拟南芥原生质体的制备及转化

拟南芥原生质体制备转化操作流程
主要试剂
1. 纤维素酶解液：
试剂
15ml酶液体系
1．﹪ Cellulase R10 (YaKult Honsha) 干粉
2． Mecerozyme R10 (YaKult Honsha) 干粉
3． mannitol 干粉
4． 20mM KCl 1 ml M KCl母液
5． 20mM MES,，1 ml M MES,母液
6．加入10ml 水
7． 55℃水浴加热10分钟（钝化酶，提高酶的可溶性），冷却至室温后加入以下试剂
8． 10mM CaCl，1 ml CaCl2
9． 5 mM β-Mercaptoethanol（可选用） 1ml 75mM β-Mercaptoethanol 母液(Sigma A-6793)
10．﹪ BSA， 1 ml ﹪BSA（4℃保存）
11．用μm滤膜过滤后使用，酶液是淡棕色的澄清溶液。

2. PEG溶液（40%, v/v）（一次配置可以保存五天，但是最好现用现配，每个样品需100ul PEG4000溶液，可根据实验样品量调整溶液配置总量）
PEG4000 ( Fluka, #81240)…………… 1g………………………………….4g 水……………………………………………………………………………..3g
M Mannitol………………………….. …………………………
1 M CaCl2或Ca(NO3)2………………..………………………….1ml
约
3. W5 溶液（1000ml）
154mM NaCl, NaCl 9g
125mM CaCl2,
5mM KCl, KCl
2mM MES（PH ）， MES
pH to with KOH，高温高压灭菌20分钟，室温保存。

4. MMG溶液
MaMg溶液（500ml）
15mM MgCl2，MgCl
4 mM MES MES
M mannitol，Mannitol
用KOH调pH ，高温高压灭菌20分钟，室温保存。

5. WI溶液
WI(200ml)
mannitol，mannitol
4mM MES,，MES
20mM KCl，KCl
高温高压灭菌，室温保存。

实验步骤
1. 土培室播种种植拟南芥。

2. 生长良好情况下在未开花前用于取材叶片制备原生质体。

3. 剪取中部生长良好的叶片用新的剃须刀片切成 -1 mm宽的叶条。

4. 将切好叶条掷入预先配置好的酶解液（10ml的酶液用125ml 的三角瓶装）中（每5-10 ml酶解液大约需10-20片叶子（小量））(100 -150 叶片需要40-60ml酶解液（大量）)。

并用镊子帮助使叶子完全浸入酶解液。

5. 用真空泵于黑暗中抽5-30分钟。

6. 或者将叶条至于培养皿中加入酶液放入真空干燥箱里，在黑暗中消化3个小时，此步需要根据你自己的实验经验，通常会延长孵育16-18h。

（此时可配制PEG4000溶液，200和1000 ul枪头去尖使操作时吸打缓和。

）（此时预冷一定量W5溶液）
7. 显微镜下检查溶液中的原生质体，拟南芥叶肉原生质体大小大约30-50 um。

8. 在过滤除去未溶解的叶片前用等量的W5溶液稀释含有原生质体的酶液。

9. 先用W5溶液润湿35-75 um的尼龙膜或60-100目筛子，然后用它过滤含有原生质体的酶解液。

10. 用30毫升的圆底离心管100g，1-2分钟离心沉淀原生质体，如果回收率低可以提高转速或是加入CaCl2（50mM）。

尽量去除上清然后用10ml 冰上预冷的W5溶液轻柔重悬原生质体(电转化用预冷的W1)终浓度为1-2 x 105/ml。

11. 在冰上静至原生质体30分钟。

(在有些实验中原生质体在使用前可以在室温终保存)
以下操作在室温23℃下进行
12. 100g离心1-3分钟使原生质体沉淀在管底。

在不碰触原生质体沉淀的情况下尽量去除W5溶液。

然后用适量MMG溶液（1m）重悬原生质体，使之最终浓度在2X105个/ml。

13. 加入10 ul DNA（10-20微克约5kb的质粒DNA）至2ml离心管中。

14. 加入100 ul原生质体（2x104个），轻柔混合。

15. 加入110 ul PEG/Ca溶液，轻柔拍打离心管完全混合（每次大约可以转化6-10个样品）。

16. 诱导转化混合物5-15分钟（转化时间视实验情况而定，要表达量更高也许需要更高转化时间）。

17. 室温下用440 ul W5溶液稀释转化混合液，然后轻柔颠倒摇动离心管使之混合完好以终止转化反应。

18. 室温下用台式离心机100g离心1-3分钟然后去除上清，将原生质体轻轻吹打稀释至100ul。

再加入1ml W5溶液悬浮清洗一次，100g离心两分钟去上清。

19. 用1ml WI或者W5溶液轻柔重悬原生质体于六孔组织培养皿中。

20. 室温下（20-25℃）诱导原生质体18小时以上。

21. 激光共聚焦显微镜下观察GFP标签表达。

（以上实验可以根据自己实验情况适当调整）。