医学课件大肠埃希氏菌专题宣讲
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参考标准
本标准采用的定义是大肠埃希氏菌，方法 主要参考的是美国FDA Bacteriological Analytical Manual （2002）中的Enumeration of Escherichia coli and the Coliform Bacteria。
VRBA－MUG平板计数法
3 设备和材料
3.7 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻 度）、10 mL（具0.1 mL刻度）或微量 移液器及吸头。
3.8 无菌锥形瓶：容量500 mL。 3.9 无菌培养皿：直径90mm。 3.10 pH计或pH比色管或精密pH试纸。 3.11 菌落计数器。 3.12 紫外灯：波长360nm～366nm，
大肠埃希氏菌计数
大肠埃希氏菌MPN计数（第一法） 大肠埃希氏菌平板计数法（第二法）
大肠埃希氏菌计数：第一法
大肠埃希氏菌计数：第一法
5.2 操作步骤
5.2.1 样品的稀释 5.2.1.1 固体和半固体样品：称取25g样品，放
入盛有225mL磷酸盐缓冲液的无菌均质杯内，8 000 r/min～10 000 r/min均质1min～2 min，制成1:10 样品匀液。 5.2.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25 mL样 品置盛有225mL磷酸盐缓冲液的无菌锥形瓶 （瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混 匀，制成1:10的样品匀液。
研究还证实，大肠埃希氏菌荧光反应比产 气反应出现得更早，并且不受食品的影响， 仅发现对牡蛎直接进行的检验不适合用 MUG方法，因为牡蛎具有内源性葡萄糖苷 酸酶。
VRBA－MUG平板计数法
本标准采用的VRBA-MUG平板计数方法， 正是以上述理论为依据，参照FDA方法而 确立的，检验时间为18 h～24 h，并能 准确测出样品中大肠埃希氏菌的CFU数值， 操作简便，但对于对染菌量低（如＜10 CFU/g）的样品不如MPN法适用。
功率≤6 W。
4 培养基和试剂
4.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤。 4.2 EC肉汤（E.coli broth）。 4.3 蛋白胨水。 4.4 缓冲葡萄糖蛋白胨水[甲基红(MR)和
V-P试验用] 。 4.5 西蒙氏柠檬酸盐培养基。 4.6 磷酸盐缓冲液。
4 培养基和试剂
4.7 伊红美蓝（EMB）琼脂。 4.8 营养琼脂斜面。 4.9 结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）。 4.10 VRBA-MUG。 4.11 革兰氏染色液。 4.12 Kovacs 靛基质试剂。 4.13 无菌1 mol/L NaOH。 4.14 无菌1 mol/L HCl。
5.2.1 样品的稀释
5.2.1.3 样品匀液的pH值应在6.5～7.5 之间，必要时分别用1 mol/LNaOH或1 mol/L HCl调节。
5.2.1.4 用1 mL无菌吸管或微量移液器 吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注 入9mL磷酸盐缓冲液的无菌试管中（注意 吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振 摇试管或换用1支1 mL无菌吸管或吸头反 复吹打，使其混合均匀，制成1:100的样 品匀液。
卫生学意义
大肠埃希氏菌的某些菌株对人有致病性。 相对于大肠菌群和粪大肠菌群，大肠埃希 氏菌与粪便污染的相关性最好，应用也最 悠久。自1892年被提议作为粪便污染的指 示菌以来，已被应用了100多年。
3 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外， 其他设备和材料如下：
3.1 恒温培养箱：36℃±1℃。 3.2 冰箱：2℃～5℃。 3.3 恒温水浴箱：44.5℃±0.2 ℃。 3.4 天平：感量为0.1g。 3.5 均质器。 3.6 振荡器。
5.2.1 样品的稀释
5.2.1.5 根据对样品污染状况的估计，按 上述操作，依次制成10倍递增系列稀释样 品匀液。每递增稀释1次，换用1支1 mL 无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品 接种完毕，全过程不源自文库超过15 min。
5.2.2 初发酵试验
每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀 液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种 3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管 接种1 mL（如接种量超过1 mL，则用双料LST 肉汤），36℃± 1℃培养24 h±2 h，观察小 倒管内是否有气泡产生，24 h±2 h产气者进行 复发酵试验，如未产气则继续培养48 h±2 h。 产气者进行复发酵试验。如所有LST肉汤管均未 产气，即可报告大肠埃希氏菌MPN结果。
MUG对大肠埃希氏菌的生长繁殖没有抑制 作用也没有促进作用，对菌落形态也没有 影响。经实验发现，在MUG浓度从0 g/mL到200 g/mL的范围内，大肠 埃希氏菌生长繁殖率没有区别。
MUG方法有大约4%的假阴性，特别是倍 受关心的O157:H7菌株为阴性，令人感 到遗憾，但经典的常规方法也同样存在这 样的问题。
1 范围
本标准规定了食品中大肠埃希氏菌 （Escherichia coli）计数的方法。
本标准适用于食品中大肠埃希氏菌的计数， 其中大肠埃希氏菌平板计数法（第二法） 不适用于贝类产品。
2 术语和定义
2.1 大肠埃希氏菌 Escherichia coli 大肠杆菌广泛存在于人和温血动物的肠道 中，能够在44.5℃发酵乳糖产酸产气， IMViC（靛基质、甲基红、VP试验、柠檬 酸盐）生化试验为＋＋――或－＋――的 革兰氏阴性杆菌。以此作为粪便污染指标 来评价食品的卫生状况，推断食品中肠道 致病菌污染的可能性。
VRBA－MUG平板计数法
常规方法不能检出不产气菌株和乳糖迟缓 发酵菌株，而且由于O157:H7菌株不能 耐受44℃的培养温度而同样不能检出 O157:H7菌株，普通变形杆菌等某些杂 菌的存在对大肠埃希氏菌发酵乳糖的产气 能力具有抑制作用，但对分解MUG产生荧 光的能力没有抑制作用。
VRBA－MUG平板计数法
本标准采用的定义是大肠埃希氏菌，方法 主要参考的是美国FDA Bacteriological Analytical Manual （2002）中的Enumeration of Escherichia coli and the Coliform Bacteria。
VRBA－MUG平板计数法
3 设备和材料
3.7 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻 度）、10 mL（具0.1 mL刻度）或微量 移液器及吸头。
3.8 无菌锥形瓶：容量500 mL。 3.9 无菌培养皿：直径90mm。 3.10 pH计或pH比色管或精密pH试纸。 3.11 菌落计数器。 3.12 紫外灯：波长360nm～366nm，
大肠埃希氏菌计数
大肠埃希氏菌MPN计数（第一法） 大肠埃希氏菌平板计数法（第二法）
大肠埃希氏菌计数：第一法
大肠埃希氏菌计数：第一法
5.2 操作步骤
5.2.1 样品的稀释 5.2.1.1 固体和半固体样品：称取25g样品，放
入盛有225mL磷酸盐缓冲液的无菌均质杯内，8 000 r/min～10 000 r/min均质1min～2 min，制成1:10 样品匀液。 5.2.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25 mL样 品置盛有225mL磷酸盐缓冲液的无菌锥形瓶 （瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混 匀，制成1:10的样品匀液。
研究还证实，大肠埃希氏菌荧光反应比产 气反应出现得更早，并且不受食品的影响， 仅发现对牡蛎直接进行的检验不适合用 MUG方法，因为牡蛎具有内源性葡萄糖苷 酸酶。
VRBA－MUG平板计数法
本标准采用的VRBA-MUG平板计数方法， 正是以上述理论为依据，参照FDA方法而 确立的，检验时间为18 h～24 h，并能 准确测出样品中大肠埃希氏菌的CFU数值， 操作简便，但对于对染菌量低（如＜10 CFU/g）的样品不如MPN法适用。
功率≤6 W。
4 培养基和试剂
4.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤。 4.2 EC肉汤（E.coli broth）。 4.3 蛋白胨水。 4.4 缓冲葡萄糖蛋白胨水[甲基红(MR)和
V-P试验用] 。 4.5 西蒙氏柠檬酸盐培养基。 4.6 磷酸盐缓冲液。
4 培养基和试剂
4.7 伊红美蓝（EMB）琼脂。 4.8 营养琼脂斜面。 4.9 结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）。 4.10 VRBA-MUG。 4.11 革兰氏染色液。 4.12 Kovacs 靛基质试剂。 4.13 无菌1 mol/L NaOH。 4.14 无菌1 mol/L HCl。
5.2.1 样品的稀释
5.2.1.3 样品匀液的pH值应在6.5～7.5 之间，必要时分别用1 mol/LNaOH或1 mol/L HCl调节。
5.2.1.4 用1 mL无菌吸管或微量移液器 吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注 入9mL磷酸盐缓冲液的无菌试管中（注意 吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振 摇试管或换用1支1 mL无菌吸管或吸头反 复吹打，使其混合均匀，制成1:100的样 品匀液。
卫生学意义
大肠埃希氏菌的某些菌株对人有致病性。 相对于大肠菌群和粪大肠菌群，大肠埃希 氏菌与粪便污染的相关性最好，应用也最 悠久。自1892年被提议作为粪便污染的指 示菌以来，已被应用了100多年。
3 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外， 其他设备和材料如下：
3.1 恒温培养箱：36℃±1℃。 3.2 冰箱：2℃～5℃。 3.3 恒温水浴箱：44.5℃±0.2 ℃。 3.4 天平：感量为0.1g。 3.5 均质器。 3.6 振荡器。
5.2.1 样品的稀释
5.2.1.5 根据对样品污染状况的估计，按 上述操作，依次制成10倍递增系列稀释样 品匀液。每递增稀释1次，换用1支1 mL 无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品 接种完毕，全过程不源自文库超过15 min。
5.2.2 初发酵试验
每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀 液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种 3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管 接种1 mL（如接种量超过1 mL，则用双料LST 肉汤），36℃± 1℃培养24 h±2 h，观察小 倒管内是否有气泡产生，24 h±2 h产气者进行 复发酵试验，如未产气则继续培养48 h±2 h。 产气者进行复发酵试验。如所有LST肉汤管均未 产气，即可报告大肠埃希氏菌MPN结果。
MUG对大肠埃希氏菌的生长繁殖没有抑制 作用也没有促进作用，对菌落形态也没有 影响。经实验发现，在MUG浓度从0 g/mL到200 g/mL的范围内，大肠 埃希氏菌生长繁殖率没有区别。
MUG方法有大约4%的假阴性，特别是倍 受关心的O157:H7菌株为阴性，令人感 到遗憾，但经典的常规方法也同样存在这 样的问题。
1 范围
本标准规定了食品中大肠埃希氏菌 （Escherichia coli）计数的方法。
本标准适用于食品中大肠埃希氏菌的计数， 其中大肠埃希氏菌平板计数法（第二法） 不适用于贝类产品。
2 术语和定义
2.1 大肠埃希氏菌 Escherichia coli 大肠杆菌广泛存在于人和温血动物的肠道 中，能够在44.5℃发酵乳糖产酸产气， IMViC（靛基质、甲基红、VP试验、柠檬 酸盐）生化试验为＋＋――或－＋――的 革兰氏阴性杆菌。以此作为粪便污染指标 来评价食品的卫生状况，推断食品中肠道 致病菌污染的可能性。
VRBA－MUG平板计数法
常规方法不能检出不产气菌株和乳糖迟缓 发酵菌株，而且由于O157:H7菌株不能 耐受44℃的培养温度而同样不能检出 O157:H7菌株，普通变形杆菌等某些杂 菌的存在对大肠埃希氏菌发酵乳糖的产气 能力具有抑制作用，但对分解MUG产生荧 光的能力没有抑制作用。
VRBA－MUG平板计数法