李春强PEG原生质体制备

尖孢镰刀菌PEG转化
材料与方法
质粒：
pCT74，含有真菌Pyrenophora triticirepentis的ToxA启动子和潮霉素B磷酸转移酶基因（hygr）。

培养基：
LB培养基：酵母提取物5 g、蛋白胨10 g、NaCl 10 g、琼脂15 g、水1000 mL、pH 7.0 ；
PDB培养基：马铃薯200 g、蔗糖20 g，水1000 mL；
PDA培养基：马铃薯200 g、蔗糖20 g、琼脂粉l5 g、水1000 mL；
再生半固体培养基：马铃薯200 g、山梨醇182 g、琼脂9 g、水1000 mL。

酶制剂：
崩溃酶 (Drislase，购自Sigma公司)，溶壁酶 (Lysing Enzyme，购自广东微生物所)。

(50)裂解液：0/20 mg·mL-1崩溃酶和20 mg·mL-1溶壁酶，酶液用冷的0.8 mol·L-1的NaCl配置，28 ℃，70 r·min-1轻微振动溶解30 min，用0.22 μm的微孔过滤器过滤，除去杂质
稳渗剂：
0.8 mol·L-1 NaC1，
山梨醇溶液 [STC，含1.2 mol·L-1山梨醇、10 mmol·L-1Tris-HCl (pH 7.5)、50 mmo1·L-1 CaCl2]，PTC溶液 [含40% PEG4000、10mm Tris-HCl (pH 7.5)、50mm CaCl2]
抗生素：
氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)，潮霉素B(hygromycin B，HmB)。

原生质体制备：（预备实验：50ml离心管中孢子需要多少转才能沉淀下来）
从培养皿上挑取少量菌丝于250 mL三角瓶里摇床培养2d（48h）。

三层擦镜纸过滤除去菌丝，获得孢子悬浮液，浓度约为1×107 cfu·mL-1。

(从固体培养平板上挑起菌落，置入灭有无菌蒸馏水的200毫升试剂瓶中（瓶中加玻璃珠），剧烈振荡，把菌块打碎，释放孢子；三层擦镜纸过滤，滤液放在2个菌4个50ml 离心管里，然后离心，把孢子离心下来，倒去一部分无菌水，对孢子悬浮液进行浓缩) 取1-2 mL孢子悬浮液到盛有100 mL PDB培养基的250 mL三角瓶中，28 ℃，120-150 r·min-1摇床培养12-14 h。

培养液经三层擦镜纸过滤收集菌丝（先去除瓶壁上留有的一圈菌丝，用灭菌药匙刮下，置入50ml离心管中），并用0.8 mol·L-1的NaCl充分洗涤。

（离心倒掉上清液）
取600 mg菌丝体加2mL(50)裂解液（包含10/20 mg·mL-1崩溃酶和20 mg·mL-1溶壁酶，酶液用冷的0.8 mol·L-1的NaCl配置，28 ℃，70 r·min-1轻微振动溶解30 min，用0.22 μm的微孔过滤器过滤，除去杂质），28 ℃，70 r·min-1消化2-3 h。

三层擦镜纸收集滤液，室温3000 r·min-1离心10 min，弃上清液加2 mL STC溶液5000 r·min-1离心10 min；
沉淀加200ul STC,直接用于转化。

原生质体的转化：
加40ul pCT74质粒DNA，室温20分钟；
加1-1.25ml 40% PTC (2ml STC中加1g PEG4000，过滤除菌)，一滴一滴的加，边加边摇，室温20分钟；
加到100ml冷却到40℃（50℃左右）的0.9%琼脂再生半固体培养基中（50ug/ml amp 和150ug/ml HYG）,混匀后倒入底层已覆盖再生半固体培养基的平板上.
28 ℃，倒置培养7-10 d后获得转化子。