国自然-面上项目标书范例讲解学习

申请代码H1606

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国家自然科学基金

申请书

(2010版)

资助类别：面上项目

亚类说明：

附注说明：

项目名称：Pyk2促进肝癌细胞迁移的一个新的分子机制研究：结合并磷酸化E-cadherin?

申请人：电话：

依托单位：

通讯地址：

邮政编码：266021 单位电话：

电子邮箱：

申报日期： 2010年2月26日

国家自然科学基金委员会

基本信息yoKWT/OQ

申请人信息姓名性别男

出生

年月

1973年4月民族汉族学位博士职称副主任医师每年工作时间（月） 8 电话电子邮箱

传真国别或地区中国

个人通讯地址

工作单位

主要研究领域肿瘤分子生物学

依托单位信息名称

联系人电子邮箱电话网站地址

合

作研

究

单位信息

单位名称复旦大学

[在此录入修改］

项目基本信息项目名称Pyk2促进肝癌细胞迁移的一个新的分子机制研究：结合并磷酸化Ｅ-cadherin?

资助类别面上项目亚类说明

附注说明

申请代码H1606:肿瘤复发与转移H1617:消化系统肿瘤

基地类别

研究年限2011年1月— 2013年12月研究属性基础研究

申请经费35.0000万元

摘要(限400字)：E-cadherin的丧失与肝癌转移密切相关。其丧失的主要原因是由于其酪氨酸

残基被磷酸化后蛋白被降解。我们通过酵母双杂交发现一个新的能与E-cadherin相互作用的非受体型酪氨酸激酶Pyk2。Pyk2活性增强可促进肝癌细胞迁移。本课题假设Pyk2结合并磷酸化E-cadherin，导致E-cadherin蛋白降解，细胞迁移性增加。本课题设计首先通过GST pulldown、免疫共沉淀证明二者相互作用可靠；其次通过磷酸化实验确证Pyk2可以磷酸化

E-cadherin；然后应用细胞迁移实验和裸鼠成瘤实验确定：Pyk2通过磷酸化E-cadherin而影响肝癌细胞迁移和肿瘤转移；最后分析在人肝癌标本中二者表达的相关性以及与转移的关

系。本课题新发现Pyk2可以直接磷酸化E-cadherin，促进肝癌细胞迁移和肿瘤转移，具有

国际先进性。这对于肝癌侵袭转移的复杂机制有新的理解，对于药物研发提供新的思路。

关键词(用分号分开，最多5个)肝癌；E-cadherin；Pyk2；肿瘤转移

经费申请表（金额单位：万元）科目申请经费备注（计算依据与说明）

一.研究经费28.7500

1.科研业务费7.6000

（1）测试/计算/分析费 2.1000 DNA测序，生物信息分析，统计分析

（2）能源/动力费

（3）会议费/差旅费 1.0000 参加学术会议3-4人次

（4）出版物/文献/信息传播费 3.0000 文献检索，发表论文，专利申请

（5）其他 1.5000 成果鉴定

2.实验材料费21.1500

（1）原材料/试剂/药品购置费17.1500 各种试剂盒，脂质体，抗体，细胞培养，实验耗材（2）其他 4.0000 动物饲养，临床调研

3.仪器设备费0.0000

（1）购置

（2）试制

4.实验室改装费

5.协作费

二.国际合作与交流费 1.5000

1.项目组成员出国合作交流

2.境外专家来华合作交流 1.5000 邀请美国康奈尔大学关军林教授合作交流

三.劳务费 3.0000研究生加班补贴

四.管理费 1.75005%管理费

合计35.0000

与本项目相关的其他经费来源国家其他计划资助经费

其他经费资助（含部门匹配）

其他经费来源合计0.0000

查看报告正文撰写提纲报告正文

一、立项依据与研究内容：

（一）项目的立项依据

原发性肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，我国的肝癌发病数占全球所有肝癌病例的

一半左右，因此我国对于肝癌的研究显得非常迫切[1]。肝癌非常容易转移，其复发转移是治疗失败的主要原因。了解肝癌侵袭转移的相关机制，对于设计合理的治疗药物，进

一步提高我国肝癌的治疗水平具有重要意义[2]。

E-cadherin在肝癌细胞的侵袭、转移中起到了不可忽视的作用。E-cadherin属于钙粘附蛋白家族(Cadherin 家族)，在调节细胞与细胞之间、细胞与基质之间的粘附反应，介导细胞间的接触抑制和凋亡等方面发挥重要作用。E-cadherin与β-catenin、p120等形成复合体发挥上述功能[3]。

E-cadherin与多种肿瘤的浸润转移密切相关[ 4-5 ]。有人认为提高E-cadherin的表达可以成为肿瘤治疗的一个方向[6]。与其他肿瘤类似，研究表明E-cadherin在肝细胞癌的阳性率显著低于癌旁组织及正常肝组织，表达越低则肿瘤病理分级越差，也越容易出

现转移[7-9]。有人报道缺乏E-cadherin表达的人肝癌细胞株非常容易发生转移，但是转染E-cadherin后这种特性发生逆转，说明E-cadherin在肝癌细胞转移过程中发挥着重要的作用[10]。

E-cadherin丧失或低表达的机制至今仍然不是完全清楚。目前认为可能是由于基

因突变导致功能丧失、启动子甲基化后转录沉默[11]以及E-cadherin蛋白被磷酸化后水解等。但是在亚洲人群中基因突变和启动子甲基化都不常见[12-13]。因此最大的可能性是

E-cadherin蛋白被磷酸化后水解。有文献证明，酪氨酸残基磷酸化的E-cadherin能够与Hakai（一种E3泛素连接酶）结合，使其泛素化而降解[14 ]。那么有多少酪氨酸激酶参与这个机制呢？有报道EGFR，IGF-1R能够磷酸化E-cadherin。对于E-cadherin磷酸化的调节机制目前仍然不是非常明确。

为了解E-cadherin在肝癌细胞的分子信号通路，我们以E-cadherin（胞内段）为诱饵应用酵母双杂交（CytoTRAP系统）在肝脏的cDNA文库中筛选到一个新的能与

E-cadherin相互作用的非受体型酪氨酸激酶-Pyk2。那么，Pyk2是否能磷酸化E-cadherin 并调节细胞迁移呢？

Pyk2(proline rich tyrosine kinase 2)是一种富含脯氨酸的非受体型酪氨酸蛋

白激酶，与FAK同源度较高，属于FAK家族。Pyk2是酪氨酸激酶家族中的后起之秀，在调节细胞存活、增殖和迁移[16]方面受到越来越多的关注。Pyk2信号通路的活化能够增强细胞运动和迁移，研究发现Pyk2在多种肿瘤的侵袭和转移中起作用[17-18]。其中Sun等研究表明， Pyk2在59%的肝癌组织中表达上调， Pyk2高表达与肝癌组织体积、Edmonson分级