肝糖原的提取、鉴定与定量实验报告记录

肝糖原的提取、鉴定与定量实验报告记录

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生物化学实验报告

姓名：

学号：

专业年级：

组别：

生物化学与分子生物学实验教学中心

实验名称肝糖原的提取、鉴定与定量

实验日期实验地点

合作者指导老师

评分XX 教师签名李某某批改日期2013-06-03

格式要求：正文请统一用：小四号，宋体，1.5倍行距；数字、英文用Times New Roman；标题用：四号，黑体，加粗。需强调的地方请用蓝颜色标出。不得出现多行、多页空白现象。

一、实验目的

1、掌握组织样品的制备方法，了解其注意事项。

2、了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意事项，掌握其操作方法。

3、正确操作使用刻度吸管和可调微量取液器。

4、熟练运用溶液混匀的各种方法。

5、正确掌握溶液转移的操作。

6、正确操作使用分光光度计。

二、实验原理

1、肝糖原的提取与鉴定

糖原储存于细胞内，采用研磨匀浆等方法可使细胞破碎，低浓度的三氯醋酸能使蛋白质变性，破坏肝组织中的酶且沉淀蛋白质，而糖原仍稳定地保存于上清液中，从而使用糖原与蛋白质等其它成分分离开来。糖原不溶于乙醇而溶于热水，故先用95％乙醇将滤液中糖原沉淀，再溶于热水中。

糖原水溶液呈乳样光泽，遇碘呈红棕色。这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋中，

依靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。糖原还可被酸水解为葡萄糖，利用呈色反应和葡萄糖的还原性，可判定肝组织中糖原的存在。

CuSO4十2NaOH = Na2SO4+Cu(OH)2↓

2Cu(OH)2十C6H12O6 = 2CuOH十氧化型葡萄糖+H2O

2CuOH = Cu2O↓(红色)+H2O

Cu(OH)2= CuO↓(黑色)+H2O

2、肝糖原定量测定

糖原在浓酸中可水解成为葡萄糖，浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成糠醛衍生物——5-羟甲基呋喃甲醛，此化合物再与蒽酮脱水缩合生成蓝色的化合物。该物质在620nm 处有最大吸收。糖含量在(10~100)g范围内，溶液颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。利用此反应与同样处理的已知葡萄糖含量标准溶液比色，通过标准对照法（直接比较法）即可计算出样品中糖原的含量。糖原在浓碱溶液中非常稳定，故在显色之前，肝组织先臵于浓碱中加热，以破坏其它成分，而保留肝糖原。

三、材料与方法：以流程图示意

1、材料：

（1）样品：鸡肝

（2）试剂：95%乙醇、5%（W/V）三氯乙酸、浓盐酸、12.5mol/L（50%）NaOH溶液、碘试剂、班氏试剂、5.35mol/L（30%）KOH溶液、标准葡萄糖液（50mg/L）、蒽酮显色剂

（3）仪器和器材：普通离心机、室温-100℃恒温水浴箱、可见光分光光度计、托盘天平、剪刀、镊子、研钵、试管架、离心管、试管、100mm*15mm试管、刻度吸量管（2ml、5ml）、1000μl微量可调取液器、100ml容量瓶、白瓷反应板

2、方法：

（1）肝糖原的提取与鉴定

（2）肝糖原定量测定

鸡肝约

+5%CCl 3CO 研磨

+5%CCl3CO 研磨成全部转入离心管中，上清液

离心5min

+2ml 95%乙醇，

沉上清液

白瓷板

糖原溶糖原水

+班氏沸

水浴

沉淀

沸

水

浴加碘试

加碘试

呈色

+浓

沸水浴

+50%NaO

糖原混

取鸡肝

+30%KOH 1.5ml

沸水浴

冷却，全部转入

加水至标线，仔细混

取3支试管，分别标记为

往空白管中加入蒸馏水

往三支试管中分别加入

沸水浴

在分光光度计620mm波长处，用空白管溶液

四、结果与讨论：①结果：实验数据、现象、图谱；②讨论：以结果为基础的逻辑推论，并得出结论。

1、结果：

（1）实验现象：

1）肝糖原的提取与鉴定

第一次离心后，肝匀浆分为2层，上层为上清液，不完全澄清，下层为淡褐色沉淀。

图1 肝匀浆 图2 肝匀浆第一次离心后

②加入乙醇混匀并静置后，溶液分层，上层为上清液，下层有白色絮状沉淀。 ③第二次离心后，溶液分为2层，上层为上清液，试管底部有少量白色沉淀。

图3 第二次离心后的白色沉淀 ④加入蒸馏水并沸水浴后，白色沉淀溶解。

⑤白瓷板上，糖原溶液加碘试剂后呈红棕色，与碘自身的黄色有明显区别。

图4 呈色对比结果（左为糖原溶液加碘试剂，右为碘试剂）

碘试剂2滴

碘试

⑥往糖原水解液中加入班氏试剂后，溶液呈蓝色（班氏试剂本身为蓝色）。沸水浴后，

溶液变为砖红色（生成砖红色沉淀）。

砖红图5 糖原水解液图6 沸水浴前图7 沸水浴后

2）肝糖原定量测定

①往鸡肝中加入KOH并沸水浴后，溶液变为红棕色。

图8 沸水浴后，溶液变为红棕色

②水浴前，空白管呈黄色，标准管呈绿色，样品管呈黄色（颜色比空白管浅）。水浴后，

空白管无明显变化，标准管颜色略变深，样品管由黄色变为深绿色（颜色比标准管深）。

图9 水浴前图10 水浴后（2）实验数据：

测定次数标准管样品管

1 0.593 0.401

2 0.59

3 0.397

3 0.59

4 0.396

平均值0.593 0.398 表1 标准管和样品管测得的吸光度（A620）及平均值按下式计算样品中肝糖原的含量：

肝糖原（g/100g肝组织）= A样品

* 0.05 *

100

*

100

* 1.11 A标准肝组织重（g）1000

由于样品稀释了一倍，因此计算结果需乘二。

结果：肝糖原的含量为4.966g/100g肝组织。

故本次实验结论为：该鸡肝样品含有肝组织，且肝糖原含量为4.966g/100g肝组织。2、讨论：

（1）实验数据分析：本次实验测得肝糖原含量为4.966g/100g肝组织。查书得饱食鸡肝肝糖原含量为2~3g/100g肝组织。本次实验结果偏大，说明肝组织中含有过多肝糖原，试验所用鸡肝为脂肪肝。

空白管标准管样品管空白管标准管样品管