生是原生质体培养的重要应用之一，也是植物组织培养技术的基础。
5. 遗传转化（Genetic Transformation）遗传转化是指将外源基因或基因组导入植物细胞内，并使其表达的过程。
遗传转化是植物基因工程的重要组成部分，也是原生质体培养的应用之一。
通过原生质体培养技术，可以将目的基因导入植物细胞内，并实现植物的遗传转化。
6. 植物组织培养（Plant Tissue Culture）植物组织培养是指将离体的植物组织或细胞在适当的培养基上进行培养，以获得再生的植物组织或细胞。
植物原生质体的培养与体细胞杂交
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4.原生质体培养与细胞融合(植物组织培养)
原生质体培养与细胞融合第一节原生质体培养一、原生质体的培养概况1、概念：植物的原生质体：指除去细胞壁以后的裸露细胞。
原生质体培养：是将植物细胞游离成原生质体，在适宜的培养条件下，使其再生细胞壁，进而细胞进行持续分裂形成细胞团，进一步生长形成愈伤组织或胚状体，最后分化或发育形成完整植株的过程。
原生质体培养特点是：①比较容易摄取外来的遗传物质，如DNA；②便于进行细胞融合，形成杂交细胞；③与完整细胞一样具有全能性，仍可产生细胞壁，经诱导分化成完整植株。
原生质培养首先在烟草上获得成功。
2、原生质体培养的意义①比较容易摄取外来的遗传物质（壁中有活性很强的核酸酶）—研究植物原生质体培养和再生植株技术，有可能采用细胞遗传工程的方法培育出新品种。
②便于进行细胞融合，形成杂交细胞—可广泛地重组植物界优良遗传性状，创造新物种和新品种（如能固N的禾本科植物，高光效植物，高抗植物）③原生质体可作为遗传理论研究的材料—细胞生物学、植物生理学、遗传学、分子生物学等，如细胞起源、壁生物合成、胞间相互作用、不亲和性、激素作用机理等3、原生质体培养程序取材→预处理→分离→纯化→活力检测→培养→细胞壁再生→细胞分裂分化→愈伤组织→愈伤分化→再生植株取材：大田叶片（消毒灭菌）、无菌试管苗叶片、愈伤组织或悬浮细胞预处理：黑暗、低温、叶片萎蔫处理、预培养、和不同光质照射等，可提高原生质体产量和代谢活力。
二、原生质体的分离和纯化1 原生质体的分离叶肉组织是制备原生质理想的材料，遗传性状一致。
细胞壁主要成分是纤维素、半纤维素、果胶质等。
分离原生质的方法主要有以下两种：机械法和酶解法（1）机械法①首先将细胞放在高渗的糖溶液中（水势低），使细胞发生质壁分离（细胞失水），原生质体收缩成球状；②破碎组织，从伤口处可释放出完整的原生质体。
最早在19世纪末，利用机械法分离藻类原生质。
（缺点）获得的原生质体少、产生的原生质体的细胞类型受到限制。
一般取材局限于具有液泡化程度较大的细胞或长形细胞的组织。
植物细胞培养及原生质体培养
•植物细胞培养及原生质体培养
3.单细胞培养：对单离的细胞进行培养的方 法。
（1）平板培养法：分散的植物细胞接种于含薄层固 体培养基的培养皿内的培养过程称为平板培养法。。
方法是将经机械破碎过筛或酶(纤维素酶及果胶酶 等)消化分散的细胞，洗涤离心除酶，细胞浓缩物经 计数及稀释，接种到加热熔化而刚冷却至35℃左有 的固体培养基中充分混匀，倾入培养皿中，石蜡密 封，于25℃含5％CO2空气的培养箱中培养，细胞即 可生长成团。
(3) 悬浮培养特点：
培养过程中细胞总数不断增加，一定时间后产量达 最高点，生长趋于停止。然后进行移植继代培养，其过 程表现出严格可重复周期性变化，细胞增长规律与微生 物相同，有延迟期、对数生长期、减慢期及静止期等阶 段。植物细胞接种时要达到一定细胞浓度，通常为0. 25 x l0‘细胞／ml 一0. 5 x 10‘细胞／m1。
•植物细胞培养及原生质体培养
（四）细胞培养过程： 1. 择适宜的外植体； 2. 诱导疏松愈伤组织； 3. 选择适宜的培养基； 4. 悬浮培养； 5. 悬浮细胞的继代与选择； 6. 悬浮细胞的同步化； 7. 悬浮愈伤组织形成及植株再生。
•植物细胞培养及原生质体培养
水稻细胞悬浮培养及植株再生：
1.愈伤组织的诱导： (1)取水稻种子，人工去皮后用70％酒精表面消毒2 分钟，再用2．5％次氯酸钠水溶液浸泡并轻轻搅动 30分钟。 (2)将种子用无菌蒸馏水冲洗3次，按每瓶3粒接入 附加2mg／L 2，4—D、3％蔗糖、0．3％酵母提取 物的Ms固体培养基中，25℃黑暗下培养、诱导愈伤 组织。 (3) 3周后，将从胚部长出的愈伤组织切割，并转移 到新鲜培养基上继代培养，每2周继代1次。 (4)挑选疏松、易碎的愈伤组织进行继代、增殖．
•植物细胞培养及原生质体培养
3.单细胞培养：对单离的细胞进行培养的方 法。
（1）平板培养法：分散的植物细胞接种于含薄层固 体培养基的培养皿内的培养过程称为平板培养法。。
方法是将经机械破碎过筛或酶(纤维素酶及果胶酶 等)消化分散的细胞，洗涤离心除酶，细胞浓缩物经 计数及稀释，接种到加热熔化而刚冷却至35℃左有 的固体培养基中充分混匀，倾入培养皿中，石蜡密 封，于25℃含5％CO2空气的培养箱中培养，细胞即 可生长成团。
(3) 悬浮培养特点：
培养过程中细胞总数不断增加，一定时间后产量达 最高点，生长趋于停止。然后进行移植继代培养，其过 程表现出严格可重复周期性变化，细胞增长规律与微生 物相同，有延迟期、对数生长期、减慢期及静止期等阶 段。植物细胞接种时要达到一定细胞浓度，通常为0. 25 x l0‘细胞／ml 一0. 5 x 10‘细胞／m1。
•植物细胞培养及原生质体培养
（四）细胞培养过程： 1. 择适宜的外植体； 2. 诱导疏松愈伤组织； 3. 选择适宜的培养基； 4. 悬浮培养； 5. 悬浮细胞的继代与选择； 6. 悬浮细胞的同步化； 7. 悬浮愈伤组织形成及植株再生。
•植物细胞培养及原生质体培养
水稻细胞悬浮培养及植株再生：
1.愈伤组织的诱导： (1)取水稻种子，人工去皮后用70％酒精表面消毒2 分钟，再用2．5％次氯酸钠水溶液浸泡并轻轻搅动 30分钟。 (2)将种子用无菌蒸馏水冲洗3次，按每瓶3粒接入 附加2mg／L 2，4—D、3％蔗糖、0．3％酵母提取 物的Ms固体培养基中，25℃黑暗下培养、诱导愈伤 组织。 (3) 3周后，将从胚部长出的愈伤组织切割，并转移 到新鲜培养基上继代培养，每2周继代1次。 (4)挑选疏松、易碎的愈伤组织进行继代、增殖．
•植物细胞培养及原生质体培养
原生质体培养与体细胞杂交
看护培养
在适宜的培养条件下，原生质体数小时后开始形成新的细胞壁。这时，在显微镜下可见原生质体由圆球形逐渐变为方形、多边形等。约24-36h后，原生质体开始发生第一次分裂；以后随着细胞分裂，原生质体就形成细胞团。
01
但是，在细胞分裂开始以后，培养基中的甘露醇或山梨醇的浓度要逐渐降低，否则会影响细胞的继续生长、分裂。待原生质体形成的细胞团（愈伤组织）达到1mm时，应将细胞团转移到新鲜的培养基上继续培养。所形成的愈伤组织就可以按照普通的愈伤组织进行培养和植株再生。
第九章 原生质体培养与体细胞杂交
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原生质体的获得 原生质体的培养 体细胞杂交
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原生质体的获得
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原生质体的概念 原生质体的用途 原生质体的分离
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原生质体的概念
指植物细胞除去细胞壁以外的部分
植物原生质体是没有细胞壁的裸露细胞，它在一些研究方面具有独特的优势。
原生质体的分离 ——酶解法 注意事项 酶解液配制好后，要用过滤灭菌的方法进行灭菌，并且随配随用.
原生质体的分离 ——酶解法 酶解就是将无菌材料放入酶解液中、释放出原生质体的过程。 有菌材料，则必须进行表面消毒处理。叶片、幼茎和根等材料要切成小片，叶片最好撕去下表皮。 悬浮细胞则要离心后再酶解。
01
03
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原生质体的培养方法
原生质体的培养方法
液体—固体结合培养 液体浅层—固体平板培养双层培养法：培养皿底部铺一层琼脂或琼脂糖培养基，再将原生质体悬浮液倒入或滴入固体培养基表面。优点是固体培养基中的营养可以缓慢释放倒液体培养基中。如果在固体培养基中加入活性炭，还可以吸附培养物分泌的有毒物质，促进原生质体的生长和分裂。
植物原生质体培养及细胞融合
2．染色观察
• 取一滴0.02％的FDA液与一滴原生质体悬 浮液在载玻片上混匀，25E室温染色5～ 10min。用荧光显微镜观察，激发光波长 330～500nm，活的原生质体产生黄绿色 荧光。用计数器计算存活百分率。
(二)酚藏花红染色法
• 酚藏花红(phenosafranine)是一种碱性 染料，溶于水显红色并带黄色荧光，其 最大激发和射波长分别为527nm和588nm 。酚藏花红能被活的原生质体吸收而呈 红色，无活性的原生质体因无吸收能力 而五色。
(三)不连续梯度离心法
• 在离心管中首先放人不同浓度的Ficoll 溶液，构成不同的浓度梯度，在上部滴 人1～2ml酶一原生质体混合液，在150g 下离心5min，不同比重的原生质体漂浮 在不同的浓度梯度的界面上，用吸管收 集原生质体，悬浮洗涤备用。该方法的 优点是获得的原生质体大小均匀致，纯 度高；缺点是操作繁杂，原生质体的收 率低。
(五)分离方法 • 1．机械分离法 • 但由于该方法获得的原生质体产量低， 不能满足实验需要，而且液泡化程度低 的细胞不能采用该方法，因此，机械分 离法没有得到广泛应用。 • 2．酶分离法
• 1960年，德国诺丁汉大学的Cocking首先利用 纤维素酶从番茄幼苗根尖中分离获得原生质体 ，而且收率高、完整性好、活力强。经过数十 年的不断完善，目前酶分离法已成为植物原生 质体分离最有效的方法。 • 酶分离法又分为两步法和一步法。两步法是先 用果胶酶处理材料，游离出单细胞，然后再用 纤维素酶处理单细胞，分离出原生质体。其优 点是所获得的原生质体均匀一致、质量好。但 由于操作繁杂，目前已逐渐被淘汰。 • 一步法是将纤维素酶和果胶酶等配制成混合酶 溅处理材料，一步获得原生质体。因操作简便 ，目前几乎均采用该方法。
植物原生质体培养及细胞融合过程
2. 原生质体是各种遗传操作的理想受体， 从而可以进行品种的遗传改良。 可摄入外源DNA，细胞器、细菌或病毒颗粒， 为高等植物的遗传饰变打下基础。
3. 获得细胞无性系和选育突变体的优良起始材料。
植物原生质体培养及细胞融合过程
第一节 原生质体的分离与纯化
一、原生质体的分离
（一）材料来源
植物的茎、叶、胚、子叶、下胚轴等器官组织 以及愈伤组织和悬浮培养细胞均可作为原生质体分离的材料。
果胶酶/纤维素酶 纯度高， 但浓度不来自太高； 木本植物加入半纤维素酶。
植物原生质体培养及细胞融合过程
◆渗透稳定剂
如果溶液中的渗透压和细胞内的渗透压不同，原生质体有可能涨破或收缩， 因此在酶液、洗液和培养液中渗透压 应大致和原生质体内的相同，或者比细胞内渗透压略大些。
较高水平的渗透剂可以阻止原生质体的破裂和出芽， 但同时也可能抑制原生质体的分裂。
①糖溶液系统
包括甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等，浓度约在0.40-0.80mol／L。 可促进分离的原生质体再生细胞壁并继续分裂；
②盐溶液系统
包括 KCl、MgSO4和 KH2PO4等。
此外，酶溶液里还可加入适量的葡聚糖硫酸钾，
提高原生质体的稳定性植物；原使生质R体培N养A及酶细胞不融合活过程化；并使离子稳定。
细胞壁的组成
纤维素 半纤维素 果胶质
25-50％ 53％
5％
纤维素酶 半纤维素酶 果胶酶
少量蛋白质
植物原生质体培养及细胞融合过程
酶的种类及特点
◆ 纤维素酶
主要含有 纤维素酶C，作用于天然的和结晶的纤维素，具有分解天然纤维素的作用， 还含纤维素酶CX，作用于定形的纤维素，可分解短链纤维素， 另含有纤维素二糖酶、木聚糖酶、萄聚糖酶、果胶酶、脂肪酶、磷脂酶、 核酸酶、溶菌酶等，
3. 获得细胞无性系和选育突变体的优良起始材料。
植物原生质体培养及细胞融合过程
第一节 原生质体的分离与纯化
一、原生质体的分离
（一）材料来源
植物的茎、叶、胚、子叶、下胚轴等器官组织 以及愈伤组织和悬浮培养细胞均可作为原生质体分离的材料。
果胶酶/纤维素酶 纯度高， 但浓度不来自太高； 木本植物加入半纤维素酶。
植物原生质体培养及细胞融合过程
◆渗透稳定剂
如果溶液中的渗透压和细胞内的渗透压不同，原生质体有可能涨破或收缩， 因此在酶液、洗液和培养液中渗透压 应大致和原生质体内的相同，或者比细胞内渗透压略大些。
较高水平的渗透剂可以阻止原生质体的破裂和出芽， 但同时也可能抑制原生质体的分裂。
①糖溶液系统
包括甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等，浓度约在0.40-0.80mol／L。 可促进分离的原生质体再生细胞壁并继续分裂；
②盐溶液系统
包括 KCl、MgSO4和 KH2PO4等。
此外，酶溶液里还可加入适量的葡聚糖硫酸钾，
提高原生质体的稳定性植物；原使生质R体培N养A及酶细胞不融合活过程化；并使离子稳定。
细胞壁的组成
纤维素 半纤维素 果胶质
25-50％ 53％
5％
纤维素酶 半纤维素酶 果胶酶
少量蛋白质
植物原生质体培养及细胞融合过程
酶的种类及特点
◆ 纤维素酶
主要含有 纤维素酶C，作用于天然的和结晶的纤维素，具有分解天然纤维素的作用， 还含纤维素酶CX，作用于定形的纤维素，可分解短链纤维素， 另含有纤维素二糖酶、木聚糖酶、萄聚糖酶、果胶酶、脂肪酶、磷脂酶、 核酸酶、溶菌酶等，
植物组织培养第七章植物原生质体培养及细胞融合
陈传红 制作 2007 / 5
202X
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单击添加副标题
第 七 章 植物原生质体培养及细胞融合
陈传红 制作 2007 / 5
202X
本章内容提要： 原生质体培养的发展与意义 原生质体的分离 原生质体的培养 植物细胞的融合 体细胞杂种鉴定方法
1975年柑桔原生质体培养成功；
2
现有：苹果、猕猴桃、柿、枇杷、马铃薯、番茄、矮牵牛等作物的原生质体培养成功；木本植物中柑桔最为成功。
3
陈传红 制作 2007 / 5
番茄+马铃薯？
陈传红 制作 2007 / 5
3、融合方法
01
02
1、机械分离（Machanical isolation）
Cut plasmolyzed tissue and subsequent deplasmolysis results in expansion and release of the protoplasts from the cut ends of the cell.
高度液泡化的细胞
陈传红 制作 2007 / 5
2、 酶解分离（Enzymatic isolation）
双子叶外植体/培养细胞
单子叶植物胚性细胞
2.1 材料 应选择生长旺盛的植物体幼嫩部分。叶肉细胞分离原生质体，来源方便，有明显的叶绿体，便于在融合中认识。 但禾本科叶肉原生质体往往不能分裂,因此常采用悬浮细胞作为分离原生质体的材料，最适宜的细胞是处于对数生长早期的细胞。
单击添加副标题
清新立春时节
什么是原生质体（Protoplast）？
1880, Hanstein：质壁分离时，能够与细胞壁分开的那部分细胞物质 含义：去掉细胞壁的由质膜包裹、具有生活力的裸露细胞。
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第 七 章 植物原生质体培养及细胞融合
陈传红 制作 2007 / 5
202X
本章内容提要： 原生质体培养的发展与意义 原生质体的分离 原生质体的培养 植物细胞的融合 体细胞杂种鉴定方法
1975年柑桔原生质体培养成功；
2
现有：苹果、猕猴桃、柿、枇杷、马铃薯、番茄、矮牵牛等作物的原生质体培养成功；木本植物中柑桔最为成功。
3
陈传红 制作 2007 / 5
番茄+马铃薯？
陈传红 制作 2007 / 5
3、融合方法
01
02
1、机械分离（Machanical isolation）
Cut plasmolyzed tissue and subsequent deplasmolysis results in expansion and release of the protoplasts from the cut ends of the cell.
高度液泡化的细胞
陈传红 制作 2007 / 5
2、 酶解分离（Enzymatic isolation）
双子叶外植体/培养细胞
单子叶植物胚性细胞
2.1 材料 应选择生长旺盛的植物体幼嫩部分。叶肉细胞分离原生质体，来源方便，有明显的叶绿体，便于在融合中认识。 但禾本科叶肉原生质体往往不能分裂,因此常采用悬浮细胞作为分离原生质体的材料，最适宜的细胞是处于对数生长早期的细胞。
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清新立春时节
什么是原生质体（Protoplast）？
1880, Hanstein：质壁分离时，能够与细胞壁分开的那部分细胞物质 含义：去掉细胞壁的由质膜包裹、具有生活力的裸露细胞。
细胞工程原生质体的概念及培养的流程
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纯化的原生质体需经活力测定后方可用于培养。
根据形态待征判断其活力：原生质体呈绿色（若来源于叶
片）及圆而鼓者为活原生质体。
荧光染料活体染色法：荧光素染料可自由透过细胞膜，在
细胞内被酯酶水解为荧光素，后者不能自由透过细胞膜而 滞留于细胞内，在荧光显微镜下根据荧光强度即可判断原 生质体死活。 不能吸收而无色。
植物基因组工程实验室
7
机械法
外植体捣碎过滤离心
优点：
未经酶处理，细胞受到伤害小； 无需质壁分离，利于生理生化研究.
缺点：
细胞结构会受到一定伤害；完整细胞少
2015/11/2
植物基因组工程实验室
8
酶解法
利用果胶酶、纤维素酶等处理外植体材料， 分离具代谢活性的细胞。
降解中胶层，软化细胞壁
质体发生聚集作用，经稀释后，50％以上原生质体发生融 合作用；
高Ca2+、高pH值及PEG结合诱导法； 其他如葡聚糖硫酸酯、聚乙烯醇及电场诱导等融合 方法。
2015/11/2 植物基因组工程实验室 43
3、融合过程
高密度混合2X105个/ml
2015/11/2
植物基因组工程实验室
44
potato
用途：优良单细胞株选择、突变体筛选、单细胞 克隆获得等。
2015/11/2
植物基因组工程实验室
14
2、看护培养
看护培养(nurse culture)：在活跃生长的愈伤组织
上进行单细胞培养的方法。 1953年，Muir，愈伤组织能促使单细胞持续分裂 和增殖。机理尚未明了。 方法流程：
植物基因组工程实验室
36
烟草原生质体培养
2015/11/2
植物基因组工程实验室
37
A-D当归(Angelica sinensis(Oliv) Diels)原生质体培养成再生苗 E-H,红豆草(Onobrychis vicaefolia Scop) )原生质体培养再生植株
A-E, 培养的欧当归(Levisticum officinale Koch))原生质体分裂再生成植株的过程 2015/11/2 植物基因组工程实验室 F-L, 培养过程的核变化；F.多核，G.核穿壁，H.无丝分裂， I.染色体桥，J. 2n=22，K.L.多倍体.
2015/11/2
植物ession of GFP fusions in tobacco protoplasts
2015/11/2 植物基因组工程实验室 46
七、植物细胞培养的应用
研究细胞生物学、分子生物学、体细胞无性系变异的有用工具； 植物次生代谢产物的生产 突变体的选择
一次操作可实现两个以上亲本的融合作用； 可获得呈现双亲个体基因型总和的杂种； 可形成有性生殖障碍植物的种间杂种。
2015/11/2 植物基因组工程实验室 42
2. 促融因素
NaNO3诱导：NaNO3 可中和原生质体表面负电荷，促 进原生质体聚集，对原生质体无损害，但融合率低； 高Ca2＋和高pH值诱导； PEG（聚乙二醇）诱导：在高浓度PEG溶液中，原生
在适当条件下来源不同的植物原生质体可产生融合作用， 并可再生细胞壁，形成完整植株。
2015/11/2 植物基因组工程实验室 40
2015/11/2
植物基因组工程实验室
41
1、用途
可实现远缘杂交，获得种间杂种，克服有性杂交配
子不亲合性；
可获得含另一亲本非整倍体杂种或胞质杂种，且获
得的遗传变异范围极广；
果胶酶
崩溃酶（Driselase)：为一种粗酶制剂，具有纤维素酶及果胶酶活性； 半纤维素酶
Rhozyme HP150，用于悬浮细胞、豆科根瘤、幼苗子叶及根细胞原生 质体的分离;
蜗牛酶：主要用于体细胞原生质体分离。
2015/11/2 植物基因组工程实验室 30
3．原生质体分离
分离： 原生质体分离有机械法及酶消化法。 前者产量极低而不多用、后者又分一步法及二步法。
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植物基因组工程实验室
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4、条件培养
条件培养：单细胞接种于条件培养基中进行培养。
条件培养基：含有植物细胞培养上清液或静止细
胞的培养基。
看护培养+平板培养
2015/11/2
植物基因组工程实验室
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四、细胞悬浮培养
细胞的悬浮培养(cell suspension culture)：是指
漂浮法: 离心法纯化的原生质体若含较多碎片及少量老细
胞时．可用20％蔗糖离心，原生质体浮于液面．碎片及老 细胞沉降而得以纯化，纯度高，但产量低； 不连续梯度离心法：将原生质粗提液置于不连续浓度梯度 的溶液中，经离心后分离不同比重的原生质体。
2015/11/2 植物基因组工程实验室 32
5．原生质体活力测定
平板培养 看护培养 微室培养 条件培养
2015/11/2
植物基因组工程实验室
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1、平板培养
平板培养法(plating culture)：将一定密度单细胞接
种到固体培养基中进行培养的技术。 1960年，Bergman，筛选效率高、筛选量大，操作 简单，便于活体观察 方法流程：
生长迅速，悬浮细胞的量一般2—3天甚至 更短时间便可增加一倍。
2015/11/2
植物基因组工程实验室
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五、原生质体培养
自1970年首次获得烟草原生质体再生植株成功以 来，通过原生质体获得再生植株的植物约有280余 种，其中有20种为我国首先报道。 原生质体培养包括原生质体的分离、培养、植株再 生等过程。
必须对细胞给予渗透压保护
优点：获得完整细胞多，可获得纯材料。 缺点：酶量要求严格，对细胞损伤大。
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烟草悬浮细胞系建立
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植物基因组工程实验室
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三、单细胞培养
对分离得到的单个细胞进行培养，诱导其分裂增 殖，形成细胞团，再通过细胞分化形成芽、根等 器官或胚状体，直到长成完整植株的技术。 培养方法：
将游离的植物细胞按一定的细胞密度，悬浮在液 体培养基中进行培养的方法。 便于细胞交换，细胞状态易保持一致。 适宜于大规模培养，细胞工程产业的技术基础。
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1、悬浮培养过程
选择择适宜的外植体； 诱导疏松愈伤组织； 选择适宜的培养基；
悬浮培养；
第四章
植物细胞与原生质体培养
一、基本概念
1、植物细胞培养（plant cell culture）：
指在离体条件下对单细胞或小细胞团进行培 养，形成单细胞无性系或再生植株的技术。
2015/11/2
植物基因组工程实验室
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2、原生质体培养：
通过一定方法除去细胞壁，而得到一个裸露的植物 细胞，即为原生质体(Protoplast)。 游离的原生质体像正常的 植物细胞那样具有全能性，
愈伤组织培养放置滤片纯化的单细胞接种于滤纸上
培养转接细胞团
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植物基因组工程实验室
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植物基因组工程实验室
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3、微室培养
微室培养(micro-chamber culture)：悬浮单细胞接
种于凹玻片或玻璃环与盖玻片组成的微室内的固
体培养基中的培养方法。
一步法是将材料在21-28℃用纤维素酶及果胶酶混合液一
次性处理2-24h。 二步法是将材料先用果胶酶降解胞间胶层得到单细胞，再 用纤维素酶脱壁而释放原生质体。
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4、原生质体的纯化
沉降法: 原生质体混合物经微孔过滤后，低速（150g）离 心5min, 沉淀再用与酶液具相同糖浓度溶液反复洗3-4次， 后用培养液洗涤备用；
29
常用的酶类
纤维素酶
Onozuka R-10及RS，国内常用的为EA3-867，其中含少量果胶酶。
Macerozyme R-10 又叫离析酶，主要含果胶酶，活力较高，其含杂酶 较多，用量不超过2％，作用时间长有毒害作用； Pectalyase Y—23，也叫离析软化酶，活力极高，叶片用量一般为0．1 ％，悬浮细胞为0．05％；
原生质体培养通常与细胞融合、转基因配合进行。
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流程
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1、原生质体制备
材料来源：
可以用各种组织和器官，但多应用叶片、愈伤
组织及悬浮培养细胞。以及茎尖、根尖、子叶
和胚性组织。
预处理
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植物基因组工程实验室
期、对数生长期、减慢期及静止 期等阶段。接种时细胞要达到一 定细胞浓度，通常为0. 25 x l06
细胞／ml -0. 5 x 106细胞／
m1。
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连续培养(Continuous culture)：是用一定容积的 非密闭系统进行细胞培养的方法，在培养过程中 不断注入新鲜培养基，而使营养物连续得到补充， 细胞生长和增殖连续进行，同时有等体积的培养
28
2. 制备原生质体的酶类
作用：消化细胞壁 高等植物细胞壁主要成分为a-纤维素，其次为半纤维素、
果胶质及蛋白质。
细胞生长的不同阶段及不同物种的细胞壁组成与结构不同， 木质化及次生加厚的细胞壁不被酶消化，故选择材料和消 化细胞壁的酶类是制备原生质体关键。
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根据形态待征判断其活力：原生质体呈绿色（若来源于叶
片）及圆而鼓者为活原生质体。
荧光染料活体染色法：荧光素染料可自由透过细胞膜，在
细胞内被酯酶水解为荧光素，后者不能自由透过细胞膜而 滞留于细胞内，在荧光显微镜下根据荧光强度即可判断原 生质体死活。 不能吸收而无色。
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7
机械法
外植体捣碎过滤离心
优点：
未经酶处理，细胞受到伤害小； 无需质壁分离，利于生理生化研究.
缺点：
细胞结构会受到一定伤害；完整细胞少
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酶解法
利用果胶酶、纤维素酶等处理外植体材料， 分离具代谢活性的细胞。
降解中胶层，软化细胞壁
质体发生聚集作用，经稀释后，50％以上原生质体发生融 合作用；
高Ca2+、高pH值及PEG结合诱导法； 其他如葡聚糖硫酸酯、聚乙烯醇及电场诱导等融合 方法。
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3、融合过程
高密度混合2X105个/ml
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用途：优良单细胞株选择、突变体筛选、单细胞 克隆获得等。
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2、看护培养
看护培养(nurse culture)：在活跃生长的愈伤组织
上进行单细胞培养的方法。 1953年，Muir，愈伤组织能促使单细胞持续分裂 和增殖。机理尚未明了。 方法流程：
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烟草原生质体培养
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A-D当归(Angelica sinensis(Oliv) Diels)原生质体培养成再生苗 E-H,红豆草(Onobrychis vicaefolia Scop) )原生质体培养再生植株
A-E, 培养的欧当归(Levisticum officinale Koch))原生质体分裂再生成植株的过程 2015/11/2 植物基因组工程实验室 F-L, 培养过程的核变化；F.多核，G.核穿壁，H.无丝分裂， I.染色体桥，J. 2n=22，K.L.多倍体.
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七、植物细胞培养的应用
研究细胞生物学、分子生物学、体细胞无性系变异的有用工具； 植物次生代谢产物的生产 突变体的选择
一次操作可实现两个以上亲本的融合作用； 可获得呈现双亲个体基因型总和的杂种； 可形成有性生殖障碍植物的种间杂种。
2015/11/2 植物基因组工程实验室 42
2. 促融因素
NaNO3诱导：NaNO3 可中和原生质体表面负电荷，促 进原生质体聚集，对原生质体无损害，但融合率低； 高Ca2＋和高pH值诱导； PEG（聚乙二醇）诱导：在高浓度PEG溶液中，原生
在适当条件下来源不同的植物原生质体可产生融合作用， 并可再生细胞壁，形成完整植株。
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1、用途
可实现远缘杂交，获得种间杂种，克服有性杂交配
子不亲合性；
可获得含另一亲本非整倍体杂种或胞质杂种，且获
得的遗传变异范围极广；
果胶酶
崩溃酶（Driselase)：为一种粗酶制剂，具有纤维素酶及果胶酶活性； 半纤维素酶
Rhozyme HP150，用于悬浮细胞、豆科根瘤、幼苗子叶及根细胞原生 质体的分离;
蜗牛酶：主要用于体细胞原生质体分离。
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3．原生质体分离
分离： 原生质体分离有机械法及酶消化法。 前者产量极低而不多用、后者又分一步法及二步法。
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4、条件培养
条件培养：单细胞接种于条件培养基中进行培养。
条件培养基：含有植物细胞培养上清液或静止细
胞的培养基。
看护培养+平板培养
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四、细胞悬浮培养
细胞的悬浮培养(cell suspension culture)：是指
漂浮法: 离心法纯化的原生质体若含较多碎片及少量老细
胞时．可用20％蔗糖离心，原生质体浮于液面．碎片及老 细胞沉降而得以纯化，纯度高，但产量低； 不连续梯度离心法：将原生质粗提液置于不连续浓度梯度 的溶液中，经离心后分离不同比重的原生质体。
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5．原生质体活力测定
平板培养 看护培养 微室培养 条件培养
2015/11/2
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1、平板培养
平板培养法(plating culture)：将一定密度单细胞接
种到固体培养基中进行培养的技术。 1960年，Bergman，筛选效率高、筛选量大，操作 简单，便于活体观察 方法流程：
生长迅速，悬浮细胞的量一般2—3天甚至 更短时间便可增加一倍。
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五、原生质体培养
自1970年首次获得烟草原生质体再生植株成功以 来，通过原生质体获得再生植株的植物约有280余 种，其中有20种为我国首先报道。 原生质体培养包括原生质体的分离、培养、植株再 生等过程。
必须对细胞给予渗透压保护
优点：获得完整细胞多，可获得纯材料。 缺点：酶量要求严格，对细胞损伤大。
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三、单细胞培养
对分离得到的单个细胞进行培养，诱导其分裂增 殖，形成细胞团，再通过细胞分化形成芽、根等 器官或胚状体，直到长成完整植株的技术。 培养方法：
将游离的植物细胞按一定的细胞密度，悬浮在液 体培养基中进行培养的方法。 便于细胞交换，细胞状态易保持一致。 适宜于大规模培养，细胞工程产业的技术基础。
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1、悬浮培养过程
选择择适宜的外植体； 诱导疏松愈伤组织； 选择适宜的培养基；
悬浮培养；
第四章
植物细胞与原生质体培养
一、基本概念
1、植物细胞培养（plant cell culture）：
指在离体条件下对单细胞或小细胞团进行培 养，形成单细胞无性系或再生植株的技术。
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2、原生质体培养：
通过一定方法除去细胞壁，而得到一个裸露的植物 细胞，即为原生质体(Protoplast)。 游离的原生质体像正常的 植物细胞那样具有全能性，
愈伤组织培养放置滤片纯化的单细胞接种于滤纸上
培养转接细胞团
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3、微室培养
微室培养(micro-chamber culture)：悬浮单细胞接
种于凹玻片或玻璃环与盖玻片组成的微室内的固
体培养基中的培养方法。
一步法是将材料在21-28℃用纤维素酶及果胶酶混合液一
次性处理2-24h。 二步法是将材料先用果胶酶降解胞间胶层得到单细胞，再 用纤维素酶脱壁而释放原生质体。
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4、原生质体的纯化
沉降法: 原生质体混合物经微孔过滤后，低速（150g）离 心5min, 沉淀再用与酶液具相同糖浓度溶液反复洗3-4次， 后用培养液洗涤备用；
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常用的酶类
纤维素酶
Onozuka R-10及RS，国内常用的为EA3-867，其中含少量果胶酶。
Macerozyme R-10 又叫离析酶，主要含果胶酶，活力较高，其含杂酶 较多，用量不超过2％，作用时间长有毒害作用； Pectalyase Y—23，也叫离析软化酶，活力极高，叶片用量一般为0．1 ％，悬浮细胞为0．05％；
原生质体培养通常与细胞融合、转基因配合进行。
2015/11/2
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流程
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1、原生质体制备
材料来源：
可以用各种组织和器官，但多应用叶片、愈伤
组织及悬浮培养细胞。以及茎尖、根尖、子叶
和胚性组织。
预处理
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期、对数生长期、减慢期及静止 期等阶段。接种时细胞要达到一 定细胞浓度，通常为0. 25 x l06
细胞／ml -0. 5 x 106细胞／
m1。
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连续培养(Continuous culture)：是用一定容积的 非密闭系统进行细胞培养的方法，在培养过程中 不断注入新鲜培养基，而使营养物连续得到补充， 细胞生长和增殖连续进行，同时有等体积的培养
28
2. 制备原生质体的酶类
作用：消化细胞壁 高等植物细胞壁主要成分为a-纤维素，其次为半纤维素、
果胶质及蛋白质。
细胞生长的不同阶段及不同物种的细胞壁组成与结构不同， 木质化及次生加厚的细胞壁不被酶消化，故选择材料和消 化细胞壁的酶类是制备原生质体关键。
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