拟南芥原生质体的制备及转化
拟南芥原生质体的提取和转化
拟南芥原生质体的提取和转化拟南芥原生质体的提取和转化(1)取4周后抽薹前的叶片，切成1mm宽的长条，置于甘露醇溶液（称1.82g D-甘露醇于20ml双蒸水中）；共需叶片约90片；(2)将步骤1中细条捞出，置于酶解液中；避光，23℃,40-50rpm 摇床上酶解3小时；(3)酶解液过100-200目的筛子，收集滤液，置于15ml离心管中，均分为两管；于4℃，60g，离心15min；(4)原生质体用冰冷W5溶液轻柔洗涤，每管4ml；4℃，100g，离心1min；(5)弃上清，沉淀用冰冷的W5溶液轻柔悬浮，每管4ml；冰上放置30min；(6)23℃，100 g离心1min；弃上清，每管沉淀用0.5ml MaMg 重悬；以下操作均在23℃下进行：(7)取约10-20ug 质粒于1.5ml EP管中，加100ul 步骤6中的原生质体；用200ul 枪头（剪去前端）轻柔混匀；(8)加入110ul PEG/Ca 溶液，轻柔混匀；放置20-30min；(9)加入0.44ml W5 溶液，来回颠倒混匀；23℃，100 g，1min，brake 设为4-5；(10)弃上清，加100ul W5，混匀；加900ul W5，混匀；(11)上述混合液体置于六孔板内，23℃，避光，孵育6-18小时。
(1)酶解液：cellulose R10 15%Macerozyme R10 0.3%Mannitol 1.09gKCl 0.3MMES 0.3M调节pH值到5.7，55℃加热10min，冷却到室温再加入下列溶液CaCl20.15Mβ-巯基乙醇0.75mM(2)PEG溶液（40%，v/v）PEG4000 1g0.8M Mannitol 0.625ml1M CaCl2 0.25m(3)W5溶液154mM NaCl 9.0g125mM CaCl218.4g5mM KCl 0.37g5mM glucose 0.9g0.03%MES 0.3g用KOH调pH至5.8，定容至1000ml，高压灭菌(4)MaMg溶液1M MgCl20.5ml0.1%MES 0.1g0.4M Mannitol7.3g用KOH调pH至5.8，定容至1000ml，高压灭菌。
模式植物-拟南芥
miR156
miR171
miR156和miR171调控表皮毛发生的分子机制
微管结合蛋白参与的下胚轴伸 长调控
微管(microtubule)的结构
微 管 的 聚 合
植物细胞周期中的微管列阵
间 期 周 质 微 管 早 前 期 微 管 带
纺 锤 体 微 管
成 膜 体 微 管
干扰微管或微丝骨架所引起的表型
Reporters
Gal4 GUS GUS LexA-Gal4-GUS LexA(2×) Gal4(2×)
转录激活子检测： 对照组 GD + Gal4-GUS 检测组 GD-Gene + Gal4-GUS
转录抑制子检测： 对照组 GD + LD-VP16 + LexA-Gal4-GUS 检测组 GD-Gene + LD-VP16 + LexA-Gal4-GUS
SA
JA
GA和CTK促进表皮毛的发生
Gibberellins
Cytokinin ZFP6
SPY ZFP5
GIS
ZFP8/GIS2
TTG1-GL1/MYB23-GL3/EGL3 GL2 Trichome Initiation
JA增加表皮毛密度和数目
SA减少表皮毛的密度和数目
JA促进表皮毛发生的机制：
2. bHLH类转录因子：
GLABRA3 (GL3), ENHANCER OF GLABRA3 (EGL3)
3. 含WD40重复序列的转录因子：
TRANSPARENT TESTA GLABRA1 (TTG1)
4. C2H2类转录因子：
GLABROUS INFLORESCENCE STEMS (GIS) ,GIS2, Zinc Finger Protein 5 (ZFP5), ZFP6, ZFP8
玉米和拟南芥的原生质体制备及瞬时表达体系的研究
玉米和拟南芥的原生质体制备及瞬时表达体系的研究作者：赵苏州卢运明张占路赵杨敏王磊来源：《安徽农业科学》2014年第12期摘要[目的]优化玉米和拟南芥原生质体的制备条件及瞬时表达体系。
[方法]以不同时期玉米叶片和拟南芥为材料分离原生质体，通过对不同酶浓度，解离时间和渗透压的研究，优化最佳分离原生质体体系；原生质体再经PEG介导的转化，通过GFP基因表达百分比鉴定原生质体活性和转化效率。
[结果]玉米和拟南芥原生质分离的最佳条件为：纤维素酶1.5%，离析酶0.5%；拟南芥酶解4 h，甘露醇浓度0.4 mol/L；玉米酶解6 h，甘露醇浓度0.45～0.50 mol/L。
最佳生长时期为：拟南芥6～8片叶；玉米二片叶。
用去内毒素质粒经PEG（玉米30% PEG，拟南芥40% PEG）诱导转化置于黑暗下培养，原生质体活性和转化效率较高，原生质体中可以观察到明显的GFP荧光。
[结论]玉米和拟南芥原生质体的制备受酶浓度，解离时间和渗透压的影响，在原生质体转化过程中，质粒DNA纯度，PEG浓度等是影响转化效率的关键因素，与拟南芥原生质体相比玉米原生质体要稳定性差一些。
关键词玉米；原生质体；拟南芥中图分类号S513；Q819文献标识码A文章编号0517-6611（2014）12-03479-04基金项目国家转基因生物新品种培育重大专项（2011ZX08003-002）。
作者简介赵苏州（1988-），男，山东临沂人，硕士研究生，研究方向：植物转录因子。
*通讯作者，研究员，博士，从事植物基因沉默研究。
植物原生质体是指植物细胞通过机械或酶解等特殊方法脱去细胞壁后，留下的裸露、具有生活力、被细胞膜所包围的原生质团。
原生质体由于没有细胞壁，可相对容易摄取外源DNA、质粒、病毒颗粒等外源遗传物质，是进行遗传转化的理想受体；同时，原生质体也是获得细胞无性系和选育突变体的优良起始材料；还可通过诱导形成杂种细胞，为创造新杂种开辟了途径。
拟南芥原生质体的提取和转化
拟南芥原生质体的提取和转化(1)取4周后抽薹前的叶片，切成1mm宽的长条，置于甘露醇溶液（称1.82g D-甘露醇于20ml双蒸水中）；共需叶片约90片；(2)将步骤1中细条捞出，置于酶解液中；避光，23℃,40-50rpm摇床上酶解3小时；(3)酶解液过100-200目的筛子，收集滤液，置于15ml离心管中，均分为两管；于4℃，60g，离心15min；(4)原生质体用冰冷W5溶液轻柔洗涤，每管4ml；4℃，100g，离心1min；(5)弃上清，沉淀用冰冷的W5溶液轻柔悬浮，每管4ml；冰上放置30min；(6)23℃，100 g离心1min；弃上清，每管沉淀用0.5ml MaMg重悬；以下操作均在23℃下进行：(7)取约10-20ug 质粒于1.5ml EP管中，加100ul 步骤6中的原生质体；用200ul 枪头（剪去前端）轻柔混匀；(8)加入110ul PEG/Ca 溶液，轻柔混匀；放置20-30min；(9)加入0.44ml W5 溶液，来回颠倒混匀；23℃，100 g，1min，brake 设为4-5；(10)弃上清，加100ul W5，混匀；加900ul W5，混匀；(11)上述混合液体置于六孔板内，23℃，避光，孵育6-18小时。
(1)酶解液：cellulose R10 15%Macerozyme R10 0.3%Mannitol 1.09gKCl 0.3MMES 0.3M调节pH值到5.7，55℃加热10min，冷却到室温再加入下列溶液CaCl20.15Mβ-巯基乙醇0.75mM(2)PEG溶液（40%，v/v）PEG4000 1g0.8M Mannitol 0.625ml1M CaCl2 0.25m(3)W5溶液154mM NaCl 9.0g125mM CaCl218.4g5mM KCl 0.37g5mM glucose 0.9g0.03%MES 0.3g用KOH调pH至5.8，定容至1000ml，高压灭菌(4)MaMg溶液1M MgCl20.5ml0.1%MES 0.1g0.4M Mannitol7.3g用KOH调pH至5.8，定容至1000ml，高压灭菌。
拟南芥的遗传转化
XU E SHU TA N TA O学术探讨拟南芥的遗传转化河南农业职业学院刘晓丽魏楠摘要：通过构建重组表达载体，转化农杆菌制作浸染液，实现农杆菌介导法进行目的基因的拟南芥遗传转化，将目的基因转入到野生型拟南芥中。
通过筛选和鉴定后，得到阳性的转基因植株，最终得到纯合T3代转基因株系。
后续可以通过对纯合转基因株系和野生型拟南芥进行比较鉴定，即可推断目的基因在拟南芥中的功能。
关键词：拟南芥；遗传转化；实验一、实验材料（一）试验材料转基因所需的菌株：农杆菌EHA105；转基因所需的模式植物：野生型拟南芥；转基因所需的植物表达载体：pCAMBIA3301。
（二）试验试剂本实验所需试剂主要有：Mu⁃rashige Skoog（MS）培养基：M519（Phyto Technology Laboratories，LLC）；YEB、YEP液体培养基；YEP固体培养基；抗生素氯霉素（chlorampheni⁃col，Chl）、卡那霉素（kanamycin，Kan）；草铵膦（phosphinothricin，PPT）；v／v（1∶5）的次氯酸钠溶液；琼脂；蔗糖；表面活性剂silwet L－77等。
二、实验方法（一）超表达载体的构建采用质粒小提试剂盒提取扩增、测序结果均正确无误的pGM－T－目的基因的质粒，具体步骤如下：第一，取2ml过夜培养的含目的基因的大肠杆菌Trans5α转化菌液，12，000rpm 离心1min，吸除上清；第二，向留有菌体沉淀的离心管中加入150μl溶液P1（已加入RNase A和0.5％的TIANRed），使用涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀；第三，向离心管中加入150μl溶液P2，温和地上下翻转6～8次，使菌体充分裂解；第四，向离心管中加入350μl溶液P5，立即快速地上下颠倒12～20次，充分混匀，将出现絮状沉淀，然后，12，000rpm离心2min；第五，将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中，注意尽量不要吸出沉淀。
拟南芥培养及遗传转化
拟南芥待转化植株培养及遗传转化一实验目的：获得待转化拟南芥植株并进行花序浸润转化植株。
二实验材料：拟南芥种子（拟南芥的生态型最好是Col-0或者Ws-O，Nd-O，No-O），25cm3花盆，15ml离心管，10ml吸管，Agar，乙醇，次氯酸钠，利福平，Silwet L-77，营养液配方所需试剂，营养土，蛭石，塑料薄膜，托盘等。
三实验步骤：1 待转化植株培养⑴种子消毒：20μl种子装入1.5ml离心管内，加1ml 75% 乙醇消毒1分钟；吸去乙醇，加入1ml 1%次氯酸钠，震荡洗涤15-20分钟；稍离心使种子沉于下部，吸去次氯酸钠，加入无菌蒸馏水清洗（清洗3次，每次洗完后稍离心，吸净水分）；均匀撒播于MS培养基平板上，注意每次洗脱用V ortxe充分混匀。
⑵春化作用：将MS培养基放到4℃冰箱中放置2天。
⑶将MS培养基放置在23 0 C/20 0 C光照培养箱16h/8h培养，在有3~5片成熟叶片后，移栽生长良好的拟南芥幼苗至用营养液浇灌过的营养土和蛭石（4:6）中生长，营养土和蛭石分装在25cm3的小培养皿中，保湿7天左右，湿度为60%~80%。
在生长期间适当浇灌营养液，按需要没3-4周一次（或者时间更长）。
⑷为了在每个植株上得到较多的花芽，当大多数植株第一个花序形成后剪去第一个花序，解除顶端优势，促使多个次生花序的同步出现。
当大多数花序约1~10cm高（剪主序后4~8d）时准备浸润。
表1 MS培养基注意事项：①溶化琼脂：用粗天平分别称取琼脂5.5g、蔗糖20 g，放入1 000 mL的搪瓷量杯中，再加入750 mL蒸馏水，用电炉加热，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状。
然后再将配好的混合培养液加入到煮沸的琼脂中，最后加蒸馏水定容至1000 mL，搅拌均匀。
②调节PH至5.7~5.8。
表2 营养液配方（无需调节PH）成分含量（mol/L）Ca(NO3)2·4H2O 1.01×10-3NH4H2PO4 1.30×10-4KNO3 5.10×10-3MgSO4·7H2O 4.98×10-4NaOH 3.13×10-5Fe-EDTA 2.24×10-5H3BO39.68×10-6Mncl2·4H2O 2.03×10-6CuSO4·5H2O 2.1×10-7MoO3 1.39×10-7Co（NO3）2·6H2O 8.59×10-8NH4NO3 2.93×10-52 农杆菌的培养取出保种的农杆菌菌液活化后，挑取农杆菌单菌落接入10mL无菌LB液体培养基中（一般含75mg/ L利福平、100mg/ L链霉素和100mg/ L卡那霉素），28℃恒温下250r/ min 振摇过夜培养。
拟南芥转化简易操作
拟南芥转化简易操作（滴染）热带农科院热带生物所的庞永奇向我们介绍了一种拟南芥转化的简易操作。
背景：拟南芥转化大体分为浸花、喷洒及滴染几种，主要是将农杆菌菌液重悬至一定浓度进行侵染，使用中各有优缺。
本人在研究中感觉滴染效果较好，并在实践中做了些简略与细化。
方法改进：摇菌3～5mL过夜，1.5mL管集3mL菌，以1mL渗入缓冲液（1/2MS大量、5%（W/V）蔗糖、0.02～0.05%silwet L-77）重悬，吸取调好的农杆菌菌液滴于每一簇刚露白的花蕾处。
做好标记后直接放回光照培养。
一周内对所转植株进行二次重复侵染转化。
约两三周会有第一批几个荚成熟，直接取了进行筛选，效果好的话一般可以筛到几株至几十株阳性苗。
后续的种子当然也要收着。
结果：一般情况下只需转化2～8株即可筛选获得十几或几十个转基因阳性株系。
单株可以分不同侧枝进行，效果也还不错。
一定要注意苗的生长状况，温度失控、虫害以及打药都可能造成不得影响。
新配的悬浮液浸润效果要好些，浸花时要保证溶液浸入。
http:/newsf/2010-8/2010820173025393.htm拟南芥转化（浸泡）1.准备工作：250mL LB（装锥形瓶中）500mL 5%蔗糖50mL离心管5-6个灭菌转化一般在剪花后一周左右烧杯（500mL）、玻璃棒2.（1）农杆菌活化 5 mL LB +15uL Rif(20mg/mL)+3.75uL Kan(100mg/mL)+200uL菌液。
即：5 mL LB液中（含Rif 60ug/mL;Kan 50ug/L）。
28℃摇床过夜。
（2）将活化的农杆菌液转至250uL LB液中。
LB（250mL）+750uL Rif +187.5uL Kan +5mL预培养的菌液，28℃摇1-2d,至色。
（3）5000rpm;10min. 去上清，加5%蔗糖悬浮沉淀（剩一两管）加至烧杯，混匀，调OD值为0.5—0.8之间（0.7—0.8为最佳）加150uL表面活性剂silwet，混匀浸泡花90s包上保鲜膜，倒放16—24h,保湿正常培养，收种种子的筛选：MS板加入50uL/mL Kan 即可。
拟南芥转化
拟南芥的遗传转化（花序浸泡法）
1.培养基
YEP培养基：蛋白胨10g/L 酵母提取物10g/L
NaCl 5g/L 固体琼脂粉15g/L
2.拟南芥材料
培养拟南芥直到它们开始抽苔并产生花序（为了让植株产生更多不成熟的花序，需要推迟转化实验，将抽出的第一个苔剪去，以便于莲花座上腋芽分化出的第二花序的增值）。
3.拟南芥的遗传转化
1)含有目的基因的双元载体转化农杆菌，并接种当菌斑到5ml含有
适当抗生素的YEP液体培养基中，28℃培养2天。
2)再将这一培养基内注入500ml带有适当抗生素的YEP液体培养
基，并在28℃条件下培养16-24小时，使用生长达到稳定期的细胞（OD=1.0-1.6）
3)室温下4000rpm离心10分钟，收集农杆菌细胞，然后加入新制的
5%蔗糖，轻轻悬浮细胞，使OD =0.6-0.8
加入Silwet L-77至浓度0.05%，立刻混匀。
将农杆菌悬浮细胞转移到大的平皿中，用于侵染。
注：Silwet L-77可能有毒，腰带手套保护皮肤。
4)倾斜植株，使所有的花序都浸泡在农杆菌溶液中，浸泡时间1.5-2
分钟，取出后轻轻煽动10秒，控干3-5秒，将植株横放，暗处培养16小时，再恢复光照。
5)为了提高转化效率，可以浸泡植株两次，中间相隔7天。
6)分株收种子，并在含有合适抗生素的MS培养基上萌发，筛选得
到T1转基因拟南芥。
拟南芥原生质体的制备及转化
拟南芥原生质体制备转化操作流程主要试剂1. 纤维素酶解液：试剂15ml酶液体系1．1-1.5﹪Cellulase R10 (YaKult Honsha)0.225g干粉2．0.2-0.4﹪Mecerozyme R10 (YaKult Honsha)0.045g干粉3．0.4M mannitol1.09g干粉4．20mM KCl1 ml 0.3 M KCl母液5．20mM MES,pH5.7，1 ml 0.3 M MES,pH5.7母液6．加入10ml 水7．55℃水浴加热10分钟（钝化酶，提高酶的可溶性），冷却至室温后加入以下试剂8．10mM CaCl，1 ml 0.15M CaCl29．5 mM β-Mercaptoethanol（可选用）1ml 75mM β-Mercaptoethanol母液(Sigma A-6793) 10．0.1﹪BSA，1 ml 1.5﹪BSA（4℃保存）11．用0.45μm滤膜过滤后使用，酶液是淡棕色的澄清溶液。
2. PEG溶液（40%, v/v）（一次配置可以保存五天，但是最好现用现配，每个样品需100ul PEG4000溶液，可根据实验样品量调整溶液配置总量）PEG4000( Fluka, #81240)……………1g………………………………….4g 水…………………………………………………0.75ml…………………………..3g0.8 M Mannitol…………………………..0.625ml…………………………2.5ml1 M CaCl2或Ca(NO3)2………………..0.25ml………………………….1ml约1.2ml3. W5 溶液（1000ml）154mM NaCl, NaCl9g125mM CaCl2, CaCl2.H2O18.4g5mM KCl, KCl0.37g2mM MES（PH 5.7），MES0.39gpH to 5.8 with KOH，高温高压灭菌20分钟，室温保存。
拟南芥原生质体转化
2.2.7 拟南芥原生质体制备制备酶解液10 ml1．取幼嫩拟南芥叶片，使用新的单面刀片将叶片切为0.5 mm-1 mm大小。
（用胶带把下表皮沾掉，效果更好。
放一小培养皿里面降解）2．材料侵入10 ml酶解液中，暗培养3 h-4 h，至原生质体完全从叶片上解离下来。
3．酶解结束后轻轻晃动溶液，镜检酶解结果。
4．使用200目不锈钢网筛过滤原生质体至新离心管中10ml。
（冰上）5．100×g，4℃，离心2 min，收集原生质体。
6．重悬原生质体于等体积预冷的W5液体培养基中，100×g离心2 min，收集原生质体，（重复三次）。
（重悬时，先加入少些W5轻轻悬起原生质体，随后再轻轻加入剩W5）7．重悬原生质体于等体积预冷的W5液体培养基中，冰浴30 min。
8．100×g离心2 min，收集原生质体，重悬原生质体于1/10体积MMg中。
（看细胞浓度而定）9．取少量重悬原生质体镜检，其余用于转化或4℃保存一周内使用。
2.2.8 原生质体转化1．在2 ml离心管中一次加入10 µl质粒DNA(10-20 µl，大小在5 Kb之内)，100 µl原生质体，充分混匀后加入110 µl PEG4000溶液。
（3=1+2）2．上述混合物室温放置10-30 min。
3．反应结束后加入440 µl W5液体培养基，充分混匀。
4．100×g离心2 min，收集原生质体，移除上清。
5．加入500 µl W5溶液培养基，100×g离心2 min，收集原生质体，（重复一次,可以重复两次）。
6．重悬原生质体于1 ml W5液体培养基中，在细胞培养板中，24℃黑暗培养。
7．取黑暗培养18 h后的原生质体，加入荧光素底物，使用CCD照相成像保存。
2. 酶解液10ml在一个10ml试管中分别加入下列组分Cellulase R10 0.15 gMacerozyme R10 0.04 g200mM MES pH5.7 1 ml200mM KCl 1 mlD- Mannitol 0.728 g1 M CaCl2100 µl加ddH2O至10 ml（0.45um过滤）Cellulase R10 , Macerozyme R10 :Yakault of Japan 都是经科宏达买的能买到sigma 最好了，其他药品都是sigma3. W5培养基50 ml在一个100 ml三角瓶中分别加入下列组分2M NaCl 3.85 ml200mM KCl 1.25 ml200mM MES 0.5 ml1M CaCl2 6.25 ml加ddH2O至50 ml4. MMg培养基10 ml在一个50 ml三角瓶中分别加入下列组分D-Mannitol 0.728 g150mM MgCl2 1 ml200mM MES pH5.7 200 µl加ddH2O至10 ml5. PEG/Ca2+溶液在一个10 ml离心管中分别加入下列组分PEG4000 4 gD-Mannitol 0.364 g1M CaCl2 1 ml加ddH2O至10 ml。
实验1拟南芥室内培养观察与农杆菌转化拟南芥
叶盘法 原生质体共培养 创伤植物感染法
原生质体培 养
农杆菌介导存
农杆菌介导拟南芥的转化
实验原理
技术应用
一种方便，高效的植物转基因方法，多用于转化双子叶植物， 经过改进后也逐渐用于单子叶植物的转化。
McKinney et al 2001
拟南芥转基因技术：
发育生物学实验
2016年
实验1 拟南芥室内培养观察及 农杆菌转化拟南芥
一、拟南芥简介
二、实验技术---农杆菌介导拟南芥转化
农杆菌介导拟南芥的转化
实验目的
1、学习真核生物的转基因技术及农杆菌介导的转化原理 2、掌握农杆菌介导转化拟南芥 的实验方法 3、了解拟南芥的生理特点及在基因工程实验中应用。
实验材料
拟南芥转基因技术： McKinney et al 2001
1、影响因素 MS salts, hormone, OD of bacteria etc.
2、 3、 4、
作业
预习：烟草叶片愈伤组织诱导和器官发生
课后各组查阅资料，设计3个不同浓度的NAA和 6-BA，用于诱导不同器官，如芽、根、叶等
8、高压灭菌
（1） MS培养基（121ºC,15分钟）。 （2）玻璃烧杯：200ml 2个、500ml 1个、 50ml的三角瓶
20个、培养皿8个（ 4培养皿装滤纸，6片/平皿）。 （3）枪型镊子、剪刀各2把。 （4）1ml、200ul、20ul的tip头各1盒。 (5)无菌水500～700mL*2
农杆菌GV3101重组菌株，重组双元表达载体pCAMBIA1300 ， 拟南芥
实验试剂
LB液体培养基，Kan（卡那霉素），Rif（利福平）； 转化介质 ：MS培养基、5%蔗糖，0.03%SilwetL-77，KOH调 pH 5.7。
拟南芥转化
1农杆菌感受态细胞的制备挑取根癌农杆菌GV3101单菌落于 5 ml含100 µg/ml利福平(Rifampicin)，50 µg/ml卡那霉素(Kanmycin)和50 µg/ml庆大霉素(Genmycin)的LB液体培养基中，28℃振荡培养过夜；取过夜培养菌液500 µl接种于50 ml LB(含相应抗生素)液体培养基中，28℃振荡培养4-8小时(OD600为0.5-0.8)；冰浴30分钟，4,000 rpm，4℃离心10分钟，加入10 ml预冷的20 mM CaCI2悬浮农杆菌细胞，4000 rpm，4℃离心10分钟；加入2 ml预冷的20 mM CaCl2悬浮细胞，冰浴，分装成每管100 µl，液氮中速冻后，置-80℃保存备用。
2.质粒转化农杆菌GV3101将构建的带有目的基因的质粒pCAMBIA-1304-plc转化(冻融法) 根癌农杆菌GV3101，步骤如下：1) 从-80℃冰箱中取出GV3101 感受态细胞(100 μl)，置于冰上解冻；2) 加入5 μl 含目的基因的质粒，轻轻混匀；冰水浴5 min；3) 液氮冷冻8 min；4) 37℃水浴热激5 min；5) 加入900 μl LB/ (Gen + Kan + Rif) 液体培养基后于28℃，160 r/min 振荡培养3－5 h 复苏；6) 复苏结束后于4000 r/min 室温离心5 min；7) 吸去800 μL 上清，然后重悬菌体，将菌体涂布于LB/ (Gen + Kan + Rif) 固体平板上；8) 28℃倒置培养2 d 直至长出阳性菌落；9) 挑取单克隆菌落，经LB/ (Gen + Kan + Rif) 液体培养，通过菌落(液) PCR验证，以确认是否成功转化。
经验证转化成功的农杆菌经即可用于后期拟南芥转化用。
（3拟南芥的转化在拟南芥抽苔4-5厘米时剪去主枝顶端，促进侧枝生长，约4-5天后进行转化，转化前要使土壤充分湿透，拟南芥苗要打药杀虫。
拟南芥的遗传转化
用移液器转移到吸附柱 CP3 中，注意 尽量不要吸出沉淀。12，000 rpm 离心 30s，倒掉收集管中的废液；第六，向 吸 附 柱 CP3 中 加 入 300μl 漂 洗 液 PWT，12，000 rpm 离心 30s，倒掉收 集管中的废液；第七，重复步骤六； 第八，将吸附柱 CP3 放入收集管中， 12，000 rpm 离心 1 min，目的是将吸 附柱中残余的漂洗液去除；第九，将 吸 附 柱 CP3 置 于 一 个 干 净 的 离 心 管 中，向吸附膜的中间部位滴加 50μl 洗 脱缓冲液 TB，12，000 rpm 离心 30s 将 质粒溶液收集到离心管中。进行质粒 提取后，用两个内切酶 Bgl II 和 Pml Ι 分别对 pGM－T－目的基因的质粒和 pCAMBIA3301 载体进行双酶切。加样 结束后，混匀，37℃酶切 10h。酶切产 物进行琼脂糖凝胶电泳，且对目标片 段及 pCAMBIA3301 骨架进行胶回收。 然后，通过连接酶对目标片段和 pCAMBIA3301 骨架进行连接，构建重 组表达载体。转化大肠杆菌 Trans 5α感 受态，挑斑、摇菌，进行菌液 PCR 检 测。挑取阳性 pCAMBIA3301－目的基 因克隆提取质粒，进行双酶切验证和 测 序 。 测 序 正 确 后 ， 阳 性 pCAM⁃ BIA3301－目的基因克隆质粒转化农杆 菌 EHA105 感受态。
学术探讨
XU E SHU TA N职业学院 刘晓丽 魏 楠
摘 要：通过构建重组表达载体，转化农杆菌制作浸染液，实现农杆菌介导法进行目的基因的拟南芥遗传转化，将目的基因转入到野生 型拟南芥中。通过筛选和鉴定后，得到阳性的转基因植株，最终得到纯合 T3 代转基因株系。后续可以通过对纯合转基因株系和野生型拟南 芥进行比较鉴定，即可推断目的基因在拟南芥中的功能。
北方地区拟南芥栽培技术及基因转化体系的构建
试验研究北方地区拟南芥栽培技术及基因转化体系的构建摘要：从基质的配制、播种方法、栽培管理、基因转化及转化植株筛选等方面对北方地区拟南芥的栽培技术和基因转化体系的构建方法进行了介绍，旨在为拟南芥在北方种植和利用拟南芥展开植物的分子研究提供依据。
关键词：拟南芥；栽培技术；转化体系拟南芥(Arabidopsis thaliana)属十字花科植物，又名鼠耳芥、阿拉伯芥、阿拉伯草。
它具有植株小、每代时间短、结籽多、生活力强等特点，是研究有花植物的遗传、细胞、发育、分子生物学的模式植物，被誉为植物界的“果蝇”。
现在发现的拟南芥生态型共有750多个，其中最常用的三种是Landsberg erecta(Ler)、Columbia (Col)、Wassilewskija(Ws)，其中Col生态型用于拟南芥的全基因组测序。
为了充分发挥这一模式植物的优点，掌握拟南芥在北方地区的培养技术就显得非常重要。
结合本地的试验条件和气候特点及实践经验，笔者着重在拟南芥的培养介质、播种方法、温湿度、光照条件及基因转化的常用方法等方面进行了概述。
1栽培基质的配制为了保证提供充足的营养与良好的通气透水性，将蛭石、草炭土按1∶1的比例混匀，180℃高温灭菌3h。
将灭菌的基质装入花盆中，然后将花盆放入盛有清水的托盘中，待水渗透到土壤表面后，将托盘中的水倒掉。
2拟南芥的播种播种前低温4℃处理2~3d(有助于种子萌发)。
由于拟南芥种子很小，一般采用蒸馏水悬浮种子，牙签点播的方法播种。
我们创新采用0.1%的琼脂粉溶液悬浮拟南芥种子，用200μl的移液枪配200μl枪头(将枪头剪掉0.5cm)反复吹吸几次，种子即可较均匀的悬浮且不沉降，调种子浓度为1~3粒/滴，用移液枪播入花盆。
每盘采用四周点播，中央一处的播种法，每点1滴。
播种后花盆覆保鲜膜，保持基质表面湿润，出苗后撤掉保鲜膜。
播种后的花盆放入人工气候箱。
3拟南芥的栽培管理拟南芥不耐旱，应及时浇水。
一种拟南芥叶肉细胞原生质体及其制备方法和应用[发明专利]
![一种拟南芥叶肉细胞原生质体及其制备方法和应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/ae32ef6c302b3169a45177232f60ddccdb38e649.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811394334.6(22)申请日 2018.11.21(71)申请人 河南农业大学地址 450002 河南省郑州市金水区文化路95号(72)发明人 史勇 金维环 陈彦惠 任真真 刘姣姣 王林会 (74)专利代理机构 郑州中原专利事务所有限公司 41109代理人 赵磊 王文文(51)Int.Cl.C12N 5/04(2006.01)C12N 15/82(2006.01)C12N 5/10(2006.01)(54)发明名称一种拟南芥叶肉细胞原生质体及其制备方法和应用(57)摘要本发明公开了一种拟南芥叶肉细胞原生质体的制备方法，具体步骤如下：剪取3-5周的拟南芥叶片用无弹性的纸质胶带或布质胶带固定叶片的上表皮和下表皮；轻轻撕掉叶片下表皮的无弹性的纸质胶带或布质胶带，将剪好的叶片放入含有酶解液的培养皿中；将放有叶片的培养皿置于摇床中培养30-90min或者直至绝大部分或全部原生质体从叶片上脱离下来为止；将含有原生质体的酶解液转移到圆底离心管中，离心收集原生质体；用预冷的W5溶液清洗原生质体，用W5溶液重悬原生质体并在冰上放置最少30分钟。
本发明将原生质体置于黑暗条件下培养，有效解决了光照培养引起的细胞死亡和凝聚现象，能极大的提高转化效率。
权利要求书1页 说明书7页 附图5页CN 109355246 A 2019.02.19C N 109355246A1.一种拟南芥叶肉细胞原生质体的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：（1）剪取3-5周的拟南芥叶片用无弹性的纸质胶带或布质胶带固定叶片的上表皮和下表皮；（2）轻轻撕掉叶片下表皮的无弹性的纸质胶带或布质胶带，用剪刀减掉下表皮未被撕掉的叶片部分和不含叶片的胶带部分，将剪好的叶片放入含有酶解液的培养皿中；（3）将放有叶片的培养皿置于35-45转每分钟的摇床中培养30-90min或者直至绝大部分或全部原生质体从叶片上脱离下来为止；（4）将含有原生质体的酶解液转移到圆底离心管中，90-110 xg离心2-4分钟收集原生质体；用预冷的W5溶液清洗原生质体2次，用W5溶液重悬原生质体并在冰上放置最少30分钟。
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拟南芥原生质体制备转化操作流程
主要试剂
1. 纤维素酶解液：
试剂
15ml酶液体系
1．﹪ Cellulase R10 (YaKult Honsha) 干粉
2． Mecerozyme R10 (YaKult Honsha) 干粉
3． mannitol 干粉
4． 20mM KCl 1 ml M KCl母液
5． 20mM MES,，1 ml M MES,母液
6．加入10ml 水
7． 55℃水浴加热10分钟（钝化酶，提高酶的可溶性），冷却至室温后加入以下试剂
8． 10mM CaCl，1 ml CaCl2
9． 5 mM β-Mercaptoethanol（可选用） 1ml 75mM β-Mercaptoethanol 母液(Sigma A-6793)
10．﹪ BSA， 1 ml ﹪BSA（4℃保存）
11．用μm滤膜过滤后使用，酶液是淡棕色的澄清溶液。
2. PEG溶液（40%, v/v）（一次配置可以保存五天，但是最好现用现配，每个样品需100ul PEG4000溶液，可根据实验样品量调整溶液配置总量）
PEG4000 ( Fluka, #81240)…………… 1g………………………………….4g 水……………………………………………………………………………..3g
M Mannitol………………………….. …………………………
1 M CaCl2或Ca(NO3)2………………..………………………….1ml
约
3. W5 溶液（1000ml）
154mM NaCl, NaCl 9g
125mM CaCl2,
5mM KCl, KCl
2mM MES（PH ）， MES
pH to with KOH，高温高压灭菌20分钟，室温保存。
4. MMG溶液
MaMg溶液（500ml）
15mM MgCl2，MgCl
4 mM MES MES
M mannitol，Mannitol
用KOH调pH ，高温高压灭菌20分钟，室温保存。
5. WI溶液
WI(200ml)
mannitol，mannitol
4mM MES,，MES
20mM KCl，KCl
高温高压灭菌，室温保存。
实验步骤
1. 土培室播种种植拟南芥。
2. 生长良好情况下在未开花前用于取材叶片制备原生质体。
3. 剪取中部生长良好的叶片用新的剃须刀片切成 -1 mm宽的叶条。
4. 将切好叶条掷入预先配置好的酶解液（10ml的酶液用125ml 的三角瓶装）中（每5-10 ml酶解液大约需10-20片叶子（小量））(100 -150 叶片需要40-60ml酶解液（大量）)。
并用镊子帮助使叶子完全浸入酶解液。
5. 用真空泵于黑暗中抽5-30分钟。
6. 或者将叶条至于培养皿中加入酶液放入真空干燥箱里，在黑暗中消化3个小时，此步需要根据你自己的实验经验，通常会延长孵育16-18h。
（此时可配制PEG4000溶液，200和1000 ul枪头去尖使操作时吸打缓和。
）（此时预冷一定量W5溶液）
7. 显微镜下检查溶液中的原生质体，拟南芥叶肉原生质体大小大约30-50 um。
8. 在过滤除去未溶解的叶片前用等量的W5溶液稀释含有原生质体的酶液。
9. 先用W5溶液润湿35-75 um的尼龙膜或60-100目筛子，然后用它过滤含有原生质体的酶解液。
10. 用30毫升的圆底离心管100g，1-2分钟离心沉淀原生质体，如果回收率低可以提高转速或是加入CaCl2（50mM）。
尽量去除上清然后用10ml 冰上预冷的W5溶液轻柔重悬原生质体(电转化用预冷的W1)终浓度为1-2 x 105/ml。
11. 在冰上静至原生质体30分钟。
(在有些实验中原生质体在使用前可以在室温终保存)
以下操作在室温23℃下进行
12. 100g离心1-3分钟使原生质体沉淀在管底。
在不碰触原生质体沉淀的情况下尽量去除W5溶液。
然后用适量MMG溶液（1m）重悬原生质体，使之最终浓度在2X105个/ml。
13. 加入10 ul DNA（10-20微克约5kb的质粒DNA）至2ml离心管中。
14. 加入100 ul原生质体（2x104个），轻柔混合。
15. 加入110 ul PEG/Ca溶液，轻柔拍打离心管完全混合（每次大约可以转化6-10个样品）。
16. 诱导转化混合物5-15分钟（转化时间视实验情况而定，要表达量更高也许需要更高转化时间）。
17. 室温下用440 ul W5溶液稀释转化混合液，然后轻柔颠倒摇动离心管使之混合完好以终止转化反应。
18. 室温下用台式离心机100g离心1-3分钟然后去除上清，将原生质体轻轻吹打稀释至100ul。
再加入1ml W5溶液悬浮清洗一次，100g离心两分钟去上清。
19. 用1ml WI或者W5溶液轻柔重悬原生质体于六孔组织培养皿中。
20. 室温下（20-25℃）诱导原生质体18小时以上。
21. 激光共聚焦显微镜下观察GFP标签表达。
（以上实验可以根据自己实验情况适当调整）。